www第九章原生质体培养

Plant Tissue Culture
第九章 原生质体的培养
目的要求：
(1)了解原生质体培养的意义；
(2)掌握原生质体分离的大致步骤；
(3)掌握原生质体培养的方法；
(4)掌握原生质体融合的方凑。
第一节 原生质体培养的意义
一、原生质体(protoplast) 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活 的植物细胞的最小单位。 自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以 来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。 大量试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有“全能 性”，可以经过离体培养得到再生植株。 1892年Klereker用机械方法分离得到了原生质体，但数量 少且易受损伤。1960年Cocking用酶解法从番茄幼苗的根分离 原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高 浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。直至1960年纤维素酶和离析 酶成为商品投入市场后，植物原生质体研究才成为一个热门的 领域。至今几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体。
二、原生质体培养的意义
(1)再生植株 由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞 生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践 中，都有一定的优点： ①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细 胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的 分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三 角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短 实验周期，如悬浮培养时仅需1~2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性， 连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研 究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计 的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
一、植物材料
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植物材料的预处理
对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率； 也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环 境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。把豌豆的 枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿 度条件下放1~2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续 分裂；在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶 片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再 去壁。经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也 解体；龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后分离得到的原 生质体才能分裂。在很多情况下材料不必经过专门的预处理。
二、酶
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渗透稳定剂
植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如 果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨 破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生 质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利 于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。 因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透 稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。的稳定 性。这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。
一、植物材料
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细胞悬浮培养物
在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。即取 用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无 菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2，4-D2~4mg／L的MS固体 培养基上，诱导愈伤组织，每隔2~4d转接一次。从中选出增殖 较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到 液体培养基的l00ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋 转式振荡器，速度控制在80~120r／min，在25土1℃下暗培养。 悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4~5ml悬 浮细胞转到250ml三角瓶的40ml新鲜培养中，以后每隔7d继代 一次。通常经悬浮培养3~4月后，悬浮培养细胞的大小变得较 为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。
三、原生质体的分离
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔 轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的 材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时 至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长 对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生 质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温 度在40~50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都 在25℃左右进行酶解。
一、植物材料
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叶肉细胞
叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄 壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶 片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适 宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良 好的培养材料，下列外界因素是考虑的重要因子： 光强为3000-6000Lx。 温度为20~25℃培养。 相对湿度在60％~80％左右。 植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体 和花粉壁细胞。
三、原生质体的分离
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将 去表皮的一面朝下放入酶液中。 去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻 轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条， 放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在 酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较 均匀的小细胞团时再进行酶解。
三、原生质体的分离
分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁 的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分 解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等 方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。 酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维 素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处 理一次即可得到分离的原生质体。 植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体， 一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。 每克材料用酶液10~30ml不等。 由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必 须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。
三、原生质体的分离
若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0．53％次 氯酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方。把4g叶 组织置于含有200ml不加蔗糖和琼脂的培养基500ml三角瓶中。 在4℃黑暗条件下培养16~24h，以后叶片转入含有纤维素酶、 果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5．6，通常在酶 液中使用的等渗剂为0．55~0．6mol甘露醇。然后，酶液真空 渗入叶片组织。在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培 养4h后，叶片组织可完全分离。
第二节 原生质体的分离
要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤 维素及木质素等构成的细胞壁。 在本世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞，愈伤组 织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离， 原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁 获得少量完整的原生质体。这种方法分离的原生质体太少，而 且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，开创了大量分离 原生质体的新技术，所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质 体。
二、酶
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酶的种类
ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉 同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维 素酶(包括C1、Cx、B-葡萄糖苷酶等)，果胶质，半纤维素酶 等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维 素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。 日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用 果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。 即二步法降解。
二、酶
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酶的种类
构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁 干重的2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的 53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。 插入细胞壁图
二、酶
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酶的种类
分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果 胶酶。 纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要 含有纤维素酶C1，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解 天然纤维素的作用，还含纤维素酶Cx，作用于定形的纤维素， 可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖 酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用 是降解纤维素，得到裸露的原生质体。 果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把 细胞从组织内分离出来。半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为 单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞 和四分体细胞。
三、原生质体的分离
若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞 液主要由单细胞和小细胞团组成。取悬浮细胞放人10ml的酶液 中(3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5．0~6．0)，在25-33℃条 件下酶解24h。原生质体-酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过 低速离心收集原生质体。
二、影响原生质体分离的因素
五、原生质体的净化和活力测定
在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成 分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物 的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。 以净化原生质体。 原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下： 1)将原生质体混合液经筛孔大小为40~100／tm的滤网过滤，以 除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。 2)将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬 浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。用吸管谨慎 地吸去上清液。 3)将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中(除不含酶外，其 他成分和酶液相同)，再次离心，去上清液，如此重复三次。 4)用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进 行培养。一般原生质体的培养密度为104~106／ml。
二、影响原生质体分离的因素
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渗透稳定剂的作用
在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其 活力的作用。糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁， 并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。 盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳 定，使某些酶有较大活性。但是易使原生质体形成假壁，同时 使分裂后细胞是分散的。