卵母细胞成熟

卵母细胞的分级
• 包裹在卵母细胞周围的卵丘细胞的层数也影响着卵母细胞 的体外成熟。不同的研究者对卵母细胞的分类不尽一致。 根据卵母细胞外卵丘细胞的有无和层数，猪卵丘-卵母细 胞复合体分5级[5]。A级：扩展且颜色较暗，卵丘细胞有5 层以上包裹的胞质均匀的卵母细胞；B级：卵丘细胞颜色 较浅且稀疏的，卵丘细胞有5层以上包裹的胞质均匀的卵 母细胞；C级：有3～5层卵丘细胞紧密包裹的均匀胞质卵 母细胞；D级：卵丘细胞稀少，胞质不均匀；E级：裸卵、 黑卵。A、B级可以用于体外成熟培养，一般成熟率较高， 而C、D级则效果较差，E级不能用于体外培养。
在卵母细胞的体外成熟过程中，卵母细胞成熟率和成熟的 质量，取决于卵丘细胞的数量和质量。在卵母细胞体外成 熟研究中，一般根据卵丘细胞的数量和扩张的程度分为 4 种类型：即包绕 3 层以上紧密卵丘细胞的卵母细胞为第 1 类；3 层以下的为第 2 类；卵丘细胞扩展而疏松，卵母细 胞卵质无斑块的为第 3 类；无卵丘细胞的卵母细胞（裸卵） 为第 4 类。李丽立等（2002）对这 4 类卵母细胞体外成熟 研究结果表明，达到 MII 期的成熟率分别为 93%、90%、 76%、20%，成熟效果依次递减。因为在哺乳动物卵母细 胞成熟研究中发现，处于静止期的初级卵母细胞在激素的 作用下，若没有卵丘细胞的存在则卵母细胞不能成熟。可 见在卵母细胞成熟发育时卵丘细胞直接向卵母细胞发出成 熟发育信息。卵丘细胞对卵母细胞有着重要的协同作用， 所以卵丘的完整性和卵丘细胞包绕情况对卵母细胞成熟具 有重要的作用。因此，在进行猪胚胎体外生产时多选择卵 母细胞胞质均匀、透明带完整、具有 3 层或 3 层以上卵丘 细胞的 COCs 进行培养。
卵母细胞采集方法
卵母细胞的采集方法有抽吸法和切剖法。在从离体卵巢上采 集卵母细胞时，因采集方法不同，所得卵母细胞体外成熟率 间存在一定的差异，如抽吸法成熟率（77.6%）低于切剖法 （80.4%）。抽吸法和切剖法相比两者各有优缺点。与抽吸 法相比，切剖法虽然费时，但极少破坏卵丘卵母细胞复合体 （COCs），这种采集方法更有利于 COCs 的生长发育（陈晓 宇等，2002）。注射器抽取有腔卵泡要比用刀片割破所取卵 母细胞的数目要少，但是符合取卵时间愈短愈好的原则，因 其方便、干净、简捷而被普遍使用。但要注意选择合适的注 射器和针头。通常 10mL 注射器加18 号针头是比较合适的。 实践发现 10mL 注射器实用操作性比5 和 20mL 的好，抽取卵泡的速度也比较快，特别是针头的大小非常重 要。针头太大，卵母细胞流失很多，没有足够数量的卵母细 胞进行实验；针头太小则抽取过程中卵丘细胞会大量的脱落， 因为卵丘细胞对卵母细胞有重要的协同作用，卵丘细胞的脱 落将不利于卵母细胞的体外成熟。
培养时间
• 哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时间通常 是22～24 h。但猪比较特殊，通常需要44～ 48 h左右能达到核成熟，24 h时的核成熟率 几乎为零。虽然延长培养时间可以使核成 熟率逐步增高,但猪的卵母细胞会逐渐老化。 因此，在保证一定的核成熟率的前提下， 有必要缩短猪卵母细胞体外成熟培养时间。
卵母细胞体外成熟的调节机制 卵母细胞的成熟期是指从减数分裂的前期开始到第二次减数分裂 中期为止的这一时期。在此期间，有三个生化因子表现最为活跃， 它们是成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF）、细胞 静止因子（cytostatic factor，CSF）、卵母细胞成熟抑制因子 （oocyte maturation inhibitor，OMI）。MPF 催化一些与细胞分裂 有关的蛋白质发生磷酸化，促使细胞由间期向 M期转化，CSF 则促 进或维持 MPF 的生物活性，使卵母细胞停留在 M 期状态，OIM 主 要抑制卵母细胞的成熟分裂。由此可见，MPF 是卵母细胞成熟的 中心调控物质，而 CSF 起正调控，OIM 起负调控，它们协同调控 卵母细胞成熟的正常进行。另外还有一些分子参与卵母细胞的成 熟，如 cAMP、激素、细胞因子和粘多糖等。卵丘细胞包裹的层数， 被作为卵母细胞评定的一个指标。因为一些受体在卵丘细胞和卵 母细胞上的分布不同，所以在卵母细胞体外成熟过程中需要卵丘 细胞的参与。例如一些激素 FSH、LH，还有一些生长因子 EGF 等 等，它们的作用要通过卵丘细胞来实现。卵母细胞体外成熟的调 节机制卵母细胞的成熟期是指从减数分裂的前期开始到第二次减 数分裂中期为止的这一时期。
卵丘细胞包被 卵丘细胞质量是影响卵母细胞体外成熟的重要因素之 一。卵母细胞所需的营养物质依赖卵丘细胞提供，两 者间还通过缝隙连接进行信号传导，进而调节卵母细 胞的生长和成熟。裸卵仅能够利用周围介质中的丙酮 酸和三羧酸循环的中间产物，不能直接利用葡萄糖。 卵丘细胞可将葡萄糖转化为丙酮酸，为卵母细胞的生 长和发育提供能量。如果两者间缝隙连接被过早破坏， 卵母细胞可能停止发育（郑行，1994）。卵丘细胞在 卵母细胞离体后至受精前的成熟培养期间里对卵母细 胞自身的成熟起着很大作用，从而影响到随后的受精 及卵裂过程，而这个作用是随着卵丘细胞层数的增加 而提高（杨膺白等，1994）。FSH、LH 通过作用于卵 丘细胞上的受体，传递信号或分泌活性物质，作用于 卵母细胞，调节卵母细胞发育（Byskov 等，1997）。 说明卵丘细胞包裹对于卵母细胞体外成熟有积极作用。
卵巢回收时间和温度
•卵母细胞停留体外时间对成熟影响很大。 卵巢回收时间越短越好，最好是离体 2h 内将卵巢取回实验室。研究发现，母猪卵 巢离体时间长短影响到体外成熟。与其他 哺乳动物相比，猪卵子对温度特别敏感， 卵巢的回收温度较高或较低，卵母细胞体 外成熟培养效果极差甚至是退化，较合适 的回收温度是到达实验室时维持在 32~35℃当卵巢回收温度低于25 ℃,猪的卵 母细胞将受大小不一样，同一卵巢上的卵泡大小也不 同。一般取直径为 3~6mm的为宜，其质量较好，卵丘细胞形 态好的较多，整体大小比较均匀，核成熟率为 40.8%。哺乳 动物大腔卵泡的卵母细胞、小腔卵泡的卵母细胞和原始卵泡 都能完成体外成熟和体外受精，但卵泡的大小对卵母细胞的 成熟和发育有重要影响。猪卵泡直径直接影响卵母细胞体外 成熟率，成熟率较高的卵母细胞是来自中等直径的卵泡，而 小卵泡中的卵母细胞成熟率明显下降。来自大卵泡的卵母细 胞在体外培养时退化严重（王海，2002）。孟庆刚等（2001） 研究了由2mm 以下猪卵泡获得的小、中、大三类卵母细胞， 培养 48h 的成熟率分别为 0、22.31%和45.45%。2mm 以下卵 泡卵母细胞的成熟率（52.63%）显著低于 2~6mm 卵泡卵母 细胞的成熟率（80.39%）猪卵泡直径只有达到 2mm 以上， 其卵母细胞才具备体外成熟的能力，小腔卵泡中的卵母细胞 缺乏进一步发育所需的关系因子，大卵泡中卵母细胞的退化 可能与其过早成熟而发生老化有关。