7-氨基头孢烷酸酶法生产的研究
头孢呋辛酸的合成研究
头孢呋辛酸的合成研究
曹卫凯
【期刊名称】《化工与医药工程》
【年(卷),期】2016(037)002
【摘要】从7-氨基头孢烷酸（7-ACA）出发合成头孢呋辛酸，同时对合成过程及关键点进行优化。
首先7-ACA在甲醇和水的混合溶剂中低温水解，生成的D．7-ACA，不经分离，直接进行7-位酰化反应，经结晶分离干燥后得到关键中间体DCCf去氨甲酰基头孢呋辛酸），收率可达84．8％。
后者经过与氯磺酸异氰酸酯（CSI）反应完成c-3位的氨甲酰化改造得到头孢呋辛酸的溶液，结晶分离干燥后，收率可达91．4％，合计收率达77．5％。
该工艺具有收率高、低成本、易操作
等特点，极具有工业化生产价值。
【总页数】4页(P35-38)
【作者】曹卫凯
【作者单位】西安万隆制药股份有限公司,西安710119
【正文语种】中文
【中图分类】TQ465
【相关文献】
1.头孢呋辛钠的合成研究 [J], 曹卫凯
2.头孢呋辛酸的合成研究 [J], 曹卫凯
3.头孢呋辛酯的合成研究 [J], 曹卫凯
4.扁桃酸的拆分和手性扁桃酸的合成研究进展 [J], 邵恒;甘永平;张文魁;黄辉;叶张军
5.δ-硫羟酸癸内酯及相关硫羟酸内酯的合成研究 [J], 周治国;金其璋;何锡敏
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一步酶法制备药物中间体7-氨基头孢烷酸
一步酶法制备药物中间体7-氨基头孢烷酸赵玉新;户巧芬;刘治林【摘要】目的主要介绍一步酶法制备7-ACA较两步酶法的优势,重点探讨一步酶法制备7-ACA的酶解条件、纯化技术、结晶工艺.方法 7-ACA一步酶法和两步酶法的优势对比分析,酶的选择、一步酶法酶解反应条件、裂解液纯化技术、裂解液结晶技术的筛选.结果确定了酶解条件一反应温度20～25℃、PH8.5、时间60min,烷烃类萃取纯化条件、结晶条件.结论该方法制备的7-ACA质量好,收率高.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2010(035)006【总页数】4页(P435-438)【关键词】7-氨基头孢烷酸(7-ACA);头孢菌素C;一步酶法;酶解条件;纯化技术;结晶工艺【作者】赵玉新;户巧芬;刘治林【作者单位】哈药集团制药总厂科研开发中心,哈尔滨,150046;哈药集团制药总厂科研开发中心,哈尔滨,150046;哈药集团制药总厂科研开发中心,哈尔滨,150046【正文语种】中文【中图分类】R978.1酶法制备7-ACA生产技术由于具备安全、环保和低成本优势，在当前国内应用十分广泛，而该技术中主要在产业化应用的是两步酶法技术，即通过D-氨基酸氧化酶、GL-7ACA酰化酶两步酶法实现酶法7-ACA的工业化制备，但存在酶解路线长、氧化条件控制难度大、设备条件高的缺点。
本文主要研究一步酶法的控制参数，并优化出最佳技术条件，见表1。
1 仪器与材料1.1 仪器与试药BIOTECH-2M生物酶反应器 (上海保兴生物设备工程有限公司)；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；氨水(工业级)、EDTA-2Na(试剂) 、结晶助剂等。
1.2 酶的选择及活力检测方法1.2.1 酶的选择经过查阅国内外文献资料[1-3]及大量的试验筛选，采用头孢菌素C酰基转移酶(NRB-103)可以直接把CPC转换为7-ACA，不必进行GL-7-ACA转换的中间过程，反应效率相当于化学法，而且能得到质量良好7-ACA。
酶法合成7-ACA及头孢菌素类抗生素的研究进展
史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：/item.htm?id=9176907081 酶法合成7-ACA及头孢菌素类抗生素的研究进展芮菊1张体磊2山东鲁抗医药股份有限公司，山东济宁272100摘要头孢菌素类抗生素在制药工业中占据重要的地位，相关产品的酶法合成备受关注；酶法合成β-内酰胺类抗生素显著提高了合成效率，减少了三废排放。
综述了近年来酶法合成7-氨基头孢烷酸（7-ACA）、头孢唑林、头孢氨苄、头孢拉定的合成方法。
关键词头孢菌素；酶法合成；7-ACAProgress in enzymatic synthesis of 7-ACA and cephalosporinsRui Ju1Zhang Ti-Lei 2Abstract Cephalosporins antibiotics played an important role in pharmaceutical industry. Enzymaticsynthesis β-lactam antibiotics could decline the generation of waste and the cost of production remarkably. This review focuses on the recent progresses of enzymatic semi-synthesis of 7-ACA、c efazolin、cefalexin and cefradine. Keywords cephalosporin; enzymatic synthesis; 7-ACA酶法合成技术始于20 世纪60 年代末70 年代初, 经过30 多年的发展,目前酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展, 配套技术日益完善, 具备了大规模工业化生产的条件, 全球著名的ß-内酰胺抗生素生产厂家如荷兰DSM 公司已有酶法合成的商品头孢氨苄、阿莫西林等产品面世。
GL_7_ACA酰化酶研究进展
一、前言头孢菌素类抗生素是一族β－内酰胺类广谱抗生素，通过干扰细菌细胞壁的合成并加速细胞壁的破坏而起到杀菌的作用，是以天然头孢菌素Ｃ作为原料，经裂解和侧链改造而得到的，具有抗菌谱广、抗菌活性高、疗效好、耐酸、耐碱、耐β－内酰胺酶、低致敏、不良反应小等特点，已经成为目前全世界最为畅销的抗感染药物之一［１］。
７－氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ）是生产头孢菌素的关键性中间体，化学名称为：７－氨基－３－乙酰氧甲基－８－酮－５－硫杂－１－氮杂二环［４，２０］辛－２－烯－２－羧酸。
生产７－ＡＣＡ的方法主要有：化学合成法，一步酶法和两步酶法。
其中化学法存在着工艺复杂、成本高以及污染严重等问题，正逐渐被酶法所取代。
一步酶法是利用头孢菌素Ｃ酰化酶直接催化ＣＰＣ，脱去７－位的Ｄ－α－氨基己二酰侧链，生成７－ＡＣＡ［２］。
虽然该法步骤简单，但目前已发现的ＣＰＣ酰化酶活力都十分低，远不能满足工业催化的需要。
而两步酶法是利用两个不同来源的酶分别进行催化，首先，ＣＰＣ在Ｄ－氨基酸氧化酶（ＤＡＡＯ）的作用下，产生一个具酮基的中间体ＫＡ－７－ＡＣＡ，这个中间体较不稳定，很容易被同时产生的Ｈ２Ｏ２化学氧化脱羧，转变成戊二酰基－７－氨基头孢烷酸（ＧＬ－７－ＡＣＡ）；然后在ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶的作用下脱去其侧链，生成７－ＡＣＡ［３］［４］。
二、ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶概述１．ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶分类及性质目前文献中报道的绝大多数产ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶的微生物都是假单胞菌，李勇等人按蛋白质结构的不同对其进行了分类，同一类的酰化酶具有相似的性质，对应的基因序列有较高的同源性［５］。
第Ⅰ种酶最引人注目的特点是在很宽的ｐＨ值范围内（ｐＨ６．５－９．０）对ＧＬ－７－ＡＣＡ都有很高的水解活力；这一特点在工业生产中十分有利，因为在ＧＬ－７－ＡＣＡ水解过程中生成戊二酸，反应液的ｐＨ值变化很大。
第Ⅱ种酶最显著的特点是具有γ－谷氨酰转肽酶（ＧＧＴ）活力，其氨基酸序列与大肠杆菌和假单胞菌的ＧＧＴ具有３０％以上的同源性。
第十二章-头孢菌素类抗生素生产工艺 第二节 头孢菌素类药物及7-氨基头孢烷酸的生产工艺
4）“三废”处理
该工艺主要副产物是有机硅化合物、D-α-氨基己二酸
正丁酯、HCl气体以及过量的二氯甲烷、甲醇、正丁醇 和有机胺等。
对于有机硅化合物，其主要包含六甲基二硅醚和三甲 基硅醇，可进行回收再利用。
D-α-氨基己二酸是一类非常有用的氨基酸，可作为合
成头孢类抗生素的原料，并广泛应用于医药化工等行业。
18
二、7-氨基头孢烷酸的生产工艺 2. 化学裂解工艺 3）工艺条件及影响因素
由于三甲基硅基易水解，故酯化反应应在无水的条件 下进行，使用无水头孢菌素C钠盐可显著提高反应收率。 氯化反应放热剧烈，故二苯甲胺和五氯化磷需缓慢加 入，并控制温度不超过-25 ℃，可以减少杂质的产生。
19
二、7-氨基头孢烷酸的生产工艺
7-ACA中含有不稳定的β-内酰胺结构和活性伯氨基，
稳定性较差，不宜长期保存。此外，由于β-内酰胺
环张力较大，反应中易发生酰胺键断裂而开环，并 进一步形成高分子聚合物，故在以其为原料制备头 孢菌素类药物时，应注意随时监控产物品质，防止 裂解杂质混入。
13
二、7-氨基头孢烷酸的生产工艺
2. 化学裂解工艺
活性低
4
★ 头孢噻肟（Cefotaxime）的生产工艺
AE活性 酯
5
★ 头孢丙烯（Cefprozil）的生产工艺
邓氏钾 盐
6
1. 化学酰化法 2）3-位取代的合成工艺路线
对于3-位取代的头孢菌素类药物，通常是以含 氮或硫的亲核试剂，如吡啶、吡咯、杂环硫醇等取 代7-ACA3-位的乙酰氧基。
7
★ 头孢曲松（Ceftriaxone）的生产工艺
第十二章 头孢菌素类抗生素生产工艺
第一节 概述
针对头孢西丁合成的研究
针对头孢西丁合成的研究头孢西丁是临床医疗中一种重要的半合成抗生素，其属于第二代抗生素类型。
这种药物的稳定性比较高，所以在临床中有着广泛的应用，而且有着较大的市场潜力。
本文对头孢西丁的合成方法进行了研究，在药物生产的过程中，主要有三种合成方式，一种是以7-ACA为原料，一种是以7-MAC为原料，还有一种是以去乙酰7-ACA为原料对头孢西丁進行合成。
笔者对这三种合成方法的优缺点进行了介绍，还对这三种合成方法进行了评价，通过比较发现，采用7-ACA 为原料制成的头孢西丁，具有较多的优势，其不断合成工艺简单，而且成本较低，原料易取得，而且生产的效率也比较高，适合大量生产。
标签：头孢西丁合成研究7-ACA一前言头孢西丁是一种头霉类半合成抗生素，其化学结构与头孢霉素有着较大的相似性，而抗菌活性与第二代头孢菌素一致，头孢西丁属于第二代抗生素。
其化学结构可以降低水解破坏力，而且可以降低细菌的耐药性。
头孢西丁药效的发挥主要是靠抑制细菌细胞壁合成达到的，可以杀死β细菌，在药效发挥的过程中，还可以产生β-内酰胺酶，其具有较高的抵抗性，对厌氧菌有着极强的杀灭的作用，可以达到抗菌谱均衡的效果。
通过研究发现，头孢菌素的细菌耐药性在不断上升，为了解决这一问题，必须对头孢西丁的合成进行研究，挖掘其市场潜力，使研究成果发挥最大的效用价值。
本文对头孢西丁的合成进行了研究，以供参考。
二合成方法头孢西丁有着多种不同的合成方法，本文对这些合成的方法进行了研究，通过对比的方式，可以选择出最佳的合成方式，在对比的过程中，需要考虑合成工艺路线操作的简便性、经济性以及收率、产率等因素。
头孢西丁的合成方法主要有3种，分别是7-ACA原料、7-MAC原料以及去乙酰7-ACA原料的合成方法。
下面笔者对这三种合成方法各自的优缺点进行简单的介绍，以供参考。
1、7-ACA为原料的合成方法7-ACA是7-氨基头孢烷酸的缩写，这种合成方法主要采用了羟基保护的原理，将氨基以特殊的方式进行保护，然后在将该原料与CH3SCL反应，在反应需要在强碱的条件下进行，在C7位引入CH3S，经过希夫碱水解后，在与酰氯进行反应，并引入噻吩去乙酰基，CH3S基与甲醇反应后，会转化为CH3O基。
酶法制备7-氨基-3-乙烯基头孢烷酸
Ｔａ ｊ Ｐ ａｍａｙ ０ ０年 ｉｎ ｎ ｈｒ ｃ ２ １ 工 业
酶 法制 备 ７一氨基 一 ３一乙烯 基 头孢 烷 酸
叶俊杰 ， 冯 昱， 李玉 荃
３０ ９ ） ０ １３
（ 天津 市医药集 团技 术发 展有 限公 司 ， 天津 摘
要 目的 ： ７一苯乙酰胺 基 一３一乙烯 基头 孢烷 酸在 固定 化青 霉 素酰化 酶 ＩＡ一７ ０催 化下 裂解 制备 ７一氨 用 Ｐ ５
７一氨 基 一 ３一乙烯 基 头 孢 烷 酸 （ ７一Ａ Ｃ 是 合 色谱仪 （ ｔｓ １ Ｖ Ａ） Ｗａ ｒ５ ５一双 波 长检 测 器 日本 岛津 公 司 ） ｅ ， 成 第三代 头 孢 菌 素 头 孢 地 尼 和 头 孢 克 肟 的 重要 中间 红外光谱仪 （ Ｅ一 ８ Ｇ天津市拓谱仪器有限公司） Ｐ ９３ ， Ｂｕｅ Ａ ４０瑞 士布鲁 克公 司 ） 。 体 。 目前 ， 制备 ７一Ａ Ｃ Ｖ Ａ的合 成方 法 主要 为 化学 法 和 核 磁共 振仪 （ ｒｋｒ Ｃ一 ０ 生 物酶 法 。化 学法 如胡 树 琛 … 和 Ｋ ｍ ｙｍ ， ｕａ ａ２ ａ ｅａ ａ Ｙ ｔ ＿ ２ 实验 机 理 ｋ Ｊ 报 道的 ３一头 孢烯 化 合 物 的 制 备 方 法 ， 应 条 件 比较 反 生成 ， 响产 品质 量 。柳 杏 辉 等 所 报 道 的应 用 青 霉 影 素酰化 酶 制 备 ７一Ａ Ｃ 摒 弃 了 一 些 有 机 试 剂 的应 Ｄ Ａ， 用 ， 应条件 温 和 。本 文 鉴 于 酶 法符 合 绿 色化 工 的优 反 点 ， 用青霉 素酰 化酶裂 解 ７一位苯 乙酰胺 基 制备 ７一 采
（ ｉ ｊ ｈｒ ａｅｔ ａ ＧｏｐＴ ｃｎｌ ｙＤ ｖｌ ｍ ｎ Ｃ ｔ． ｉ ｊ ０ １３ Ｔａ ｉ Ｐ ａｍ ｃｕ ｃｌ ｒｕ ｅｈｏ ｇ ｅｅ ｐ ｅｔ ｏＬｄ Ｔａ ｉ ３０ ９ ） ｎｎ ｉ ｏ ｏ ｎｎ
不同底物浓度下一步酶法制备7-ACA含量及转化率的动态变化
・ ４ ９・
பைடு நூலகம்
不 同底物浓度下一步酶法制备 ７ 一 Ａｃ Ａ 含量 及转化率 的动态变化
方 起 鹏
摘 势， 在 国 内应 用十分广泛 ， 其 中两步酶 法存在 酶解路 线长、 氧化条件控 制难度大、 设备条件 高的缺点 因此 ， 本 文主要 对一步酶（ 头孢菌素 ｃ酰基转移酶 ） 法进行 了 研 究， 不 同底物浓度 经酰化酶 裂解 ， ７ － Ａ Ｃ Ａ平均含量 达到 ９ ２ ． ９ ５ ％， 平均转化率达到 ６ ２ ． ９ ７ ％ 。 关键词 ： ７ 一氨基 头孢烷酸 ； 头孢 菌素 ｃ酰基转移酶 ； 头孢 菌素 Ｃ（ ＣＰ Ｃ）
表１ 头 孢菌素 类抗 生素是 一族 Ｂ一内酰胺类 光谱 抗 生素， 通过干 扰细菌细胞壁 的合成并加速细胞 壁的破 坏 而起 到杀菌作用 ， 具有抗 菌谱 广 、 抗 菌活性强 、 疗效 高、 毒性低等优点 ， 近年来使用越来越广泛。 ７ 一氨基头 孢 烷酸 （ ７ 一 ＡＣ Ａ） 是合 成许 多半 合成 头孢菌 素类抗 生 素 的重要 中间体 ， 是 当今 国际抗 生素市场 的主要 角色 ㈣ 目前 ，国 内工业 生产 中多采 用化 学法裂 解得 到 ７ － ＡＣ Ａ，由于化 学裂解法使用大 量危险 的化 学材料 ， ７ － Ａ Ｃ Ａ含量及转化率 的动态变化 ， 同时测试 了一步酶 的最大 反应条件苛 刻 ， 污染严 重等原 因， 用酶法取代化 学法 已成为 ７ － Ａ Ｃ Ａ 反应 ， 实验结果如表 １ 。 生产 的必然 趋势［ ３ ， ４ １ 。产业 化生产 中主要应用 的是两步酶法技术 ， 即 反应能力 ， 由表 １ 及实验分析 ， 当Ｃ Ｐ Ｃ溶液效 价为 ２ ７ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍ Ｌ时 ， 共进行 通过 Ｄ 一氨基酸 氧化酶 、 Ｇ Ｌ 一 ７ ＡＣ Ａ酰化 酶两步酶 法实现酶 法 ７ 一 Ａ — ２ １ 批 试验 ， 反应 时间从 ６ ０ — １ ２ ０ ｍ ｉ ｎ ， 平均 含量 达到 ９ ３ ． ２ ２ ％， 平均转 Ｃ Ａ的工业化制备 ，但 该方 法存 在酶解路线长 、氧化条件控制难度 １ ２ ． ５ ０ ％；此后将 Ｃ Ｐ Ｃ溶液效 价降为 ２ ６ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍ Ｌ ，共进行 大、 设备 条件 高的缺点嘲 。近几年来 ， 国内外逐渐发展起利用头孢菌 化率达到 ６ ０ ４ 批 反应 ， 反应 时间从 ６ ０ — １ ２ ０ ｍ ｉ ｎ ， 平均 含量 达到 ９ ４ ． ０ ２ ％， 平均转 素 Ｃ酰基转移酶进行裂解反应生产 ７ － Ａ Ｃ Ａ的技术 ，该技术克服 了 １ ３ ． ３ ０ ％； 将Ｃ Ｐ Ｃ溶液效 价 降为 １ ８ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍ Ｌ ， 共进行 ６ ２批 化学法和两步酶法 的缺点 。本文主要对一步酶法进行 了研究 ， 考察 化率 达到 ６ 反应时 间从 ８ ０ — １ ２ ０ ｍｉ ｎ ， 平均含量达到 ９ ２ ． ８ ８ ％， 平均转化率达 了不 同底物浓度 ， 即头孢菌 素 Ｃ效价从 ２ ７ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍＬ 一 １ ３ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍ Ｌ经酰 反应 ， 化酶裂解 ， ７ － Ａ Ｃ Ａ含量及转化 率的动态变化 ， 得 出结论 其平均含量 到 ６ ２ ． ８ ８ ％； 将Ｃ Ｐ Ｃ溶液效价降为 １ ４ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍ Ｌ ， 共进行 ５ ６批 反应 ， 反 应 时 间从 ９ ０ — １ ２ ０ ｍ ｉ ｎ ，平 均 含 量达 到 ９ １ ． ６ ７ ％，平 均 转化 率 达 到 达到 ９ ２ ． ９ ５ ％， 平 均转化率达到 ６ ２ ． ９ ７ ％。 １ 实 验 部分 ６ ３ ． １ ８ ％。 实验 中， 反应制备 的 ７ － Ａ Ｃ Ａ酰化液 Ｄ Ｃ 、 Ｄ Ｏ、 Ｃ Ｐ Ｃ残留效价 达到工艺控制标准 。此实验同时测试 了一步酶的反应能力达到 ３ ４ ３ １ ． １主要仪器 为大规模生产提供了理论基础 。 ｐ Ｈ控制器 、 转速及温度控制器 （ 上海保兴生物设备工程有 限公 批 ， ３结 论 ’ 司） ， 蠕动泵 （ 保定 兰格恒流泵有 限公 司） ， 酰化反应罐（ 自制 ） 。 在适当的实验条件下 ， 一 步酶法生产 ７ － Ａ Ｃ Ａ， 反应控制难度小 ， １ ． ２ 试药 与原料 达到 ３ ０ ０ 批 以上 ， 得到 ７ － Ａ Ｃ Ａ含量 高 ， 平 均含量达 到 氨水 （ 分 析纯 ） ， Ｃ Ｐ Ｃ浓缩液 （ 哈药 总厂 １ ０ ９车 间 ） ， 头孢 菌素 Ｃ 反应批次 多 ， ９ ２ ． ９ ５ ％， 反应转化率高 ， 平均转化率达 到 ６ ２ ． ９ ７ ％。采用头孢 菌素 ｃ 酰基转移酶 。 酰基转移 酶同时兼具化学法 的优 势（ 高效率 和纯度 ） 及 两步酶法 的 １ ． ３实验 步骤 优势 （ 高经济性 和环境保护 ） ， 工艺简单易行 ， 是 国内外 大规模生产 １ ． ３ ． １ Ｃ Ｐ Ｃ溶 液的配制 的发展趋势。 测取 Ｃ Ｐ Ｃ浓缩 液效 价 ，加入 去离 子水 ，依 次 配制 成效价 为 参 考 文 献 ２ ７ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍＬ 、 １ ７ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍ Ｌ 、 １ ３ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍＬ的料 液 ， 溶配体积 为 ５ ０ ０ ｍＬ 。用 ［ １ ］Ｍｏ ｒ ｉ ｎ Ｒ Ｂ ，Ｊ ａ ｃ ｋ ｓ ｏ ｎ Ｂ Ｇ ，Ｆ ｌ ｙ ｎ ｎ Ｅ Ｈ，ｅ ｔ ａ １ ．Ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ｏ ｆ ３ ｍｏ ｌ ／ Ｌ的氨水调节稀释液的 ｐ Ｈ为 ７ ． ５ 。 ｃ ｅ ｐ ｈ ａ ｌ ｏ ｓ ｐ ｏ ｒ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｉ ｏ ｔ ｉ ｃ ｓ ＸＩ Ｖ：ｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ｅ ｐ ｈ ａ ｌ ｏ ｓ ｐ ｏ ｒ ｉ ｎ Ｃ ｗ ｉ ｔ ｈ ｎ ｉ — １ ． ３ ． ２ Ｃ Ｐ Ｃ转 化为 ７ － Ａ Ｃ Ａ 向装有船用 式叶轮搅拌器 、 自动 ｐ Ｈ控制器 、 进料及 出料 １ ： ３ 、 底 ｔ ｒ ｏ ｓ ｙ ｌ ｃ ｈ ｌ ｏ ｒ ｉ ｄ ｅ［ Ｊ ］ ． Ａ ｍ Ｃ ｈ ｅ ｍ Ｓ ｏ ｃ ，１ ９ ６ ９ ， ９ １ ：１ ３ ９ ６ － １ ４ ０ ０ 部装有规格为 ｌ Ｏ ０ ７ ｍ筛 网的套层玻璃反应器 中， 用漏斗加入头孢菌 ［ ２ ］Ｐ ａ ｒ ｍａ ｒ Ａ ，Ｋ ｕ ｍａ ｒ Ｈ，Ｍａ ｒ ｗ ａ ｈ ａ Ｓ Ｓ ，ｅ ｔ ａ １ ．Ｒ ｅ ｃ ｅ ｎ ｔ ｔ ｒ ｅ ｎ ｄ ｓ ｉ ｎ ｎ ｚ ｙ ｍｓ ｔ ｉ ｃ ｃ ｏ ｎ ｖｅ ￣ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ｅ ｐ ｈａ ｌ ｏ ｓ ｐｏ ｒ ｉ ｎ Ｃ ｔ ｏ ７一 ａｍｉ ｎ０ ｃ ｅ ｐｈ ａ １ ０ ｓ ｐｏ ｒ ａ ｎｉ ｃ 素 Ｃ酰基转移 酶 ， 用去离 子水 １ ０ ０ ０ ｍＬ反复 冲洗 ３次 （ 因从 冷藏室 ｅ 取 出的酶表 面有保护缓 冲液 ， 冲洗后 释放活性 ） 后， 将水抽干 。将配 ａ ｃ ｉ ｄ （ ７ 一 Ａ Ｃ Ａ ）【 Ｊ ］ ．Ｃ ｒ ｉ ｔ Ｒ ｅ ｖ Ｂ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ， １ ９ ９ ８ ， １ ８ （ １ ） ： １ － １ ２ ３ ］ 刘福强， 李盛华． 酶 法转化 头孢菌素 Ｃ成 为 ７ 一 氨基 头孢烷酸 的研 置好 的 Ｃ Ｐ Ｃ溶液加入反应罐 ， 控制 搅拌速度为 ５ ０ ０ ｒ ｐ ｒ ｒ ｄ ｍ ｉ ｎ ， 控制温 ［ Ｊ ］ ． 山东食品发酵 ２ ０ ０ ９ ， １ （ 总第 １ ５ ２期） ． 度为 ２ ０ ￣ Ｃ， 通过 ｐ Ｈ控制器加入 ３ ｍｏ ｌ ／ Ｌ的氨水 ， 控制 ｐ Ｈ为 ８ ． ３ 。通 究进展［ ［ ４ ］ 杨利敏， 王亚明， 张松， 钟 莉， 邹文杰． 药物 中间体 ７ 一 氨基 头孢 烷酸的 过紫外高效液相色谱分析 ， 反应终点控制在 Ｃ Ｐ Ｃ残 留小于 ２ ％。 制备『 Ｊ ］ ． 天津药学 ２ ０ ０ ５ ， １ ２ ， １ ７ ， ６ ． ２结果 与 讨 论 ５ ］ 赵 玉新， 户巧芬， 刘治林． 一步酶法制备 药物 中间体 氨基 头孢 烷 实验考察 了 Ｃ Ｐ Ｃ溶 液 效 价 分 别 为 ２ ７ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍＬ 、 ２ ６ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍＬ 、 ［ Ｊ ］ ．哈 药集 团制药 总厂 科研 开发 中心 中 国抗 生素杂志 ， ２ ０ １ ０ ， ６ １ ８ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍＬ 、 １ ４ ０ ０ ０ ｕ ／ ｍＬ时 ， 经一步酶（ 头孢 菌素 Ｃ酰基转移酶 ） 裂解 酸 ［
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
7-氨基头孢烷酸酶法生产的研究
D-氨基酸氧化酶（D-Amino Acid Oxidase，DAAO）和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶（Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase，GLA）是两步酶法制备7-氨基头孢烷酸的重要工业用酶，头孢菌素C（Cephalosporin C，CPC）经DAAO催化氧化脱羧反应生成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸（GL-7-ACA），再在GLA 作用下，水解生成7-氨基头孢烷酸（7-ACA）。
本学位论文围绕两酶法生产7-ACA 进行了以下方面的研究。
1．以携带6个组氨酸（6*His）的DAAO（HDAAO）编码序列构建三株整合型巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）基因工程菌。
在三磷酸甘油醛脱氢酶启动子（GAP）控制下胞内表达HDAAO的MMZY03，以及醇氧化酶启动子（Alcohol Oxidase，AOX1）启动子控制下分泌表达菌株MMZY02和胞内表达菌株MMZY01。
诱导型重组菌株发酵培养基选用基本盐培养基，组成型重组菌株发酵培养基选用YPD培养基。
三种重组菌株在5L自控罐的发酵实验显示，MMZY03发酵13h的产酶达到7293 U/L。
而据报道的AOX1控制下表达量达到最高需要43h。
然而不论是AOX1的诱导分泌型表达（MMZY01），还是GAP启动子的组成型分泌表达（MMWY01）产酶活力均不高，并不能满足实际应用的需要。
2．组成型胞内表达HDAAO的重组
P.pastoris MMZY03发酵后收获的含DAAO细胞经过压榨破壁，无细胞提取液经二价金属螯合亲和层析纯化，进一步以Amberzyme<sup>TM</sup>环氧版树脂为载体，制得的HDAAO固定化酶活力为75U/g（湿载体）。
该固定化酶连续用于CPC的酶促转化反应14批次，HDAAO的表观活力并无明显下降。
因此，所构建的组成型胞内表达HDAAO的重组P.pastorisMMZY03以及HDAAO固定化酶制备工艺具有潜在的产业化应用前景。
3．D-氨基酸氧化酶属
于黄素蛋白酶。
增加酶反应系统的内部气压或通入纯氧气来提高反应液中的溶解氧浓度将有助于提高DAAO催化效率。
据报道，在氧气缺乏的环境下，来源于透明颤菌的血红蛋白（VHb）能提高异源宿主细胞的生长量。
红酵母来源（Rodotorula gracilis）的DAAO与VHb融合表达，融合蛋白制备的固定化酶提高了对CPC的转化效率。
我们推测在体外VHb能起到氧载体作用。
本工作分别构建了表达VHb，三角酵母DAAO和VHb融合表达的蛋白。
分别添加1.0 mg游离态VHb或300 mg固定化VHb，固定化D-氨基酸氧化酶催化头孢菌素C的比活力与对照相比分别提高了3倍和2倍。
将三角酵母DAAO和VHb融合表达，制备的固定化酶活力要高于没有融合的DAAO。
4．在GL-7-ACA酰化酶的一步纯化并固定化的研究中，构建了酰化酶N
端组氨酸标签位置和长度均不等的四种重组质粒，即pET28GA01，pET28GA02，pET24GA01，pET24GA02。
这些重组质粒在E.coli BL21（DE3），宿主细胞中发酵表达，证明BL21（DE3）/pET28GA01的发酵单位最高，达到3800 U/L。
BL21（DE3）/pET28GA02发酵单位是2184 U/L。
BL21（DE3）/pET24GA01和BL21（DE3）/pET24GA02发酵单位分别是2092U/L和754U/L。
经对固定化载体的优选确定以FP-IDA-Ni<sup>2+</sup>树脂分别对等量的4种GLA进行一步纯化，固定化结果表明固定化酶表观活力在66.7到80 U/g之间，差别不大，其中以28GA01催化剂转化反应21批次，7-ACA转化收率约是90％，未发现GLA活力下降。
本学位论文研究初步结果为D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶在两步酶法
制备7-ACA中实际应用提供了基本数据。