卵母细胞的成熟培养
卵母细胞体外成熟的影响因素
卵母细胞体外成熟的影响因素乔利敏1,2 黄成定2 李向臣1 姚雅馨2 关伟军13 马月辉1(1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100094 2甘肃农业大学动物科技学院兰州730070) 【摘要】随着哺乳动物体外受精、细胞核移植技术的不断深入,人们对成熟卵母细胞以及哺乳动物胚胎需求量日益增加,卵巢内丰富的卵泡资源是胚胎工程迅速发展的基础。
本文从卵巢因素、供体、体外培养条件和成熟培养液中添加成分等对卵母细胞IVM的影响进行了分析,为胚胎的体外生产提供理论基础和科研依据。
关键词:卵母细胞;体外成熟;影响因素 胚胎移植技术成熟与否是胚胎工程技术成败的基础,而卵母细胞体外成熟质量又是决定胚胎移植技术成功的关键。
IVM可以为体细胞核移植提供大量的受体细胞,也为体外受精提供大量的MⅡ期卵母细胞,因此IVM已经成为胚胎体外生产和体外受精的重要环节之一。
虽然近几年来在卵母细胞的体外成熟方面已经取得了飞速发展,但是卵母细胞的体外成熟还存在很多问题。
现就卵母细胞体外成熟的影响因素进行概述。
1 卵巢因素和供体对卵母细胞体外成熟的影响1.1 卵巢所处性周期的影响有学者研究表明,卵巢所处性周期阶段影响卵母细胞的成熟培养,在无黄体期卵巢上的卵母细胞比黄体期和黄体前期卵巢上卵母细胞成熟效果要好。
崔亚利等〔1〕根据卵巢上是否有明显突出卵巢表面的黄体,将卵巢分为黄体期和卵泡期,分别在两期卵巢上卵泡中抽取卵母细胞进行体外成熟培养发现,二者无统计学差异,但是卵泡期卵母细胞成熟培养效果(63.9%)较好,说明卵巢性周期阶段对卵母细胞体外成熟存在一定影响,但影响不大。
2000年郭继彤〔2〕对繁殖季节和非繁殖季节山羊卵母细胞进行研究发现,非繁殖季节可采集到比繁殖季节更多的可用卵母细胞,并且非繁殖季节的屠宰山羊卵巢卵母细胞成熟培养效果(74.1%)优于繁殖季节的屠宰山羊卵巢卵母细胞(67.7%)。
在非繁殖季节屠宰的山羊,几乎没有大卵泡的发生。
年龄、成熟方式及培养液对小鼠卵母细胞体外成熟和人工活化的影响
生长在 Ｍｌ ６培养液 的 比率 （２９ ） Ｐ＜ ． １． 果表 明 昆明 白小 鼠卵母 细胞 的体 外成 ２ ．％ （ ００ ） 结
熟不 受年龄 影 响 ， 体外 成熟的 卵母 细胞人 工活化后 支持 发 育的能 力比体 内成熟 的差 ， Ｔ ＨＦ
培养 液更适合 小鼠 卵母 细胞人 工活化后 的进一 步发育．
明 白 小 鼠 卵母 细胞 体 外 成 熟 和 人 工 活 化 的 影 响 ． ． １ ５月 龄 、 月龄 、 细胞其体 外成熟 率无差异 （ ０ ０ ） 经人 工 活化后 ， 体 内成熟 的 Ｐ＞ ． ５ ． 与
卵母 细胞 相 比， 外成 熟的卵母 细胞 发 育到 原核期 胚 和 ２ 细胞 期 胚 的 比率都 明显 降低 ； 体 一 体 外成 熟的 生长在 Ｈ Ｆ培 养液 的卵母细胞 发育到 ２ 细胞 期胚 的 比率 （４ ４ ） Ｔ 一 ４ ． ％ 显著 高于
胞在 促卵泡激 素和促黄 体激素 的作用下 向成熟 卵 子转 化的过程 ‘ 长足 的 卵 母细胞 在 体外 培 养条 。 ．
件下 可不依赖激 素 而 自发 成熟 ， 卵母 细 胞 体外 成熟 为研究 卵母细胞 的体 内成熟 机制提供 了理想
的结构 和生 化模 型 ， 且 可以 为核 移植 及基 因操 而
对 ７ ．％ ～ ２４ （ 表 １ ． ７４ ８ ．％ 见 ）
胞直 接用 于体 外 成 熟 ． Ｖ 期 卵母 细 胞 分 别 取 自 Ｇ 注射 Ｐ Ｓ Ｍ Ｃ和未注射 Ｐ Ｓ Ｍ Ｇ的小 鼠．
ＭＩ期 卵母 细 胞 的 收集 ： 只 雌 鼠腹 腔 注 射 Ｉ 每
７ ５Ｉ ． Ｕ的 Ｐ Ｇ，８ｈ后注 射 ５ Ｉ 的人绒 毛膜 促 ＭＳ ４ Ｕ 性腺激 素 （ Ｃ 宁波激 素制 品厂 ） 行超 数排 卵 ， ｈ Ｇ， 进 ｌ ５～１ ６ｈ后 断颈处 死 小 鼠 ， 从输 卵管 壶 腹膨 大部
山羊卵母细胞的显微受精及其培养
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2005,13():*基金项目：国家高科技研究与发展计划(863)项目(2001No.A A213081)资助。
赵晓娥：女，1968年生，博士研究生。
E-mail:<Zhxiao@>.**通讯作者。
Author for correspondence.E-mail:<Zhxiao@>.收稿日期：2004-05-31接受日期:2004-09-01·研究论文·山羊卵母细胞的显微受精及胚胎培养*赵晓娥鲁进刘凤军王勇胜武浩李裕强张涌**(西北农林科技大学生物工程研究所，陕西杨凌712100)摘要：采用胞质内精子注射(ICSI)构建山羊显微受精胚，在两种培养液(CR1、SOF)与颗粒细胞共培养条件下，分别添加不同浓度的牛卵泡液(BFF)和胎牛血清(FBS),研究其对山羊卵母细胞显微受精胚体外发育的影响。
结果表明：1.在CR1培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10%BFF的ICSI胚的囊胚发育率最高(22.2%)，显著高于添加5%(13.1%)和15%(2.7%)组。
2.在SOF培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10%BFF的ICSI胚的囊胚发育率(25.1%)显著高于添加5%(12.9%)和15%(3.0%)组。
3.在两种培养液中，分别添加10%BFF和10%FBS，ICSI胚的囊胚率分别为22.6%和26.9,5.8%和6.1％。
说明:1.CR1和SOF两种培养液都适宜山羊的ICSI胚体外培养；2.在早期胚胎培养中,添加10%BFF可显著提高ICSI胚的囊胚发育率。
3.添加10%BFF比添加10%FBS对提高早期胚胎培养质量更为有效。
关键词:卵母细胞；精子；细胞质内精子注射；牛卵泡液；胎牛血清；囊胚发育率；山羊Goat Oocytes Fertilization by Intracytoplasmic Sperm Injection and CultureZHAO Xiao-E LU Jin LIU Feng-Jun WANG Yong-Sheng WU Hao LI Yu-Qiang ZHANG Yong** ()The in vitro development of goat embryos,that obtained by fertilize oocytes using intracytoplasmic sperm injection(IC-SI),were investigated.The results showed that the blastocyst rate was significantly higher when the embryos co-cultured with granular cells(GCs)in media CR1supplement with10%bovine follicular fluid(BFF)(22.2%)than that in5%BFF(13.1%)and15%BFF (2.7%).When embryos co-cultured with GCs in media SOF,the highest blastocyst rate was obtained from supplement with10%BFF (25.1%),which was significantly different from5%BFF group(12.9%)and15%BFF group(3.0%).Adding10%BFF and10%fetus bovine serum(FBS)into media CR1and SOF respectively,the goat ICSI blastocyst rates were22.6%，26.9%and5.8%，6.1％.It was concluded that,both CR1and SOF could be used as goat ICSI embryos In Vitro culture;10%BFF could significantly increase theblastocyst rate;BFF was more efficient than FBS for the early development In Vitro of goat ICSIembryos.Oocyte;Sperm;intracytoplasmic sperm injection;fetus bovine serum;bovine follicular fluid;Blastocyst rate;Goat胞质内精子注射(interacytoplasmic sperm injec-tion,ICSI)是一项辅助的体外受精技术,它是借助显微操作仪将精子注入卵母细胞质内,从而完成受精的过程。
猪卵母细胞体外成熟技术研究进展
安徽农业科学。ｏｒａ ｏ Ａ ｈｉ ｍ ． ｃ．０６ ３ （１ ：５６ ５８ ５６ Ｊｕｎｌ ｆ ｎｕ Ａ ｉ Ｓｉ ０ ，４ ２ ）５５ —５５ ，５０ ２
责任 编辑
孙红忠
责任校对
孙 红忠
猪 卵母 细 胞体 外成 熟技 术研 究 进展
项智锋， 李艳， 清华 （南 技 院 物 学 院河 新 ４０） 王 河 科 学 动 科 学 ，南 乡 ５０ ３ ３
摘要 猪 卵母 细胞体 外成熟 （ ） ⅣＭ 为猪胚胎 的体 外 生产及 相关胚胎 工程技 术如 胚胎 细胞和 体 细胞核 移植 、 转基 因和性 别控 制提供 了廉 价原料 ， 是现代 胚胎 工程技 术 的研 究热点之 一。 多年 来科研 人 员为 了进 一步提 高卵母 细胞体 外培养 成熟率 以及 更深入 地 了解 卵母 细胞 成 熟机 制 ， 对影响 卵母 细胞体 外成熟的 因素进 行 了大量的研 究。综述 了影 响猪 卵母 细胞体 外成 熟的相关 因素。 关键词 体外成 熟； 卵母 细胞 ； 胚胎 工程 中图分 类号 ￥ １． ８４６ 文 献标识码 Ａ 文章编号 ０１ — ６１２０）１ ５５ — ３ ５７ ６１（０６２ — ５６ ０
５ 卵母细胞 采集方法
卯母细胞的采集方法有抽吸法和切剖法。在从离体卵
巢 上 采集 卵母细 胞 时 ， 因采集 方法 不 同 ， 得 卵母 细胞 体外 所
近几年 的研 究发现 ， 经产母猪 卵母细胞 在成熟 率及胚 胎 发育能力方面 明显 优于 青 年母 猪＿ 。处 于不 同的发 育 阶段 ｌ Ｊ
１ 猪的品种
存温度及贮存 时间影 响卵母 细胞 的体外成 熟。Ｗａｅ 和 ｌｒ ｔ
Ｇａ ｓ ｒ ｅ研究 了不 同保存 温 度 （、６２ 、 ｙ ５１、５３ ０和 ３ ） 不 同贮 ７ｑ 及 ｃ 存时 间（，、 、 ２６ １ １ ２ 对猪 卵母 细胞 体外成熟 的影 响 ， ０ ４和 ６ ） ｈ 发 现不 管 采用 哪种 温度 ， 随着贮存 时间 的延长 ， 细 胞 的成 卵母
影响哺乳动物卵母细胞体外成熟的主要因素
６ ３ 气 相 条 件 ． 体外培养 一般采 用含 ５ ｃ 的宅气 ， ５ ＋５ ％Ｃａ 或 ％（ ％
Ｏ ＋９ ％Ｎ ２ ０ ２的气体 。培养 系统 内 Ｃ ２很关键 ， Ｏ 它是培养基
缓冲体系维持正常 ｐ Ｈ所 必 需 的 ， 以平 衡 培 养 基 ， 可 且有 助 于 细 胞 代 调 中 的 丙 酮 酸 转 换 成 草 酰 乙 酸 ， 于细 胞 成 熟 ｝ 利
猪 ４ ～４ 。 ２ ８ｈ
的 体 外 受精 结 果 优 于 小 卵 泡 （ ＜２ｍｍ） 。 卵
３ 采卵季 节及卵细胞 供体 的具体 情 况
３ １ 采 卵 季 节 ．
卵巢 卵 母 细胞 的成 熟潜 力与 采 卵 的 季 节密 切相 关 ， 般 一 认 为 在动 物 繁 殖 季 节 或 气 候 适 宜 的 季 节 获 取 的 卵 泡 卵母 细
甚 为 耍 ｜ ｎ 等研究牛体外成熟表 明，５ 一９ ￣ｚ ｅ ３ 一３ Ｖ之间的温 度 对 牛 卵母 细胞 体 外 成 熟 无 甚 影 响 ， 随 后 的体 外 受精 则 是 但
依 赖 温 度 的 。对 于 湿 度 的 调 ： 一般 需在 Ｃ ２ 养 箱 内 放 置 ， Ｏ 培 调湿盘 ， 以维 持 ９ ％ － ０ ％ 的 相 对 湿 度 ， 而 维 持 培 养 基 ９ － ０ １ 进
维普资讯
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５ ８・
《 上海 畜牧 兽 医通讯 》 ２ ０ ０ ６年 第 ６期
影 响 哺 乳 动 物 卵母 细 胞 体 外 成 熟 的 主要 因素
师如 意 张拴林 （山西农 业大学 动物科 技学 院 …西 太 谷
卵母 细胞 体 外 成 熟 圮 养 技 术 是 哺 乳 动 物 体 外 受 精 披 术 的重 要 环 节 之 一， 应 用促 性腺 激 素 和 类 同醇 激 素 在 体 外 模 是 拟 卵泡 的 环 境 ， 而诱 发 卵母 细 胞 成 熟 的 一 项 生 物 技 术 土 进
211287355_ＧＰＲ５０_在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位
ｄｏｉ:１０ １１９２０/ｘｎｍｄｚｋ ２０２３ ０３ ００２ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位王㊀甜１ꎬ黄显朋１ꎬ朱洪阳１ꎬ吉文汇１ꎬ２ꎬ付㊀伟１ꎬ２ꎬ殷㊀实１ꎬ２ꎬ兰道亮１ꎬ２(１.西南民族大学畜牧兽医学院ꎬ四川成都㊀６１００４１ꎻ２.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室ꎬ四川成都㊀６１００４１)摘㊀要:旨在探究ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达规律及亚细胞定位.通过卵母细胞体外培养技术㊁ｑＰＣＲ技术及免疫荧光技术测定ＧＰＲ５０在小鼠不同时期卵母细胞的转录水平及亚细胞定位.结果表明ꎬ所建立的ｑＰＣＲ方法敏感性高㊁特异性强㊁重复性好且检测效率高ꎬ可用于测定ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞中转录水平的表达ꎻＧＰＲ５０在不同阶段小鼠卵母细胞中均有表达ꎬ生发泡破裂(ＧＶＢＤ)后ꎬＧＰＲ５０的表达量显著高于ＧＶ期(Ｐ<０.０５)ꎻ随着卵母细胞的发育ꎬ其表达量不断增高ꎬ到ＭＩＩ期达到顶峰ꎬ极显著高于ＧＶ㊁ＧＶＢＤ及ＭＩ期(Ｐ<０.０１).随着卵母细胞的发育ꎬＧＰＲ５０大量表达于细胞质和细胞膜ꎬ但在成熟卵母细胞中ꎬＧＰＲ５０主要集中分布于细胞膜.以上结果说明ꎬＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟中发挥重要的作用ꎬ为解析ＧＰＲ５０在哺乳动物卵母细胞体外成熟进程的分子机制奠定了基础.关键词:ＧＰＲ５０ꎻ小鼠卵母细胞ꎻ体外成熟ꎻ转录水平表达ꎻ亚细胞定位中图分类号:Ｑ２６㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:２０９５￣４２７１(２０２３)０３￣０２４５￣１０收稿日期:２０２３￣０１￣０４通信作者:兰道亮(１９８４－)ꎬ男ꎬ教授ꎬ博士ꎬ研究方向:动物遗传育种与繁殖及胚胎工程.Ｅ－ｍａｉｌ:ｌａｎｄａｏｌｉａｎｇ＠１６３.ｃｏｍ基金项目:国家重点研发计划(２０２１ＹＦＤ１６００２００)ꎻ国家自然科学基金－面上项目(３１８７２３６１)ꎻ西南民族大学研究生创新型科研项目(ＣＸ２０２１ＳＺ５８)ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｄｕｒｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓＷＡＮＧＴｉａｎ１ꎬＨＵＡＮＧＸｉａｎ￣ｐｅｎｇ１ꎬＺＨＵＨｏｎｇ￣ｙａｎｇ１ꎬＪＩＷｅｎ￣ｈｕｉ１ꎬ２ꎬＦＵＷｅｉ１ꎬ２ꎬＹＩＮＳｈｉ１ꎬ２ꎬＬＡＮＤａｏ￣ｌｉａｎｇ１ꎬ２(１.ＳｃｈｏｏｌｏｆＡｎｉｍａｌ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｏｕｔｈｗｅｓｔＭｉｎｚｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＣｈｅｎｇｄｕ６１００４１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＱｉｎｇｈａｉ￣ＴｉｂｅｔＰｌａｔｅａｕＡｎｉｍａｌＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎꎬＳｏｕｔｈｗｅｓｔＭｉｎｚｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＣｈｅｎｇｄｕ６１００４１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎａｎｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｉｎｔｈｅｉｎｖｉｔｒｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎ(ＩＶＭ)ｏｆｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓꎬｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌａｎｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｉｎｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒ￣ｍｉｎｅｄｂｙｉｎｖｉｔｒｏｏｏｃｙｔｅｃｕｌｔｕｒｅꎬｑＰＣＲａｎｄｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｑＰＣＲｍｅｔｈ￣ｏｄｈａｄｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎬｓｔｒｏｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙꎬｇｏｏｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｈｉｇｈｄｅｔｅｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙꎬｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓ.ＧＰＲ５０ｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓ.Ａｆｔｅｒｇｅｒｍｉｎａｌｖｅｓｉｃｌｅｂｒｅａｋｄｏｗｎ(ＧＶＢＤ)ꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎＧＶｓｔａｇｅ(Ｐ<０.０５).ＷｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｏｏｃｙｔｅｓꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙꎬａｎｄｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｐｅａｋｉｎＭＩＩｓｔａｇｅꎬｗｈｉｃｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎＧＶꎬＧＶＢＤａｎｄＭＩｓｔａｇｅｓ(Ｐ<０.０１).ＷｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｏｏｃｙｔｅｓꎬＧＰＲ５０ｗａｓａｂｕｎｄａｎｔｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅꎬｂｕｔｉｎｍａｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓꎬＧＰＲ５０ｗａｓｍａｉｎｌｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｉｎｔｈｅｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ.ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＧＰＲ５０ｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅＩＶＭｏｆｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓꎬｗｈｉｃｈｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＧＰＲ５０ｉｎｔｈｅＩＶＭｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｏｏｃｙｔｅｓ.西南民族大学学报(自然科学版)第４９卷Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＧＰＲ５０ꎻｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅꎻｉｎｖｉｔｒｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎꎻｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ㊀㊀Ｇ蛋白偶联受体(ＧＰＣＲｓ)ꎬ也称为７次跨越蛋白(７ＴＭ)ꎬ是最丰富的细胞膜受体之一ꎬ具有约８００个成员.ＧＰＣＲ不仅能与同聚体互作ꎬ也能与异聚体相互作用[１]ꎬ介导了机体内８０％的跨膜信号转导.迄今为止ꎬ大约１００个ＧＰＣＲｓ未鉴定出其内源配体ꎬ被称为孤儿ＧＰＣＲ.Ｇ蛋白偶联受体５０(ＧＰＲ５０)作为一种孤儿ＧＰＣＲꎬ被证明与褪黑素(ｍｅｌａｔｏｎｉｎꎬＭＴ)受体ＭＴ１和ＭＴ２具有高度同源性[２]ꎬ因此也被称为褪黑素相关受体.虽然不与褪黑素结合ꎬ但ＧＰＲ５０可与ＭＴ１及ＭＴ２形成异二聚体ꎬ并通过影响ＭＴ１介导的相关信号通路而发挥作用[３].ＧＰＲ５０受体具有七个疏水段和一个亲水性羧基尾ꎬ其显著特征是氨基末端和额外的细胞环中没有Ｎ－连接的糖基化共有位点ꎬ同时具有一个含有三个多态性位点的Ｃ端长链.ＧＰＲ５０被证实在小鼠和兔等动物的多个器官和组织中表达ꎬ尤其在脑和生殖器官中表达量较高[４].ＧＰＲ５０参与糖皮质激素受体(ＧＲ)信号通路㊁瘦素(ｌｅｐｔｉｎ)信号通路㊁ＮＯＧＯ－Ａ及ＲｈｏＡ/ＲＯＣＫ信号通路等多条通路ꎬ其生理功能受到广泛关注.据报道ꎬＧＰＲ５０与双相情感障碍㊁脂质代谢㊁产热㊁脂肪生成和神经元发育有关[５]ꎬ也被认为是抑郁症等精神疾病治疗的重要靶点[６].在最新的研究中ꎬＹ.Ｃｈｅｎ[７]等人发现ＧＰＲ５０具有促进牦牛卵母细胞成熟的潜在作用ꎬ但ＧＰＲ５０是否在哺乳动物卵母细胞成熟发挥作用还有待证明.哺乳动物卵母细胞的成熟涉及多个细胞事件ꎬ包括生发泡破裂(ＧＶＢＤ)㊁染色体凝聚㊁纺锤体的形成和迁移[８].据报道ꎬ参与卵母细胞成熟的分子通路主要有Ｃａ２＋信号通路[９]㊁ＭＡＰＫ信号通路[１０]㊁Ｓｉｒｔ１－Ｎｒｆ２－ＣｙｃｌｉｎＢ１信号通路[１１]㊁ＳＵＭＯ通路[１２]等ꎬ解析哺乳动物卵母细胞成熟的分子机制成为近年来研究的热点.为研究ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟过程中的分子机制ꎬ利用ｑＰＣＲ及免疫荧光技术研究ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞发育过程中的动态表达规律及亚细胞定位ꎬ为研究ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟中的作用奠定基础ꎬ同时也为丰富哺乳动物卵母细胞成熟的分子机制提供依据.１㊀材料与方法１.１㊀材料本试验所用小鼠(Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ)均为６~８周龄无特定病原体(ＳＰＦ)级别的ＩＣＲ小鼠ꎬ购自成都达硕实验动物有限公司.所用牦牛卵巢由成都青白江屠宰场提供ꎬ兔卵巢和鸡卵巢由西南民族大学畜牧兽医学院兰道亮课题组提供.１.２㊀方法１.２.１㊀小鼠卵母细胞的收集与培养经腹腔注射１０ＩＵ孕马血清促性腺激素(ＰＭＳＧ)４４~４８ｈ后ꎬ用脱臼法处死小鼠并取卵巢置于３７ħ预热的㊁含１％青链霉素的磷酸盐缓冲液(ＰＢＳ)中.在体式显微镜下用１ｍＬ注射器扎破卵泡ꎬ使小鼠卵巢内容物流出.收集生发泡(ＧＶ)时期卵母细胞ꎬ将其置于预热２ｈ的成熟培养液中进行培养.成熟培养液用培养用油覆盖ꎬ其配方为:Ｍ２培养液㊁１０ＩＵ/ｍＬ促卵泡激素(ＦＳＨ)㊁１０ＩＵ/ｍＬ黄体生成素(ＬＨ)㊁２０μｇ/ｍＬ雌二醇(Ｅ２)㊁１０％胎牛血清(ＦＢＳ)㊁１％双抗.分别在培养０㊁４㊁８㊁１４ｈ收集ＧＶ㊁ＧＶＢＤ㊁第一次减数分裂(ＭＩ)及第二次减数分裂(ＭＩＩ)期卵母细胞.裸卵清洗后直接用于后续实验或保存至－８０ħꎬ卵丘－卵母细胞复合物置于０.２％的透明质酸酶中于３７ħ消化３~５ｍｉｎꎬ除去颗粒细胞后用于后续实验或保存至－８０ħ.１.２.２㊀引物的设计和合成在ＧｅｎＢａｎｋ下载小鼠(Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ)的ＧＰＲ５０(ＮＭ＿０１０３４０.２)㊁ＧＡＰＤＨ(ＮＭ＿００８０８４.３)基因序列ꎬ用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５设计引物ꎬ引物序列如表１所示.６对引物均由上海生工生物工程有限公司合成.１.２.３㊀总ＲＮＡ的提取㊁反转录和ＰＣＲ使用ＯｍｅｇａＥ.Ｚ.Ｎ.Ａ ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅＴｏｔａｌＲＮＡＫｉｔ提取各时期小鼠卵母细胞的总ＲＮＡꎬ再利用Ｅｘｏｎ￣ＳｃｒｉｐｔＲＴＳｕｐｅｒＭｉｘｗｉｔｈｄｓＤＮａｓｅ进行反转录ꎬ体系为ＴｏｔａｌＲＮＡ１３μＬ㊁５ˑＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ∗４４μＬ㊁ＳｕｐｒｅｍｅＥｎｚｙｍｅＭｉｘ３μＬꎬ反应程序为２５ħ１０ｍｉｎꎬ５５ħ１５ｍｉｎꎬ８５ħ５ｍｉｎ.普通ＰＣＲ体系为２ˑＴａｑＡｄｖａｎｃｅｄ６４２第３期王甜ꎬ等:ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位㊀ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１２.５μＬ㊁ＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ０.５μＬ㊁Ｒｅ￣ｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ０.５μＬ㊁ｄｄＨ２Ｏ９.５μＬ㊁ｃＤＮＡ２ｕＬꎬ反应程序为９４ħ３ｍｉｎꎬ９４ħ３０ｓꎬ６０ħ３０ｓ㊁７０ħ３０ｓ/ｋｂ(２５~３５ｃｙｃｌｅｓ)ꎬ７０ħ５ｍｉｎ.表１㊀引物序列信息Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ基因序号引物名称引物序列(５ᶄң３ᶄ)产物长度/ｂｐＧＰＲ５０１２３４ＧＰＲ５０－Ｆ５ᶄ－ＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＧＧＴＡＧＣＣＣ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｒ５ᶄ－ＴＡＴＧＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＧＴＴＴＴＣ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｆ５ᶄ－ＣＣＡＣＣＡＣＴＧＴＴＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｒ５ᶄ－ＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＴＣ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｆ５ᶄ－ＣＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＴＣＴＡ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｒ５ᶄ－ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＡＣ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｆ５ᶄ－ＧＧＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＴＣＣ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｒ５ᶄ－ＴＴＧＣＣＡＧＡＡＴＴＴＣＧＧＡＧＣＴＴＣ－３ᶄ４１６３０９５１５１８８ＧＡＰＤＨ１２ＧＡＰＤＨ－Ｆ５ᶄ－ＡＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣ－３ᶄＧＡＰＤＨ－Ｒ５ᶄ－ＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡ－３ᶄＧＡＰＤＨ－Ｆ５ᶄ－ＣＣＣＣＣＡＡＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴ－３ᶄＧＡＰＤＨ－Ｒ５ᶄ－ＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＴＡＣＴＣ－３ᶄ５２９３１５１.２.４㊀ｑＰＣＲ体系的建立及优化ｑＰＣＲ的初始反应体系为２ˑＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘＵＤＧ１０μＬ㊁１０μＭＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ０.４μＬ㊁１０μＭＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ０.４μＬ㊁ｃＤＮＡ２μＬ㊁ＰＣＲ－ｇｒａｄｅＷａｔｅｒ７.２μＬꎬ反应程序为５０ħ２ｍｉｎ㊁９４ħ１０ｍｉｎ㊁９５ħ３ｍｉｎ㊁９５ħ５ｓ㊁６０ħ３０ｓ(４０ｃｙ￣ｃｌｅｓ).用不同的引物进行普通ＰＣＲꎬ选出最佳的引物ꎻ以最佳引物为基础ꎬ在不同引物浓度(０.１㊁０.２㊁０.３㊁０.４㊁０.５μＭ)进行ｑＰＣＲꎬ找到最佳的引物浓度ꎬ以此优化所建立的ｑＰＣＲ反应体系和程序.１.２.５㊀标准曲线的绘制以小鼠ＧＶ期卵母细胞的ｃＤＮＡ为模板ꎬ将其以１０倍比稀释并用１００~１０－４５个浓度以１.２.４得到的方法进行ｑＰＣＲ.记录各个浓度的Ｃｔ值ꎬ以ｃＤＮＡ浓度为横坐标ꎬＣｔ值为纵坐标ꎬ绘制标准曲线ꎬ分析模板浓度与Ｃｔ值的线性关系.１.２.６㊀敏感性的测定以ＧＶ期卵母细胞的ｃＤＮＡ为模板ꎬ将１００~１０－５６个浓度的ｃＤＮＡ分别进行ｑＰＣＲ和普通ＰＣＲ.比较两种方法的最低检测稀释度ꎬ以评估所建立方法的敏感性.１.２.７㊀特异性的测定分别提取ＧＶ期小鼠㊁牦牛㊁鸡及兔卵母细胞ＲＮＡꎬ反转录后进行ｑＰＣＲ检测各样本的ＧＰＲ５０表达情况ꎬ以评估该方法的特异性.１.２.８㊀重复性的测定以３组ＧＶ期小鼠卵母细胞的ｃＤＮＡ为模板进行ｑＰＣＲꎬ分别进行３次组内重复和组间重复ꎬ记录样品对应的Ｃｔ值.组内重复性是指各个样品的平均值㊁标准差和变异系数ꎬ组间重复是指３个样品间的平均值㊁标准差和变异系数.通过对组内重复性和组间重复性的分析ꎬ评估该方法的重复性.１.２.９㊀ｑＰＣＲ检测ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞的动态表达利用１.２.３的方法提取小鼠各时期卵母细胞的总ＲＮＡꎬ并将其反转录为ｃＤＮＡꎬ利用优化后的ｑＰＣＲ方法ꎬ测定ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞减数分裂４个阶段的动态表达.１.２.１０㊀ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞的免疫荧光染色将各时期卵母细胞置于固定液中固定３０ｍｉｎꎬ清洗３次后在透膜液中透膜２０ｍｉｎꎻ用含１％牛血清蛋白(ＢＳＡ)的ＰＢＳ中清洗３次后ꎬ将卵母细胞转移至封闭液中封闭１５ｍｉｎꎻ清洗后将卵母细胞转移至ＧＰＲ５０Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ(１ʒ２５０)中ꎬ４ħ孵育过夜ꎻ洗涤卵母细胞３次ꎬ将其转移至ＣｏｒａＬｉｔｅ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＧｏａｔＡｎｔｉ－ＲａｂｂｉｔＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)(１ʒ５００)中ꎬ在室温下７４２西南民族大学学报(自然科学版)第４９卷孵育１ｈ.清洗卵母细胞ꎬ并将其置于ＤＡＰＩ溶液中染核ꎻ２ｍｉｎ后清洗卵母细胞ꎬ并用抗荧光淬灭剂封片ꎬ整个过程在避光条件下进行.１.２.１１㊀数据的统计分析使用Ｅｘｃｅｌ２０１６进行标准曲线线性回归分析和平均值㊁标准差和变异系数分析ꎬ使用ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６软件和２－ΔΔＣｔ法进行ｑＰＣＲ数据分析ꎬ使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ９进行单因素方差分析.所有试验均进行３次重复以保证数据的可靠性.２㊀结果２.１㊀小鼠卵母细胞的收集和培养在成熟培养液中培养０㊁４㊁８㊁１４ｈꎬ分别得到ＧＶ㊁ＧＶＢＤ㊁ＭＩ及ＭＩＩ时期卵母细胞(图１).(ａ)(ｂ)(ｃ)(ｄ)图１㊀不同时期的小鼠卵母细胞(２００´)Ｆｉｇ.１㊀Ｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓ(２００´)注:(ａ):ＧＶ期卵母细胞ꎻ(ｂ):ＧＶＢＤ期卵母细胞ꎻ(ｃ):ＭＩ期卵母细胞ꎻ(ｄ):ＭＩＩ期卵母细胞Ｎｏｔｅ:(ａ):ＧＶｓｔａｇｅｏｏｃｙｔｅꎻ(ｂ):ＧＶＢＤｓｔａｇｅｏｏｃｙｔｅꎻ(ｃ):ＭＩｓｔａｇｅｏｏｃｙｔｅꎻ(ｄ):ＭＩＩｓｔａｇｅｏｏｃｙｔｅ２.２㊀ｑＰＣＲ体系的建立及优化２.２.１㊀最优引物的筛选用不同的引物进行普通ＰＣＲꎬ得到６个不同的条带(图２).由图２可知ꎬ各条带的长度与引物对应的扩增长度一致ꎬ表明成功扩增出目的基因和管家基因.另外ꎬ不同条带的亮度表明ＧＡＰＤＨ和ＧＰＲ５０最优引物均为第２对.８４２第３期王甜ꎬ等:ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位㊀图２㊀各引物ＰＣＲ结果Ｆｉｇ.２㊀ＰＣＲｗｉｔｈｅａｃｈｐｒｉｍｅｒ注:Ｍ:２０００Ｍａｒｋｅｒꎻ１:ＧＡＰＤＨ１ꎻ２:ＧＡＰＤＨ２ꎻ３:ＧＰＲ５０１ꎻ４:ＧＰＲ５０２ꎻ５:ＧＰＲ５０３ꎻ６:ＧＰＲ５０４Ｎｏｔｅ:Ｍ:２０００Ｍａｒｋｅｒꎻ１:ＧＡＰＤＨ１ꎻ２:ＧＡＰＤＨ２ꎻ３:ＧＰＲ５０１ꎻ４:ＧＰＲ５０２ꎻ５:ＧＰＲ５０３ꎻ６:ＧＰＲ５０４２.２.２㊀ｑＰＣＲ最优浓度的筛选以ＧＶ期小鼠卵母细胞ｃＤＮＡ为模板ꎬ在０.１㊁０.２㊁０.３㊁０.４㊁０.５μＭ五个浓度下进行ｑＰＣＲ.其中ꎬＧＰＲ５０和ＧＡＰＤＨ引物终浓度为０.３μＭ时Ｃｔ值最小(表２)ꎬ且扩增曲线出峰最早㊁信号最强(图３㊁图４)ꎬ因此将０.３μＭ作为所建立荧光定量ＰＣＲ方法最佳的引物终浓度.表２㊀不同ＰＣＲ引物终浓度的Ｃｔ值Ｔａｂｌｅ２㊀ＣｔｖａｌｕｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＰＣＲｐｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓＰＣＲ引物终浓度/μＭＧＰＲ５０Ｃｔ值ＧＡＰＤＨＣｔ值０.１３６.７３３２.８５０.２３６.０５３２.４３０.３３３.８９２９.６８０.４３５.９６２９.６８０.５３６.５０３１.７１图３㊀ＧＰＲ５０在不同引物终浓度条件下的扩增曲线Ｆｉｇ.３㊀ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆＧＰＲ５０ｕｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ图４㊀ＧＡＰＤＨ在不同引物终浓度条件下的扩增曲线Ｆｉｇ.４㊀ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆＧＡＰＤＨｕｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ㊀㊀经优化后的ｑＰＣＲ体系为２０μＬꎬ其中２ˑＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘＵＤＧ１０μＬ㊁１０μＭＦｏｒ￣ｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ０.６μＬ㊁１０μＭＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ０.６μＬ㊁ｃＤＮＡ２μＬ㊁ＰＣＲ－ｇｒａｄｅＷａｔｅｒ６.８μＬꎬ反应程序为５０ħ２ｍｉｎ㊁９４ħ１０ｍｉｎ㊁９５ħ３ｍｉｎ㊁９５ħ５ｓ㊁６０ħ３０ｓ(４５ｃｙｃｌｅｓ).９４２西南民族大学学报(自然科学版)第４９卷２.３㊀标准曲线的绘制将５个稀释度的ＧＶ期卵母细胞ｃＤＮＡ模板进行ｑＰＣＲꎬ得到的扩增曲线和溶解曲线如图(图５).生成的溶解曲线单一ꎬ溶解温度均为８８ħ~８９ħ.以模板浓度的对数值为横坐标ꎬＣｔ值为纵坐标ꎬ绘制标准曲线ꎬ得到线性方程为ｙ＝－０.８５６ｘ＋２８.３７４ꎬ其相关系数ｒ２＝０.９８８ꎬ截距为２８.３７４(图６)ꎬ说明模板浓度和Ｃｔ值具有良好的线性关系ꎬ该方法符合预期.图５㊀溶解曲线和扩增曲线Ｆｉｇ.５㊀Ｍｅｌｔｉｎｇａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓ图６㊀ｑＰＣＲ的标准曲线Ｆｉｇ.６㊀ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｆｏｒｑＰＣＲ２.４㊀敏感性的测定将６个浓度稀释度的ＧＶ期卵母细胞ｃＤＮＡ分别进行ｑＰＣＲ和普通ＰＣＲꎬ发现ｑＰＣＲ的最大检测稀释度为１０－４(图７)ꎬ而普通ＰＣＲ的最大检测稀释度为１００(图８)ꎬ表明所建立ｑＰＣＲ方法的敏感性优于普通ＰＣＲ敏感性.图７㊀溶解曲线和扩增曲线Ｆｉｇ.７㊀Ｍｅｌｔｉｎｇａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓ０５２第３期王甜ꎬ等:ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位㊀图８㊀普通ＰＣＲ灵敏度的测定Ｆｉｇ.８㊀ＧｅｎｅｒａｌＰＣＲｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ注:Ｍ:２０００Ｍａｒｋｅｒꎻ１:１００ꎻ２:１０－１ꎻ３:１０－２ꎻ４:１０－３ꎻ５:１０－４ꎻ６:阴性对照Ｎｏｔｅ:Ｍ:２０００Ｍａｒｋｅｒꎻ１:１００ꎻ２:１０－１ꎻ３:１０－２ꎻ４:１０－３ꎻ５:１０－４ꎻ６:ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２.５㊀特异性的测定将兔卵母细胞㊁鸡卵母细胞㊁牦牛卵母细胞及小鼠卵母细胞的ｃＤＮＡ以最优浓度的引物进行ｑＰＣＲꎬ发现只有小鼠卵母细胞的ｃＤＮＡ有荧光信号(图９)ꎬ除小鼠卵母细胞以外的模板还出现非特异性扩增(图１０)ꎬ证明所建立的方法特异性良好.图９㊀不同模板ｑＰＣＲ的扩增曲线Ｆｉｇ.９㊀ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆｑＰＣＲｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｌａｔｅｓ图１０㊀不同模板ｑＰＣＲ的溶解曲线Ｆｉｇ.１０㊀ＭｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅｓｏｆｑＰＣＲｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｌａｔｅｓ２.６㊀重复性的测定选择３个不同的ＧＶ期卵母细胞ｃＤＮＡ进行３次组间和组内重复性实验ꎬ发现扩增曲线和溶解曲线重合度较高(图１１)ꎬ同时该ｑＰＣＲ方法组内变异系数在０.６９％~０.８２％ꎬ组间变异系数在０.１０％~０.４０％(表３)ꎬ均小于１％ꎬ证明所建立的ｑＰＣＲ方法重复性良好.１５２西南民族大学学报(自然科学版)第４９卷图１１㊀扩增曲线和溶解曲线Ｆｉｇ.１１㊀Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅｓ表３㊀重复性的测定Ｔａｂｌｅ３㊀Ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ样品组内变异试验平均值标准差变异系数％组间变异试验平均值标准差变异系数％１３３.３００.２３０.６９３３.３００.０３０.１０２３４.３６０.２８０.８２３４.４５０.０７０.２０３３２.６３０.２４０.７４３２.５００.１３０.４０２.７㊀ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞成熟过程中的动态表达利用ｑＰＣＲ技术检测ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞中表达情况的结果表明ꎬＧＰＲ５０在不同时期卵母细胞中均有表达.生发泡破裂后ꎬＧＰＲ５０表达显著增多ꎬＧＶＢＤ期的表达量显著高于ＧＶ期(Ｐ<０.０５)ꎻ而ＧＶＢＤ期发生后ꎬＧＰＲ５０的表达量缓慢升高ꎻ卵母细胞减数分裂到达ＭＩ后ꎬＧＰＲ５０的表达量极显著升高ꎬ在ＭＩＩ期表达量最高ꎬ显著高于ＧＶ㊁ＧＶＢＤ及ＭＩ期(Ｐ<０.０１)的表达量(图１２).图１２㊀ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞发育过程中的动态表达Ｆｉｇ.１２㊀ＤｙｎａｍｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｄｕｒｉｎｇｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ图中误差线表示标准差.ｎｓ表示表达量差异不显著(Ｐ>０.０５)ꎬ∗表示表达量差异达到显著(Ｐ<０.０５)ꎬ∗∗∗表示表达量差异达到极显著(Ｐ<０.０１)Ｔｈｅｅｒｒｏｒｂａｒｓｉｎｔｈｅｆｉｇｕｒｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ.ｎｓｍｅａｎｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ(Ｐ>０.０５)ꎬ∗ｍｅａｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ(Ｐ<０.０５)ꎬ∗∗∗ｍｅａｎｓｖｅｒｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ(Ｐ<０.０１)２５２第３期王甜ꎬ等:ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位㊀２.８㊀ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞成熟过程中的亚细胞定位免疫荧光结果表明ꎬＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞细胞核和细胞质均有表达ꎬ且随着卵母细胞的发育ꎬ表达量不断升高ꎬ到ＭＩＩ期表达量最高(图１３)ꎬ与ｑＰＣＲ结果保持一致.在ＭＩＩ期时ꎬＧＰＲ５０大量分布在细胞膜.图１３㊀ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞ＧＶ(０ｈ)㊁ＧＶＢＤ(４ｈ)㊁ＭＩ(８ｈ)及ＭＩＩ(１４ｈ)期的亚细胞定位Ｆｉｇ.１３㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｉｎｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓａｔＧＶ(０ｈ)ꎬＧＶＢＤ(４ｈ)ꎬＭＩ(８ｈ)ａｎｄＭＩＩ(１４ｈ)ｓｔａｇｅｓ３㊀讨论㊀㊀由于ＲＮＡ易降解㊁小鼠卵母细胞ＲＮＡ含量低及样品收集困难等原因ꎬ利用ｑＰＣＲ技术在卵母细胞或胚胎中进行基因表达检测具有一定困难.针对小鼠卵母细胞㊁胚胎等微量样品的基因表达测定ꎬ建立一种高效㊁稳定且灵敏度高的ｑＰＣＲ体系尤为重要.引物的设计是影响ｑＰＣＲ质量的最关键因素之一ꎬ准确可靠的定量取决于使用有效的引物[１３].本研究针对ＧＰＲ５０和管家基因设计了多条引物ꎬ为ｑＰＣＲ准确性奠定了基础.同时ꎬ对于微量ｍＲＮＡ的定量ꎬ最优的敏感性和重复性分析是建立在最优引物浓度的基础上.本研究以Ｃｔ值最低和荧光信号最强为标准ꎬ筛选的最优引物终浓度为０.３μＭꎬ其选择标准与Ｍ.Ｒ.Ｇｒｅｅｎ[１４]等人一致.根据绘制的标准曲线ꎬ本研究模板浓度和Ｃｔ值具有良好的线性关系.本研究建立的ｑＰＣＲ方法敏感性优于普通ＰＣＲ的敏感性ꎬ符合之前的研究结果[１５－１７].在对特异性的结果进行评估时ꎬ发现将兔卵母细胞㊁鸡卵母细胞及牦牛卵母细胞进行ｑＰＣＲ时均无法产生信号ꎬ证明该ｑＰＣＲ方法特异性良好.而对重复性进行评估时ꎬ组间变异系数和组内变异系数均小于１％ꎬ证明所建立的ｑＰＣＲ方法重复性较高ꎬ可用于后续试验.据报道ꎬＧＰＲ５０在哺乳动物各组织中广泛表达ꎬ尤其在脑组织㊁生殖器官及胎盘中表达量最高[１８].ＧｒüｎｅｗａｌｄＥ[１９]等人发现ꎬＧＰＲ５０在小鼠胚胎第１３ｄ(Ｅ１３)开始表达ꎬ到第１８ｄ(Ｅ１８)达到峰值.而在胚胎第１３ｄ(Ｅ１３)时ꎬ原始生殖细胞正处于增殖阶段ꎬ随后形成卵原细胞ꎬ之后形成原始卵泡[２０].因此ꎬＧＰＲ５０在卵泡的发育过程中可能发挥着重要的作用.颗粒细胞与卵母细胞可进行ｃＧＭＰ交换[２１]ꎬｃＧＭＰ进入卵母细胞后可通过影响ｃＡＭＰ进而影响卵母细胞的发育[２２]ꎬ该过程为原始卵泡的形成奠定了基础.ＧＰＲ５０作为膜蛋白受体ꎬ可能间接参与了ｃＧＭＰ的扩散过程ꎬ同时与调控ｃＧＭＰ的ＣＮＰ－ＮＰＲ２信号通路[２３]具有潜在的联系.而目前还没有学者对ＧＰＲ５０与卵泡发育的关系进行研究ꎬ具体的分子机制和信号通路还有待挖掘.根据姚颖[２４]等人的研究ꎬＧＰＲ５０基因在牦牛卵母细胞ＧＶ期就有表达ꎬ并在成熟过程中逐渐升高ꎬ在ＭＩＩ期达到顶峰ꎬ且极显著高于ＧＶ与ＧＶＢＤ期(Ｐ<０.０１).本研究通过收集ＧＶ㊁ＧＶＢＤ㊁ＭＩ㊁ＭＩＩ期的小鼠卵母细胞ꎬ利用ｑＰＣＲ技术测定ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞发育过程中的表达情况.结果表明ꎬＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞减数分裂各阶段均有表达ꎬ其表达量随卵母细胞的发育逐渐升高且于ＭＩＩ期时达到顶峰ꎬ其表达规律与姚颖[２４]等人的研究结果保持一致.但不同的是ꎬＧＶ到ＧＶＢＤ进程中ＧＰＲ５０表达量显著增高ꎬＧＶＢＤ到ＭＩ进程中ＧＰＲ５０表达量缓慢升高ꎬＭＩ到ＭＩＩ进程中表达量显著升高ꎬ这可能是小鼠和牦牛物种差异导致的结果.本研究对ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞发育过程的亚细胞定位研究得知ꎬＧＰＲ５０在细胞质和细胞膜广泛表达ꎬ且随着卵母细胞的发育ꎬＧＰＲ５０表达量逐渐升高ꎬ在成熟卵母细胞中广泛分布在细胞膜区域.姚颖[２４]等人发现ꎬＧＰＲ５０在牦牛卵母细胞中的分布主要集中于细胞膜ꎬ且随着卵母细胞的发育逐渐向细胞质弥散３５２西南民族大学学报(自然科学版)第４９卷分布ꎬ而在小鼠卵母细胞中ꎬＧＰＲ５０广泛分布在细胞质和细胞膜ꎬ这可能是小鼠和牦牛物种差异导致的结果.同时ꎬＧＰＲ５０在ＣＡ１－３锥体细胞㊁齿状回的颗粒细胞及神经元相关细胞的分布主要集中于细胞膜和细胞质[１９ꎬ２５]ꎬ与ＧＰＲ５０在卵母细胞的亚细胞定位一致ꎬ这表明ＧＰＲ５０作为膜受体蛋白在细胞信号传导过程中具有重要的作用.４㊀结论㊀㊀本研究基于ＧＰＲ５０基因和小鼠卵母细胞建立了一种准确高效的实时荧光定量ＰＣＲ方法ꎬ该方法重复性高㊁特异性强㊁灵敏度高ꎬ可用于ＧＰＲ５０在小鼠各时期卵母细胞相对表达量的测定ꎻ随着卵母细胞的发育ꎬＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞的表达量逐渐增高ꎬ到ＭＩＩ期到达顶峰ꎻＧＰＲ５０主要分布于小鼠卵母细胞的细胞质和细胞膜.本研究结果为解析ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞减数分裂进程的分子机制提供依据.参考文献[１]ＭＡＵＲＩＣＥＰꎬＧＵＩＬＬＡＵＭＥＪＬꎬＢＥＮＬＥＵＬＭＩ－ＣＨＡＡＣＨＯＵＡＡꎬｅｔａｌ.ＧＰＣＲ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓꎬｍａｊｏｒｐｌａｙｅｒｓｏｆＧＰＣＲｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｙꎬ２０１１ꎬ６２:３４９－３８０. [２]ＤＵＦＯＵＮＮＹＬꎬＬＥＶＡＳＳＥＵＲＡꎬＭＩＧＡＵＤＭꎬｅｔａｌ.ＧＰＲ５０ｉｓｔｈｅｍａｍｍａｌｉａｎｏｒｔｈｏｌｏｇｏｆＭｅｌ１ｃ:ｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｒａｐｉｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎｍａｍｍａｌｓ[Ｊ].ＢＭＣＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００８ꎬ８(１):１０５－１１９. [３]ＬＥＶＯＹＥＡꎬＤＡＭＪꎬＡＹＯＵＢＭＡꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｏｒｐｈａｎＧＰＲ５０ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｉｎｈｉｂｉｔｓＭＴ１ｍｅｌａｔｏｎｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｈｅｔ￣ｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ[Ｊ].ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌꎬ２００６ꎬ２５(１３):３０１２－３０２３. [４]ＤＲＥＷＪＥꎬＢＡＲＲＥＴＴＰꎬＭＥＲＣＥＲＪＧꎬｅｔａｌ.Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅ￣ｌａｔｏｎｉｎ‐ｒｅｌａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｔｈｅｒｏｄｅｎｔｂｒａｉｎａｎｄｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｔｉｓｓｕｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙꎬ２００１ꎬ１３(５):４５３－４５８. [５]ＳＡＨＡＳＫꎬＣＨＯＩＨＹꎬＹＡＮＧＧＭꎬｅｔａｌ.ＧＰＲ５０ＰｒｏｍｏｔｅｓＨｅｐａｔｏｃｅｌ￣ｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｖｉａｔｈｅＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｔｈｒｏｕｇｈｄｉ￣ｒｅｃｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈＡＤＡＭ１７[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ－Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓꎬ２０２０ꎬ１７:３３２－３４９.[６]ＫＨＡＮＭＺꎬＨＥＬꎬＺＨＵＡＮＧＸꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｅｍｅｒｇｉｎｇｒｏｌｅｏｆＧＰＲ５０ｒｅ￣ｃｅｐｔｏｒｉｎｂｒａｉｎ[Ｊ].ＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙꎬ２０１６ꎬ７８:１２１－１２８.[７]ＣＨＥＮＹꎬＺＥＮＧＲＬꎬＫＯＵＪＹꎬｅｔａｌ.ＧＰＲ５０ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓｉｎａｎｄｐｒｏ￣ｍｏｔｅｓｙａｋｏｏｃｙｔｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ:Ａｎｅｗｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｏｃｙｔｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅ[Ｊ].Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙꎬ２０２２ꎬ１８１:３４－４１.[８]ＷＵＣＬꎬＬＩＲꎬＬＵＯＨＢꎬｅｔａｌ.ＪＡＫ２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＣＥＰ－３３７７９ｐｒｅｖｅｎｔｓｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ[Ｊ].ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ３７(４):１－６.[９]ＨＡＮＤＡＹＡＮＩＮꎬＷＩＷＥＫＯＢꎬＺＡＫＩＲＡＨＳＣꎬｅｔａｌ.ＩｎｖｉｔｒｏＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓｔｈｒｏｕｇｈＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＣａ２＋Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｍａｎＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２０ꎬ１３(２):１３８－１４４.[１０]ＡＮＱＬꎬＳＵＮＨＺꎬＺＨＡＮＧＪꎬｅｔａｌ.ＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅＡｄｅｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ２βＰａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓｉｎｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭＡＰＫｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＳｃｉｅｎｃｅｓ.２０２０ꎬ２７(１):１６３－１７１. [１１]ＭＡＲＪꎬＬＩＡＮＧＷꎬＳＵＮＱꎬｅｔａｌ.Ｓｉｒｔ１/Ｎｒｆ２ｐａｔｈｗａｙｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｏ￣ｏｃｙｔｅａｇｉｎｇｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＣｙｃｌｉｎＢ１[Ｊ].Ａｇｉｎｇ(ＡｌｂａｎｙＮＹ)ꎬ２０１８ꎬ１０(１０):２９９１－３００４.[１２]ＷＡＮＧＺＢꎬＯＵＸＨꎬＴＯＮＧＪＨꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＳＵＭＯｐａｔｈｗａｙｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＣｅｌｌＣｙｃｌｅꎬ２０１０ꎬ９(１３):２６４０－２６４６.[１３]ＲＯＤＲＩＧＵＥＺＡꎬＲＯＤＲＩＧＵＥＺＭꎬＣＯＲＤＯＢＡＪＪꎬｅｔａｌ.Ｄｅｓｉｇｎｏｆｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｐｒｏｂｅｓｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ(ＣｌｉｆｔｏｎꎬＮ.Ｊ.)ꎬ２０１５ꎬ１２７５:３１－５６. [１４]ＧＥＲＲＮＭＲꎬＳＡＭＢＲＯＯＫＪ.Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｐｒｉｍｅｒａｎｄｐｒｏｂｅｃｏｎｃｅｎｔｒａ￣ｔｉｏｎｓｆｏｒｕｓｅｉｎｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ(ＰＣＲ)ａｓｓａｙｓ[Ｊ].ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｏｔｏｃｏｌｓꎬ２０１８ꎬ１０:８２５－８３５.[１５]潘晓乐ꎬ扈登强ꎬ穆爱娟ꎬ等.奶牛乳腺上皮细胞中ｂｔａ－ｍｉＲ－２９ｂ实时荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立与应用[Ｊ].中国兽医科学ꎬ２０２１ꎬ５１(１１):１３６９－１３７５.[１６]沈奇ꎬ虞凌雪ꎬ高飞ꎬ等.猪源转录因子ＳＰ１ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立[Ｊ].中国动物传染病学报ꎬ２０２２ꎬ１－９. 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[２３]ＴＳＵＪＩＴꎬＫＩＹＯＳＵＣꎬＡＫＩＹＡＭＡＫꎬｅｔａｌ.ＣＮＰ/ＮＰＲ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇｍａｉｎ￣ｔａｉｎｓｏｏｃｙｔｅｍｅｉｏｔｉｃａｒｒｅｓｔｉｎｅａｒｌｙａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉｃｌｅｓａｎｄｉｓｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄｂｙＥＧＦＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｐｒｅｏｖｕｌａｔｏｒｙｆｏｌｌｉｃｌｅｓ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅ￣ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ２０１２ꎬ７９(１１):７９５－８０２.[２４]姚颖ꎬ陈艳ꎬ熊显荣ꎬ等.Ｇ蛋白偶联受体５０在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与亚细胞定位研究[Ｊ].中国畜牧兽医ꎬ２０２１ꎬ４８(０９):３３８７－３３９３.[２５]ＬＩＱＦꎬＺＨＡＮＧＹꎬＧＥＢＹꎬｅｔａｌ.ＧＰＲ５０ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅｃｏｒｔｅｘａｎｄｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ[Ｊ].ＮｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０２０ꎬ４５(１０):２３１２－２３２３.(责任编辑:和力新ꎬ付强ꎬ张阳ꎬ肖丽ꎬ罗敏ꎻ英文编辑:周序林ꎬ郑玉才)４５２。
高中生物胚胎工程的知识点
高中生物胚胎工程的知识点（经典版）编制人：__________________审核人：__________________审批人：__________________编制单位：__________________编制时间：____年____月____日序言下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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不同培养条件对牛卵母细胞体外成熟的影响
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。