www第九章原生质体培养
Plant Tissue Culture
第九章 原生质体的培养
目的要求：
(1)了解原生质体培养的意义；
(2)掌握原生质体分离的大致步骤；
(3)掌握原生质体培养的方法；
(4)掌握原生质体融合的方凑。
第一节 原生质体培养的意义
一、原生质体(protoplast) 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活 的植物细胞的最小单位。 自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以 来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。 大量试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有“全能 性”，可以经过离体培养得到再生植株。 1892年Klereker用机械方法分离得到了原生质体，但数量 少且易受损伤。1960年Cocking用酶解法从番茄幼苗的根分离 原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高 浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。直至1960年纤维素酶和离析 酶成为商品投入市场后，植物原生质体研究才成为一个热门的 领域。至今几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体。
二、原生质体培养的意义
(1)再生植株 由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞 生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践 中，都有一定的优点： ①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细 胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的 分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三 角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短 实验周期，如悬浮培养时仅需1~2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性， 连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研 究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计 的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
一、植物材料
3
植物材料的预处理
对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率； 也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环 境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。把豌豆的 枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿 度条件下放1~2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续 分裂；在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶 片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再 去壁。经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也 解体；龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后分离得到的原 生质体才能分裂。在很多情况下材料不必经过专门的预处理。
二、酶
2
渗透稳定剂
植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如 果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨 破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生 质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利 于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。 因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透 稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。的稳定 性。这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。
一、植物材料
1
细胞悬浮培养物
在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。即取 用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无 菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2，4-D2~4mg／L的MS固体 培养基上，诱导愈伤组织，每隔2~4d转接一次。从中选出增殖 较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到 液体培养基的l00ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋 转式振荡器，速度控制在80~120r／min，在25土1℃下暗培养。 悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4~5ml悬 浮细胞转到250ml三角瓶的40ml新鲜培养中，以后每隔7d继代 一次。通常经悬浮培养3~4月后，悬浮培养细胞的大小变得较 为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。
三、原生质体的分离
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔 轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的 材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时 至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长 对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生 质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温 度在40~50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都 在25℃左右进行酶解。
一、植物材料
2
叶肉细胞
叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄 壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶 片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适 宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良 好的培养材料，下列外界因素是考虑的重要因子： 光强为3000-6000Lx。 温度为20~25℃培养。 相对湿度在60％~80％左右。 植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体 和花粉壁细胞。
三、原生质体的分离
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将 去表皮的一面朝下放入酶液中。 去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻 轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条， 放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在 酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较 均匀的小细胞团时再进行酶解。
三、原生质体的分离
分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁 的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分 解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等 方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。 酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维 素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处 理一次即可得到分离的原生质体。 植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体， 一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。 每克材料用酶液10~30ml不等。 由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必 须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。
三、原生质体的分离
若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0．53％次 氯酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方。把4g叶 组织置于含有200ml不加蔗糖和琼脂的培养基500ml三角瓶中。 在4℃黑暗条件下培养16~24h，以后叶片转入含有纤维素酶、 果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5．6，通常在酶 液中使用的等渗剂为0．55~0．6mol甘露醇。然后，酶液真空 渗入叶片组织。在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培 养4h后，叶片组织可完全分离。
第二节 原生质体的分离
要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤 维素及木质素等构成的细胞壁。 在本世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞，愈伤组 织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离， 原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁 获得少量完整的原生质体。这种方法分离的原生质体太少，而 且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，开创了大量分离 原生质体的新技术，所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质 体。
二、酶
1
酶的种类
ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉 同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维 素酶(包括C1、Cx、B-葡萄糖苷酶等)，果胶质，半纤维素酶 等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维 素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。 日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用 果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。 即二步法降解。
二、酶
1
酶的种类
构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁 干重的2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的 53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。 插入细胞壁图
二、酶
1
酶的种类
分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果 胶酶。 纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要 含有纤维素酶C1，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解 天然纤维素的作用，还含纤维素酶Cx，作用于定形的纤维素， 可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖 酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用 是降解纤维素，得到裸露的原生质体。 果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把 细胞从组织内分离出来。半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为 单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞 和四分体细胞。
三、原生质体的分离
若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞 液主要由单细胞和小细胞团组成。取悬浮细胞放人10ml的酶液 中(3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5．0~6．0)，在25-33℃条 件下酶解24h。原生质体-酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过 低速离心收集原生质体。
二、影响原生质体分离的因素
五、原生质体的净化和活力测定
在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成 分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物 的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。 以净化原生质体。 原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下： 1)将原生质体混合液经筛孔大小为40~100／tm的滤网过滤，以 除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。 2)将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬 浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。用吸管谨慎 地吸去上清液。 3)将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中(除不含酶外，其 他成分和酶液相同)，再次离心，去上清液，如此重复三次。 4)用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进 行培养。一般原生质体的培养密度为104~106／ml。
二、影响原生质体分离的因素
2
渗透稳定剂的作用
在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其 活力的作用。糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁， 并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。 盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳 定，使某些酶有较大活性。但是易使原生质体形成假壁，同时 使分裂后细胞是分散的。
第九章 原生质体的培养
目的要求：
(1)了解原生质体培养的意义；
(2)掌握原生质体分离的大致步骤；
(3)掌握原生质体培养的方法；
(4)掌握原生质体融合的方凑。
第一节 原生质体培养的意义
一、原生质体(protoplast) 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活 的植物细胞的最小单位。 自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以 来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。 大量试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有“全能 性”，可以经过离体培养得到再生植株。 1892年Klereker用机械方法分离得到了原生质体，但数量 少且易受损伤。1960年Cocking用酶解法从番茄幼苗的根分离 原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高 浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。直至1960年纤维素酶和离析 酶成为商品投入市场后，植物原生质体研究才成为一个热门的 领域。至今几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体。
二、原生质体培养的意义
(1)再生植株 由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞 生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践 中，都有一定的优点： ①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细 胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的 分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三 角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短 实验周期，如悬浮培养时仅需1~2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性， 连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研 究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计 的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
一、植物材料
3
植物材料的预处理
对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率； 也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环 境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。把豌豆的 枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿 度条件下放1~2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续 分裂；在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶 片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再 去壁。经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也 解体；龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后分离得到的原 生质体才能分裂。在很多情况下材料不必经过专门的预处理。
二、酶
2
渗透稳定剂
植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如 果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨 破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生 质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利 于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。 因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透 稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。的稳定 性。这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。
一、植物材料
1
细胞悬浮培养物
在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。即取 用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无 菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2，4-D2~4mg／L的MS固体 培养基上，诱导愈伤组织，每隔2~4d转接一次。从中选出增殖 较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到 液体培养基的l00ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋 转式振荡器，速度控制在80~120r／min，在25土1℃下暗培养。 悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4~5ml悬 浮细胞转到250ml三角瓶的40ml新鲜培养中，以后每隔7d继代 一次。通常经悬浮培养3~4月后，悬浮培养细胞的大小变得较 为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。
三、原生质体的分离
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔 轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的 材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时 至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长 对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生 质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温 度在40~50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都 在25℃左右进行酶解。
一、植物材料
2
叶肉细胞
叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄 壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶 片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适 宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良 好的培养材料，下列外界因素是考虑的重要因子： 光强为3000-6000Lx。 温度为20~25℃培养。 相对湿度在60％~80％左右。 植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体 和花粉壁细胞。
三、原生质体的分离
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将 去表皮的一面朝下放入酶液中。 去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻 轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条， 放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在 酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较 均匀的小细胞团时再进行酶解。
三、原生质体的分离
分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁 的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分 解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等 方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。 酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维 素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处 理一次即可得到分离的原生质体。 植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体， 一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。 每克材料用酶液10~30ml不等。 由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必 须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。
三、原生质体的分离
若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0．53％次 氯酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方。把4g叶 组织置于含有200ml不加蔗糖和琼脂的培养基500ml三角瓶中。 在4℃黑暗条件下培养16~24h，以后叶片转入含有纤维素酶、 果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5．6，通常在酶 液中使用的等渗剂为0．55~0．6mol甘露醇。然后，酶液真空 渗入叶片组织。在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培 养4h后，叶片组织可完全分离。
第二节 原生质体的分离
要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤 维素及木质素等构成的细胞壁。 在本世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞，愈伤组 织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离， 原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁 获得少量完整的原生质体。这种方法分离的原生质体太少，而 且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，开创了大量分离 原生质体的新技术，所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质 体。
二、酶
1
酶的种类
ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉 同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维 素酶(包括C1、Cx、B-葡萄糖苷酶等)，果胶质，半纤维素酶 等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维 素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。 日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用 果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。 即二步法降解。
二、酶
1
酶的种类
构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁 干重的2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的 53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。 插入细胞壁图
二、酶
1
酶的种类
分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果 胶酶。 纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要 含有纤维素酶C1，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解 天然纤维素的作用，还含纤维素酶Cx，作用于定形的纤维素， 可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖 酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用 是降解纤维素，得到裸露的原生质体。 果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把 细胞从组织内分离出来。半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为 单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞 和四分体细胞。
三、原生质体的分离
若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞 液主要由单细胞和小细胞团组成。取悬浮细胞放人10ml的酶液 中(3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5．0~6．0)，在25-33℃条 件下酶解24h。原生质体-酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过 低速离心收集原生质体。
二、影响原生质体分离的因素
五、原生质体的净化和活力测定
在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成 分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物 的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。 以净化原生质体。 原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下： 1)将原生质体混合液经筛孔大小为40~100／tm的滤网过滤，以 除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。 2)将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬 浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。用吸管谨慎 地吸去上清液。 3)将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中(除不含酶外，其 他成分和酶液相同)，再次离心，去上清液，如此重复三次。 4)用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进 行培养。一般原生质体的培养密度为104~106／ml。
二、影响原生质体分离的因素
2
渗透稳定剂的作用
在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其 活力的作用。糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁， 并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。 盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳 定，使某些酶有较大活性。但是易使原生质体形成假壁，同时 使分裂后细胞是分散的。
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第九章++植物原生质体培养
（五）复杂有机物
在原生质体培养中，常加入一些复杂有机物， 可以不同程度的提高再生细胞分裂频率，促进细胞 团的形成。 常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解 酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。
二、培养方法
原生质体培养一般采用液体培养的方法，因为： （一）液体浅层培养
（二）平板法培养
（三）悬滴法培养 （四）固液结合培养法
的压力。
（一）渗透压保护剂
（二应注意的问题
（一）渗透压保护剂
原生质体分离及培养过程中渗透压的调节通常 利用糖或糖醇来控制， 常用的渗压剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗 糖，其中甘露醇和山梨醇或其组合最常用。叶原生 质体分离时最常用的为甘露醇（浓度为 0.23~0.90M）。 有效的渗透浓度决定于原生质体分离期间叶细 胞的渗透压。内源细胞渗透压明显地受环境条件的 影响，并且能够用暗处理植株和幼叶组织等措施加 以控制。
三、酶处理
1、原生质体分离在很大程度上取决于所用酶的性质 和浓度 ，因此要做好酶种类、处理浓度的选择。 2、酶处理的适宜条件 （1）pH值 酶的活性与pH有关，用于分离原 生质体的大多数酶适宜的PH为4.7-6.0 。 （2）温度 对用来分离原生质体的酶类来说， 最适温度是40~50℃，但分离原生质体时以25~30℃ 为宜。 （3）光照 通常在黑暗或在低光强下分离原生 质体。
（二）应注意的问题
1、在酶处理液、原生质体清洗介质及原生质体 培养基中必须加入合适的渗透压保护剂。 2、原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中 稳定。较高水平的渗透压虽可阻止原生质体破裂， 但影响细胞的代谢、分裂和生长。 3、在分离原生质体时，可以使用电解质渗压剂， 但在原生质体培养时一般不用。 4、当用非电解质为渗压剂时，在酶液中加入某 些盐类，如Cacl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾，可以 提高质膜的稳定性。
植物原生质体培养与体细胞杂交
（二）渗透压
原生质体再生细胞壁之前，必须在培养过程中 提供适宜的渗透压保护。 1、在原生质体培养中，一般常用的渗压剂有甘露醇、 山梨醇、蔗糖、葡萄糖及麦芽糖等。 2、在原生质体培养中不宜使用电解质渗压剂。 3、原生质体再生细胞壁后应使培养基的渗透压逐步 降低。
（三）植物激素
1、不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要 求存在较大的差异。 2、生长素中常用的是2,4-D、NAA，在细胞分裂素 中最常用的是BAP、KT、2-IP。 3、在不同的生长发育阶段（起始分裂、细胞团形成、 愈伤组织形成与器官分化、胚状体发生与成苗）， 需要不断对培养基中激素的种类和浓度进行适时调 整。
降解相邻细胞间的果胶质， Macerozyme R-10 使细胞游离。
（2）酶解分离原生质体的方法
①两步分离法 这种分离方法是先用果胶酶离析植物组织，使
植物细胞从组织中分离出来，然后收集细胞经洗涤 后用纤维素酶解离细胞壁，最后获得原生质体。 ②一步分离法
即把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液， 对材料进行一次性处理，处理温度25~30℃，处理的 时间根据材料及酶浓度的不同而不同，可为2～24h。
二、培养方法 三、培养密度 四、培养条件
（一）基本培养基
1、所使用的培养基一般是改良的细胞培养基，并且 培养基的基础成分多采用B5或MS培养基的配方。如
KM8P和K8P培养基： 以B5培养基为基础
NT培养基：
以MS培养基为基础
2、不同植物常采用的培养基
禾本科植物： MS、N6、KM； 十字花科和豆科： B5、KM8P、K8P、KM； 茄科： MS、NT、K3
（四）氮源
许多研究指出，适当浓度的谷氨酰胺对原生质 体的细胞壁再生、细胞分裂和生长都有明显的作用。
第九章：原生质体培养与体细胞杂交
优点： 融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高； 愈伤组织 融合过程不受物种限制。
不定芽 缺点： 融合过程繁琐 根形成 PEG 可能对细胞有毒害。
50
诱导融合方法
（二）电融合法：利用改变电场来诱导原生
质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜 发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。
29
2、培养方法
30
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄 层，封口后进行培养。 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易 于添加新鲜培养基转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质 体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发 育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情 况。
19
1、原生质体的纯化方法
（3）梯度离心法：利用比重不同的溶液，经离心 后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间， 而细胞碎片等杂质则沉于管底。用这种方法可以 获得更为纯净的原生质体。
20
原生质体的纯化步骤
用300-400目不锈钢网过滤酶解材料,弃去残渣
600rpm, 5-10min
吸去上清 原生质体重悬于0.16mol/L CaCl2· 2H2O溶液中
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机理：
1、NaNO3诱导融合
原生质体表面带有负电荷(-10～-30mV)，同性 质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无法靠近到足 以融合的程度。 NaNO3中的钠离子能中和原生质体表面的负 电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进 细胞融合.
融合率 0.1%-4%。
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2、PEG（聚乙二醇）与高pH、 高Ca2+相结合诱导融合
PEG，能与水、蛋白质、糖等具有正极性基团的极 性物质形成氢键，在相邻原生质体表面间作为分子 桥，使原生质体发生粘连
第9章 植物原生质体培养和融合
5
第一节
原生质体的特性及其应用
3 原生质体的应用
（3）便于开展那些因细胞壁存在而难以进行研究的问 如质膜的表面特性、细胞壁再生与细胞骨架、 题，如质膜的表面特性、细胞壁再生与细胞骨架、离 子的吸收与转运（膜转运）、细胞周期、 ）、细胞周期 子的吸收与转运（膜转运）、细胞周期、气孔开关机 用保卫细胞原生质体可研究气孔开关）等等。 理（用保卫细胞原生质体可研究气孔开关）等等。 （4）原生质体的质膜经一定处理可以摄取外源遗传物 如细胞器、病毒、DNA等等 或发生内吞作用， 等等） 质（如细胞器、病毒、DNA等等）或发生内吞作用，是 遗传转化的理想受体系统。例如： PEG或电击处理造 遗传转化的理想受体系统。例如：经PEG或电击处理造 成质膜瞬间局部穿孔，可将外源DNA导入细胞。 DNA导入细胞 成质膜瞬间局部穿孔，可将外源DNA导入细胞。
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第二节
原生质体的游离
6，收集与纯化
酶解结束（判断的标准： 酶解结束（判断的标准：原来的植物材料已经 “溶化”，或通过显微镜观察确认大量原生质体 溶化” 的产生）后，小心操作进行收集和纯化。 小心操作进行收集和纯化。 的产生） 收集：采用一定孔径（250-320目 收集：采用一定孔径（250-320目）的筛网过滤酶 解物，50-80 g 离心 5-10 min。 min。 解物，50纯化：用原生质体洗液或培养基洗若干次（ 纯化：用原生质体洗液或培养基洗若干次（沉降 法），或（结合）用20－25％蔗糖漂浮纯化。 ），或 结合） 20－25％蔗糖漂浮纯化。
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第二节
原生质体的游离
5，酶解处理
提高游离效果的方法 将材料浸泡到酶液中以后， 将材料浸泡到酶液中以后，搅拌使材料表 面都被酶液所覆盖。 面都被酶液所覆盖。 移入可抽空气减压的器皿中进行减压处理， 移入可抽空气减压的器皿中进行减压处理， 使植物组织间隙中的气体排除；恢复气压后， 使植物组织间隙中的气体排除；恢复气压后， 原来的间隙吸入充满了酶液。 原来的间隙吸入充满了酶液。
第一节
原生质体的特性及其应用
3 原生质体的应用
（3）便于开展那些因细胞壁存在而难以进行研究的问 如质膜的表面特性、细胞壁再生与细胞骨架、 题，如质膜的表面特性、细胞壁再生与细胞骨架、离 子的吸收与转运（膜转运）、细胞周期、 ）、细胞周期 子的吸收与转运（膜转运）、细胞周期、气孔开关机 用保卫细胞原生质体可研究气孔开关）等等。 理（用保卫细胞原生质体可研究气孔开关）等等。 （4）原生质体的质膜经一定处理可以摄取外源遗传物 如细胞器、病毒、DNA等等 或发生内吞作用， 等等） 质（如细胞器、病毒、DNA等等）或发生内吞作用，是 遗传转化的理想受体系统。例如： PEG或电击处理造 遗传转化的理想受体系统。例如：经PEG或电击处理造 成质膜瞬间局部穿孔，可将外源DNA导入细胞。 DNA导入细胞 成质膜瞬间局部穿孔，可将外源DNA导入细胞。
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第二节
原生质体的游离
6，收集与纯化
酶解结束（判断的标准： 酶解结束（判断的标准：原来的植物材料已经 “溶化”，或通过显微镜观察确认大量原生质体 溶化” 的产生）后，小心操作进行收集和纯化。 小心操作进行收集和纯化。 的产生） 收集：采用一定孔径（250-320目 收集：采用一定孔径（250-320目）的筛网过滤酶 解物，50-80 g 离心 5-10 min。 min。 解物，50纯化：用原生质体洗液或培养基洗若干次（ 纯化：用原生质体洗液或培养基洗若干次（沉降 法），或（结合）用20－25％蔗糖漂浮纯化。 ），或 结合） 20－25％蔗糖漂浮纯化。
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第二节
原生质体的游离
5，酶解处理
提高游离效果的方法 将材料浸泡到酶液中以后， 将材料浸泡到酶液中以后，搅拌使材料表 面都被酶液所覆盖。 面都被酶液所覆盖。 移入可抽空气减压的器皿中进行减压处理， 移入可抽空气减压的器皿中进行减压处理， 使植物组织间隙中的气体排除；恢复气压后， 使植物组织间隙中的气体排除；恢复气压后， 原来的间隙吸入充满了酶液。 原来的间隙吸入充满了酶液。
第九章原生质体
(2)诱发融合(induced fusion)： 指应用某种诱变剂导致原生质体融合的方法。
(1)异核体或异核细胞：细胞质发生融合，但细胞核 未融合，两个核处在共同细胞质中，这种现象称 为异核体或异核细胞。 (2)杂种原生质体或合子细胞：双核异核体的细胞核 发生融合产生的杂种细胞称为杂种原生质体或合 子细胞。 (3)同核体：两个相同原生质体发生融合，则为同核 体。 (4)非对称杂种或细胞质杂种：异核体中的两个细胞 核，若亲缘关系太远，其中一个核的染色体逐个 被排除掉，这种细胞为非对称杂种。如果整个核 完全消失，细胞质仍为杂合，这种融合产物叫细 胞质杂种。
国内常用EA3-867酶 一种复合酶，其成分含纤维素酶、半纤维素 酶、果胶酶。EA3-867复合酶有害成分少， 优于日本R-10纤维素酶。 蜗牛酶和胼胝质酶 用于花粉母细胞和四分孢子的原生质体分离， 因为花粉细胞和四分孢子外有胼胝质壁， 用其他酶效果较差。
原生质体的 分离
•
分离的原 生质体
优点：酶解法可以获得大量的原生质体，而 且几乎所有植物或它们的器官、组织或细 胞均可用酶解法获得原生质体。
2．原生质体体培养的意义
1）单细胞无性系的建立：通过原生质体培养 可以产生单细胞无性系(monocell clone)， 而单细胞无性系为在细胞水平上进行突变 体的筛选、次生代谢物生产、人工种子 (artificial seed)生产、种质资源库的建立等 提供了非常理想的受体系统。
2）遗传转化的良好受体：原生质体无细胞壁， 易于摄取外源遗传物质、细胞器、微生物 等，为植物基因工程研究提供了理想的遗 传实验操作体系。
培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一 定影响。温度过高，原生质体被杀死或灼 伤；温度太低，培养基凝固迅速，原生质 体分散不均匀，影响细胞的追踪观察。
第九章原生质体培养及体细胞杂交
选用结构疏松并处于对数生长期的细胞 培养体系——叶肉组织细胞 选用生长旺盛，生命力强的组织作 为分离材料——人工气候箱中的烟 草花叶。
9.1.1.2 材料的预处理
（1 ）暗处理 （2） 预培养 （3） 预萎焉 （4） 预质壁分离
9.1.1.3分离方法
（1）机械分离法
优点： （1）能排除酶的有害影响； 缺点： （1）原生质体的产量低； （2）方法繁琐费力； （3）局限性大
9.2 原生质体培养
9.2.1培养基 原生质体培养基成分和培养细胞的培 养基成分相似 1. 无机盐（高浓度的钙离子有利；用有 机氮代替铵态氮） 2 渗透稳定剂（一定浓度的渗透稳定剂保 持原生质体稳定。如：葡萄糖 甘露聚唐 山梨醇 蔗糖 ）
有机成分（有利于细胞分裂如 km8p。不同的植物需要不同，需严 格控制） 4 植物生长物质（对细胞壁的生长， 细胞分裂启动，愈伤组织形成植物 再生都非常重要。如2，4D）
本章主要内容:
9.1 原生质体的分离与纯化 9.2 原生质体培养 9.3 体细胞杂交
原生质体（Protoplast）
含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、
具有生活力的裸露细胞。
第9章 原生质体培养 与和体细胞杂交
9.1、原生质体分离及纯化
9.1.1、原生质体分离
双子叶外植体
胚性细胞
9.1.1.1 材料选择
细胞工程学
之原生质体培养和体细胞杂交
西华师范大学生命科学学院 生物技术专业08级6班 田东 学号 200811440637
第9章 原生质体培养与 体细胞杂交
（云杉） （海藻酸钙凝胶
本章教学目的与要求
(1)了解原生质体培养的意义； (2)掌握原生质体分离的大致步骤； (3)掌握原生质体培养的方法； (4)掌握体细胞杂交融合的方法。
第9章 原生质体培养和体细胞杂交
原生质体培养的成果
1971，Nagata和Takebe从培养的烟草叶肉细 胞原生质体获得完整的再生植株 我国学者在50多种植物上首先获得原生质体 再生植株，并得到多种植物的细胞杂种 中科院植物所、遗传所、上海植物生理研究 所做出了重要贡献。
第一节 原生质体的分离
1、材料来源及预处理 双子叶植物的幼叶、子叶、根和下胚轴的 切段通常被用来制备原生质体 禾谷类植物，疏松易碎的愈伤或悬浮培养 的细胞是制备原生质体的理想材料 预处理目的：改变细胞和细胞壁的生理状 态，增加细胞膜的强度，提高酶解效率， 减少原生质体损伤。
第九章 原生质体培养和外的成分 原生质体研究的意义： 1、研究植物细胞壁的形成 2、实现细胞融合和细胞杂交 3、实现细胞对外源基因、DNA片段、细胞器、 染色体的捕获 原生质体为植物遗传工程研究提供了一个方便 的遗传操作实验系统
分离原生质体的方法
1、机械法 叶肉或其它细胞放在高渗的蔗糖溶液中，使细胞 发生质壁分离，原生质体收缩成球形，完全脱 离细胞壁。剪碎组织，可释放原生质体。 缺点：产量低，无法从分生组织分离原生质体。 2、酶法（在第一节详述） 1960，Cocking最先采用
原生质体制备
材料和酶液体积比：1：10 酶解时间因材料而异 酶解温度25～30℃ 黑暗或弱光下酶解 静置或摇床上酶解
原生质体活力检测方法
1、形态：来自叶肉细胞的活原生质体应该绿色，叶绿体 及细胞内小颗粒在不停运动；来自愈伤或悬浮细胞的 原生质体，可根据细胞质内原生质环流速度或颗粒状 内含物布朗运动快慢来判断。 2、染色：1％酚番红或伊文斯兰染色检测，活的原生质 体不着色，死的立即染色。 3、FDA（Fluorescein diacetate，荧光素双醋酸盐） 活体 染色：FDA能透过原生质体膜，在内酯酶作用下水解 为不能排出的，累积在质膜内的荧光素。在荧光显微 镜下观察时，凡发淡绿荧光的都是活的原生质体。
第9章植物原生质体培养和体细胞杂交技术
第9章植物原生质体培养和体细胞杂交技术第9章植物原生质体培养和体细胞杂交技术第1节原生质体培养技术植物原生质体特点：1）易于获得大量的遗传上同一的游离原生质体；2）保持着植物细胞的全能性；3）无壁的植物原生质体仍能进行植物细胞的各种生命活动。
4）可以被诱导与其他物种的原生质体融合；5）是植物遗传转化的理想受体；……1 原生质体的分离1.1 材料几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体.常用：叶片：大田；温室；人工气候室；试管苗等愈伤组织和悬浮培养的细胞胚性细胞不同来源的材料各有利弊。
保持材料的培养条件相对稳定十分重要。
1.2 材料的预处理方法有：低温处理、黑暗处理、预培养、预质壁分离、预萎蔫等。
1.3 常用酶的种类和酶液的配制不同种类、器官和细胞的壁的组成和结构不尽相同, 应选相应酶进行处理.(1) 酶制剂的种类常用：纤维素酶; 果胶酶; 离析酶; 崩溃酶; 半纤维素酶; 蜗牛酶; 等等。
使用原则：以用最少的酶制剂品种,最少的量（与酶活高低有关）,但能分离得到完整、健康的原生质体为准.(2）酶溶液的配制一般由不同的酶制品、渗透稳定剂以及稳定质膜的药品组成. 有还需加入少量缓冲剂或其它药品。
离心取上清液，微孔滤膜过滤除菌。
1.4 原生质体的制备(1) 一步酶处理法: 把一定量的酶(一般是纤维素酶和果胶酶)配制成混合酶溶液，对材料作一次性处理.（2) 两步酶处理法: 先用果胶酶降解中胶层获得单细胞, 再用纤维素酶降解细胞壁获得原生质体.材料处理时所用的酶浓度、温度、处理时间等应根据材料和实验的要求来定，最好作预实验.1.5 原生质体的收集和纯化细胞壁酶解↓尼龙网或不锈钢网过滤(网孔视原生质体的大小而异, 一般在300目左右) ↓用离心等方法收集.↓洗涤纯化原生质体（离心沉淀法；漂浮法；界面法；等等）1.6 原生质体活力测定测定原生质体的活力的常用方法：（1）形态特征观察（2）胞质环流等观察（3）活体染色[番红、荧光素双醋酸盐(FDA)等]（4）其他（呼吸、光合等）2. 原生质体的培养2.1 培养基和一般组织培养所用培养基的基本成分相似,主要区别有:(1)大量元素: 钙离子含量要提高; 常减少甚至不用铵态氮,提高硝态氮的浓度或用有机氮等.(2)有机成分: 一般有机物丰富的培养基有利于细胞分裂; 2,4-D促进原生质体的分裂,但不利于其分化.使用条件培养基往往效果较好.(3) 渗透势: 培养基一般适当高渗常用渗透调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。
原生质体培养与体细胞杂交
看护培养
在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的细胞壁。这时，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约24-36h后，原生质体开始发生第一次分裂；以后随着细胞分裂，原生质体就形成细胞团。
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但是，在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到1mm时，应将细胞团转移到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和植株再生。
第九章 原生质体培养与体细胞杂交
点击此处添加副标题
原生质体的获得 原生质体的培养 体细胞杂交
202X
原生质体的获得
点击此处添加副标题
原生质体的概念 原生质体的用途 原生质体的分离
202X
原生质体的概念
指植物细胞除去细胞壁以外的部分
植物原生质体是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研究方面具有独特的优势。
原生质体的分离 ——酶解法 注意事项 酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用.
原生质体的分离 ——酶解法 酶解就是将无菌材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。 有菌材料，则必须进行表面消毒处理。叶片、幼茎和根等材料要切成小片，叶片最好撕去下表皮。 悬浮细胞则要离心后再酶解。
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原生质体的培养方法
原生质体的培养方法
液体—固体结合培养 液体浅层—固体平板培养双层培养法：培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂。
第九章原生质体培养
另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解 壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐 溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作 渗透稳定剂的培养基中培养。 此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾， 它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使 RNA酶不活化，并使离子稳定。
四.植物材料的预处理 对原生质体材料进行预处理能提高原生 质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材 料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。 这些处理包括：暗处理、预培养、低温处 理等。
由于不同材料的生理特点不同，在研究游 离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞， 找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦悬浮细 胞的原生质体的酶液中须加入0．55mol／L甘 露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中 只加0.4~0.45mol／L的甘露醇，两者差别较 大。
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表 皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表 皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉 轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将 材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不 均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将 原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行 酶解。
2.酶溶液的pH值 酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影 响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH 值为5．0时， 原生质体产生得很快，但损坏较严 重，并且培养后大量破裂。当pH值提高到6．0时， 最初原生质体却产生少，但与pH值为5．0时处理 同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始 pH值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增 加，损伤的原生质体也少得多。
④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1~2个 小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补， 不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激 活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用 一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的 不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分 化条件等。