卵母细胞体外成熟的机制与临床应用
卵母细胞成熟及其成熟调控因子
的成果 ， 为人 们 进一 步 了解 卵 母 细 胞 成 熟机 理 提 数 分裂 中期 的 核 成熟 。２ 细 胞 质 成 熟 经 历 受精 和 也 ）
１ 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 的 意 义
卵 母 细胞 体 外 成 熟 （ｎ ｖｔ ｔｒｔ ｎ Ｉ ｉ ｉ ｏ ｍａｕａｉ ＶＭ） ｒ ｏ 是指从 卵 巢 中获取 未 成 熟 卵 ， 体 外 经 过适 宜 的条 在
母 细胞 发育 过程 中 ， 泡 消 失 ， 仁 发 生 致 密 化 ， 空 核 核 孔 越来 越 大 ， 度 增 大 ， 核 周 隙 越 来 越 难 以 分 密 而
辨 ［ 。ＧＶＢ ２ ］ Ｄ发生 时 ， 色质 向核膜 侧 扩 散迁 移 ， 染 核 仁 越来越 小 ， 时核 膜 打 折 。核 仁 的消 逝 早 于 核 膜 同 的破裂 。Ｇ Ｄ标 志着 卵母 细胞 减数分 裂 的恢 复 和 ＶＢ
摘 要 ： 卵母 细胞 成 熟过程是 个复 杂的 减数分 裂 过程 ， 多 因子 参 与 这个过 程 的 调控 。为 了探 许 讨 哺乳 动物 卵母 细胞体 外成 熟 的机 理 ， 导 家畜体 外胚 胎 生产 ， 指 本文 就 卵母 细 胞体 外 成 熟培 养 （ ｉ ｏｍａｕ ａｉｎＩ ｉ ｖ ｒ ｔ ｒｔ ＶＭ） 影响 因子 等 方面进行 综述 。认 为在 卵母 细胞 体 外成 熟过 程 中 ， ｎ ｔ ｏ 及 仍
Ｊｎ ２ ０ ａ ．０ ８
卵 母 细 胞 成 熟 及 其 成 熟 调 控 因 子
夏 丰 ， 雷 苏
（． １ 云南 农 业 大 学 动 物 科 学 学 院 。 云南 昆 明 ６ ００ ；． 国 科学 院 昆 明动 物 所 。 南 昆 明 ６ ０ １ ； ５２ １ ２ 中 云 ５ ２３ ３ 云南 中科 胚 胎 工 程 中 心 ， 南 昆 明 ６０ １ ） ． 云 ５ ２ ７
犬卵母细胞体内发育及体外成熟的研究进展
犬卵母细胞体内发育及体外成熟的研究进展曹满园;张宇飞;王丽英;曹俊国;李文;韩玉萍;许保增;王守富【摘要】In this paper, the factors affecting the development of canine oocytes in vivo and in vitro maturation are reviewed, and its culture methods are summarized in order to provide a theoretical basis for overcoming the obstacles of canine related assisted reproductive technology and protecting precious and endangered species.%本文就犬卵母细胞体内发育及体外成熟的影响因素进行综述, 并对其培养方法进行了总结, 以期为克服犬相关辅助生殖技术的障碍, 保护珍贵和濒危犬种提供理论基础.【期刊名称】《特产研究》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】6页(P109-114)【关键词】犬;卵母细胞;体内发育;体外成熟【作者】曹满园;张宇飞;王丽英;曹俊国;李文;韩玉萍;许保增;王守富【作者单位】中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;吉林农业大学,长春 130118【正文语种】中文【中图分类】Q954.42犬科动物多为季节性、单次发情动物，但经驯养的家犬，其季节性发情特点逐渐消失，全年均可出现发情，尤其春、秋季节的发情比例较高[1]。
1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法
《动物胚胎工程实验教程》王子玉自编南京农业大学动科院2005年8月实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验一、实验目的熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。
二、实验器材和材料1. 器材及药品体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。
操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。
2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。
三、实验内容1.小鼠的超数排卵注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。
注射方法皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。
随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。
皮下注射时防止药液从针孔处逸出。
腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。
注射针头宜选用小号细针头。
注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。
2.卵巢的采集方法在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。
用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。
将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。
然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。
图1－1 小鼠的固定将处死并固定好的小鼠，在下腹部中间剪开1个小口，一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部（图1-2）。
剪开腹膜，向前方揭去肠胃内脏，即暴露出生殖器官，可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角（图1-3）。
促性腺激素对山羊卵母细胞体外成熟的影响
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文 献标 识 码 ： Ａ
文章 编 号 ： ５ ９ ６ ０ （ ０ ０ ０ —０ ６０ ０ ２ — ０ ５ ２ １ ） ７０ ０ — ２
促 性 腺 激 素 对 卵 母 细 胞 成 熟 的 启 动 发 挥 重 要 作
一 一 ｔ 一 一 一 一 ’ ～ … 一 … … … … ，… ，…
２． ５
山羊 羔股骨骨膜 内成 骨 细胞 ， 而本试 验 应 用 的是体 外培养 的绵羊 颅盖 骨 成骨 细 胞 。同时 ， 本试 验 的结 果也提示 ， 高浓度 Ｎａ Ｆ可能增 加成 骨细胞 线粒 体膜 的通透性 ， 启动 了线 粒 体凋 亡 信号 转 导途 径 。其 具 体机制 尚待进一 步研究 。
（． １ 仲恺 农 业 工 程 学 院生 命 科 学 学 院 ， 东 广 州 ５ ０ ２ ； 广 １２ ５
２ 上 海 交通 大学 医 学 院 实 验动 物 科 学部 ，上 海 长 宁 ２ ０ ２ ） ． ０ ０ ５
摘 要 ： 了建 立 针 对 山羊 卵 母 细胞 的理 想 体 外 成 熟 培 养 体 系 ， 试 验 研 究 了在 成 熟 培 养 液 中 添 加 不 同浓 度 的 促 卵 泡 素 为 本 （ ｌｃ ｔ ｌ ｉｇｈｒ ｏ ｅ Ｆ Ｈ）促 黄体 素 （ｕｅ ｉｎ ｏｍ ｎ ， Ｈ）不 同来 源 的 Ｆ Ｈ ＋ Ｌ 对 山 羊 卵 母 细 胞 体 外 培 养 ｆ ｌｌ ｓｍｕａ ｎ ｏｍ ｎ ， Ｓ 、 ｏｉｅ ｉ ｔ １ ｉ ｚ ｇｈ ｒ ｏ ｅ Ｉ ， ｔｎｉ ｓ Ｈ
参考文献 ：
［ ］ 徐 辉 ， 桂 珍． 性 氟 中 毒 非 骨 相 损 害 与 细 胞 凋 亡 口］ 地 方 病 １ 张 慢 ．
牛卵母细胞体外成熟的研究进展
收 稿 日期 ：０６３—５ ２０４３１
等。值得注意 的是 ， 同公 司不 同批 次 的产 量含量 和纯 不 度不一致 ， 配培养基 的渗透压 和 ｐ 所 Ｈ值等有一定差异 对 ＩＭ 的影响很大 。 Ｖ ２２ 温度 ２ 世纪 ８ ． ０ ０年代时 ， 研究者们对 ＩＭ一般用 Ｖ 普通的 ３℃。直 到 １８ ７ ９６年的 Ｅｇ ． 等才发现 ３ ℃时猪 卵 ９ 细胞体外成熟 率 较 高ｎ 。而 Ｌｎ 等 （９３年对 牛 卵母 ］ ｅｚ １８） 细胞 ⅣＦ研 究 也表 明 ，９ ３℃时 牛 体外 受 精 率 明显 高 于 ３ ℃ 、７ ５ ３ ℃和 ４ ℃ 。现在牛体外生 产 （ ） 多用 ３ ｌ ｗＰ 中， ８
～
３℃。 ９
２３ 气 相 目前 ， 卵母 细 胞 ＩＶ主 要用 的是 ５ 的 ． 牛 Ｐ ％ Ｃ）、 （ 相对湿 度 １０ 的空 气 ， ５ ０ 、％ ｏ 、 ２ ０％ 或 ％Ｃ ２５ ２ 相对 湿 度为 １０ ０ ％的空气 ； 也有用 ２ ｏ 或 ５ ｏ 相对湿 度 ％ｃ ： ％ｃ ： 为 １０ ０ ％的空气进行培养 的。Ｈ ｓｉｏ 等 （ｏｏ 对 比了 ａｈ ｔ ２ｏ ） ｍ ｏ 不同浓度 的 ０ 对 ＩＭ 的影 响 ， ２ Ｖ 发现低浓度 的 ０ 更有利 ２ 于卵母细胞 的 ＩＭ 和胚胞 的形成 。￣ ａａ ２０ ） Ｖ ｎ （００ 认 为５ ％或 ２ ％的氧气 浓度对牛 Ｃ Ｃ的影 响不大 ， ０ Ｏ 几乎不 影响其 卵裂和发育 为桑椹胚 ¨ 训。可 能是 因为氧 自由基 的毒 害使胚胎 发 育受 到一定 影 响 ， 因此 ， 学者 提 出在 有 培养基 中添加 一 定量 的半胱 氨酸有 利 于降低 氧 自由基
211287355_ＧＰＲ５０_在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位
ｄｏｉ:１０ １１９２０/ｘｎｍｄｚｋ ２０２３ ０３ ００２ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位王㊀甜１ꎬ黄显朋１ꎬ朱洪阳１ꎬ吉文汇１ꎬ２ꎬ付㊀伟１ꎬ２ꎬ殷㊀实１ꎬ２ꎬ兰道亮１ꎬ２(１.西南民族大学畜牧兽医学院ꎬ四川成都㊀６１００４１ꎻ２.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室ꎬ四川成都㊀６１００４１)摘㊀要:旨在探究ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达规律及亚细胞定位.通过卵母细胞体外培养技术㊁ｑＰＣＲ技术及免疫荧光技术测定ＧＰＲ５０在小鼠不同时期卵母细胞的转录水平及亚细胞定位.结果表明ꎬ所建立的ｑＰＣＲ方法敏感性高㊁特异性强㊁重复性好且检测效率高ꎬ可用于测定ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞中转录水平的表达ꎻＧＰＲ５０在不同阶段小鼠卵母细胞中均有表达ꎬ生发泡破裂(ＧＶＢＤ)后ꎬＧＰＲ５０的表达量显著高于ＧＶ期(Ｐ<０.０５)ꎻ随着卵母细胞的发育ꎬ其表达量不断增高ꎬ到ＭＩＩ期达到顶峰ꎬ极显著高于ＧＶ㊁ＧＶＢＤ及ＭＩ期(Ｐ<０.０１).随着卵母细胞的发育ꎬＧＰＲ５０大量表达于细胞质和细胞膜ꎬ但在成熟卵母细胞中ꎬＧＰＲ５０主要集中分布于细胞膜.以上结果说明ꎬＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟中发挥重要的作用ꎬ为解析ＧＰＲ５０在哺乳动物卵母细胞体外成熟进程的分子机制奠定了基础.关键词:ＧＰＲ５０ꎻ小鼠卵母细胞ꎻ体外成熟ꎻ转录水平表达ꎻ亚细胞定位中图分类号:Ｑ２６㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:２０９５￣４２７１(２０２３)０３￣０２４５￣１０收稿日期:２０２３￣０１￣０４通信作者:兰道亮(１９８４－)ꎬ男ꎬ教授ꎬ博士ꎬ研究方向:动物遗传育种与繁殖及胚胎工程.Ｅ－ｍａｉｌ:ｌａｎｄａｏｌｉａｎｇ＠１６３.ｃｏｍ基金项目:国家重点研发计划(２０２１ＹＦＤ１６００２００)ꎻ国家自然科学基金－面上项目(３１８７２３６１)ꎻ西南民族大学研究生创新型科研项目(ＣＸ２０２１ＳＺ５８)ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｄｕｒｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓＷＡＮＧＴｉａｎ１ꎬＨＵＡＮＧＸｉａｎ￣ｐｅｎｇ１ꎬＺＨＵＨｏｎｇ￣ｙａｎｇ１ꎬＪＩＷｅｎ￣ｈｕｉ１ꎬ２ꎬＦＵＷｅｉ１ꎬ２ꎬＹＩＮＳｈｉ１ꎬ２ꎬＬＡＮＤａｏ￣ｌｉａｎｇ１ꎬ２(１.ＳｃｈｏｏｌｏｆＡｎｉｍａｌ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｏｕｔｈｗｅｓｔＭｉｎｚｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＣｈｅｎｇｄｕ６１００４１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＱｉｎｇｈａｉ￣ＴｉｂｅｔＰｌａｔｅａｕＡｎｉｍａｌＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎꎬＳｏｕｔｈｗｅｓｔＭｉｎｚｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＣｈｅｎｇｄｕ６１００４１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎａｎｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｉｎｔｈｅｉｎｖｉｔｒｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎ(ＩＶＭ)ｏｆｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓꎬｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌａｎｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｉｎｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒ￣ｍｉｎｅｄｂｙｉｎｖｉｔｒｏｏｏｃｙｔｅｃｕｌｔｕｒｅꎬｑＰＣＲａｎｄｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｑＰＣＲｍｅｔｈ￣ｏｄｈａｄｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎬｓｔｒｏｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙꎬｇｏｏｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｈｉｇｈｄｅｔｅｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙꎬｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓ.ＧＰＲ５０ｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓ.Ａｆｔｅｒｇｅｒｍｉｎａｌｖｅｓｉｃｌｅｂｒｅａｋｄｏｗｎ(ＧＶＢＤ)ꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎＧＶｓｔａｇｅ(Ｐ<０.０５).ＷｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｏｏｃｙｔｅｓꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙꎬａｎｄｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｐｅａｋｉｎＭＩＩｓｔａｇｅꎬｗｈｉｃｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎＧＶꎬＧＶＢＤａｎｄＭＩｓｔａｇｅｓ(Ｐ<０.０１).ＷｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｏｏｃｙｔｅｓꎬＧＰＲ５０ｗａｓａｂｕｎｄａｎｔｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅꎬｂｕｔｉｎｍａｔｕｒｅｏｏｃｙｔｅｓꎬＧＰＲ５０ｗａｓｍａｉｎｌｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｉｎｔｈｅｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ.ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＧＰＲ５０ｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅＩＶＭｏｆｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓꎬｗｈｉｃｈｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＧＰＲ５０ｉｎｔｈｅＩＶＭｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｏｏｃｙｔｅｓ.西南民族大学学报(自然科学版)第４９卷Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＧＰＲ５０ꎻｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅꎻｉｎｖｉｔｒｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎꎻｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ㊀㊀Ｇ蛋白偶联受体(ＧＰＣＲｓ)ꎬ也称为７次跨越蛋白(７ＴＭ)ꎬ是最丰富的细胞膜受体之一ꎬ具有约８００个成员.ＧＰＣＲ不仅能与同聚体互作ꎬ也能与异聚体相互作用[１]ꎬ介导了机体内８０％的跨膜信号转导.迄今为止ꎬ大约１００个ＧＰＣＲｓ未鉴定出其内源配体ꎬ被称为孤儿ＧＰＣＲ.Ｇ蛋白偶联受体５０(ＧＰＲ５０)作为一种孤儿ＧＰＣＲꎬ被证明与褪黑素(ｍｅｌａｔｏｎｉｎꎬＭＴ)受体ＭＴ１和ＭＴ２具有高度同源性[２]ꎬ因此也被称为褪黑素相关受体.虽然不与褪黑素结合ꎬ但ＧＰＲ５０可与ＭＴ１及ＭＴ２形成异二聚体ꎬ并通过影响ＭＴ１介导的相关信号通路而发挥作用[３].ＧＰＲ５０受体具有七个疏水段和一个亲水性羧基尾ꎬ其显著特征是氨基末端和额外的细胞环中没有Ｎ－连接的糖基化共有位点ꎬ同时具有一个含有三个多态性位点的Ｃ端长链.ＧＰＲ５０被证实在小鼠和兔等动物的多个器官和组织中表达ꎬ尤其在脑和生殖器官中表达量较高[４].ＧＰＲ５０参与糖皮质激素受体(ＧＲ)信号通路㊁瘦素(ｌｅｐｔｉｎ)信号通路㊁ＮＯＧＯ－Ａ及ＲｈｏＡ/ＲＯＣＫ信号通路等多条通路ꎬ其生理功能受到广泛关注.据报道ꎬＧＰＲ５０与双相情感障碍㊁脂质代谢㊁产热㊁脂肪生成和神经元发育有关[５]ꎬ也被认为是抑郁症等精神疾病治疗的重要靶点[６].在最新的研究中ꎬＹ.Ｃｈｅｎ[７]等人发现ＧＰＲ５０具有促进牦牛卵母细胞成熟的潜在作用ꎬ但ＧＰＲ５０是否在哺乳动物卵母细胞成熟发挥作用还有待证明.哺乳动物卵母细胞的成熟涉及多个细胞事件ꎬ包括生发泡破裂(ＧＶＢＤ)㊁染色体凝聚㊁纺锤体的形成和迁移[８].据报道ꎬ参与卵母细胞成熟的分子通路主要有Ｃａ２＋信号通路[９]㊁ＭＡＰＫ信号通路[１０]㊁Ｓｉｒｔ１－Ｎｒｆ２－ＣｙｃｌｉｎＢ１信号通路[１１]㊁ＳＵＭＯ通路[１２]等ꎬ解析哺乳动物卵母细胞成熟的分子机制成为近年来研究的热点.为研究ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟过程中的分子机制ꎬ利用ｑＰＣＲ及免疫荧光技术研究ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞发育过程中的动态表达规律及亚细胞定位ꎬ为研究ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟中的作用奠定基础ꎬ同时也为丰富哺乳动物卵母细胞成熟的分子机制提供依据.１㊀材料与方法１.１㊀材料本试验所用小鼠(Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ)均为６~８周龄无特定病原体(ＳＰＦ)级别的ＩＣＲ小鼠ꎬ购自成都达硕实验动物有限公司.所用牦牛卵巢由成都青白江屠宰场提供ꎬ兔卵巢和鸡卵巢由西南民族大学畜牧兽医学院兰道亮课题组提供.１.２㊀方法１.２.１㊀小鼠卵母细胞的收集与培养经腹腔注射１０ＩＵ孕马血清促性腺激素(ＰＭＳＧ)４４~４８ｈ后ꎬ用脱臼法处死小鼠并取卵巢置于３７ħ预热的㊁含１％青链霉素的磷酸盐缓冲液(ＰＢＳ)中.在体式显微镜下用１ｍＬ注射器扎破卵泡ꎬ使小鼠卵巢内容物流出.收集生发泡(ＧＶ)时期卵母细胞ꎬ将其置于预热２ｈ的成熟培养液中进行培养.成熟培养液用培养用油覆盖ꎬ其配方为:Ｍ２培养液㊁１０ＩＵ/ｍＬ促卵泡激素(ＦＳＨ)㊁１０ＩＵ/ｍＬ黄体生成素(ＬＨ)㊁２０μｇ/ｍＬ雌二醇(Ｅ２)㊁１０％胎牛血清(ＦＢＳ)㊁１％双抗.分别在培养０㊁４㊁８㊁１４ｈ收集ＧＶ㊁ＧＶＢＤ㊁第一次减数分裂(ＭＩ)及第二次减数分裂(ＭＩＩ)期卵母细胞.裸卵清洗后直接用于后续实验或保存至－８０ħꎬ卵丘－卵母细胞复合物置于０.２％的透明质酸酶中于３７ħ消化３~５ｍｉｎꎬ除去颗粒细胞后用于后续实验或保存至－８０ħ.１.２.２㊀引物的设计和合成在ＧｅｎＢａｎｋ下载小鼠(Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ)的ＧＰＲ５０(ＮＭ＿０１０３４０.２)㊁ＧＡＰＤＨ(ＮＭ＿００８０８４.３)基因序列ꎬ用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５设计引物ꎬ引物序列如表１所示.６对引物均由上海生工生物工程有限公司合成.１.２.３㊀总ＲＮＡ的提取㊁反转录和ＰＣＲ使用ＯｍｅｇａＥ.Ｚ.Ｎ.Ａ ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅＴｏｔａｌＲＮＡＫｉｔ提取各时期小鼠卵母细胞的总ＲＮＡꎬ再利用Ｅｘｏｎ￣ＳｃｒｉｐｔＲＴＳｕｐｅｒＭｉｘｗｉｔｈｄｓＤＮａｓｅ进行反转录ꎬ体系为ＴｏｔａｌＲＮＡ１３μＬ㊁５ˑＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ∗４４μＬ㊁ＳｕｐｒｅｍｅＥｎｚｙｍｅＭｉｘ３μＬꎬ反应程序为２５ħ１０ｍｉｎꎬ５５ħ１５ｍｉｎꎬ８５ħ５ｍｉｎ.普通ＰＣＲ体系为２ˑＴａｑＡｄｖａｎｃｅｄ６４２第３期王甜ꎬ等:ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位㊀ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１２.５μＬ㊁ＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ０.５μＬ㊁Ｒｅ￣ｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ０.５μＬ㊁ｄｄＨ２Ｏ９.５μＬ㊁ｃＤＮＡ２ｕＬꎬ反应程序为９４ħ３ｍｉｎꎬ９４ħ３０ｓꎬ６０ħ３０ｓ㊁７０ħ３０ｓ/ｋｂ(２５~３５ｃｙｃｌｅｓ)ꎬ７０ħ５ｍｉｎ.表１㊀引物序列信息Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ基因序号引物名称引物序列(５ᶄң３ᶄ)产物长度/ｂｐＧＰＲ５０１２３４ＧＰＲ５０－Ｆ５ᶄ－ＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＧＧＴＡＧＣＣＣ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｒ５ᶄ－ＴＡＴＧＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＧＴＴＴＴＣ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｆ５ᶄ－ＣＣＡＣＣＡＣＴＧＴＴＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｒ５ᶄ－ＡＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＴＣ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｆ５ᶄ－ＣＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＴＣＴＡ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｒ５ᶄ－ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＡＣ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｆ５ᶄ－ＧＧＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＴＣＣ－３ᶄＧＰＲ５０－Ｒ５ᶄ－ＴＴＧＣＣＡＧＡＡＴＴＴＣＧＧＡＧＣＴＴＣ－３ᶄ４１６３０９５１５１８８ＧＡＰＤＨ１２ＧＡＰＤＨ－Ｆ５ᶄ－ＡＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣ－３ᶄＧＡＰＤＨ－Ｒ５ᶄ－ＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡ－３ᶄＧＡＰＤＨ－Ｆ５ᶄ－ＣＣＣＣＣＡＡＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴ－３ᶄＧＡＰＤＨ－Ｒ５ᶄ－ＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＴＡＣＴＣ－３ᶄ５２９３１５１.２.４㊀ｑＰＣＲ体系的建立及优化ｑＰＣＲ的初始反应体系为２ˑＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘＵＤＧ１０μＬ㊁１０μＭＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ０.４μＬ㊁１０μＭＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ０.４μＬ㊁ｃＤＮＡ２μＬ㊁ＰＣＲ－ｇｒａｄｅＷａｔｅｒ７.２μＬꎬ反应程序为５０ħ２ｍｉｎ㊁９４ħ１０ｍｉｎ㊁９５ħ３ｍｉｎ㊁９５ħ５ｓ㊁６０ħ３０ｓ(４０ｃｙ￣ｃｌｅｓ).用不同的引物进行普通ＰＣＲꎬ选出最佳的引物ꎻ以最佳引物为基础ꎬ在不同引物浓度(０.１㊁０.２㊁０.３㊁０.４㊁０.５μＭ)进行ｑＰＣＲꎬ找到最佳的引物浓度ꎬ以此优化所建立的ｑＰＣＲ反应体系和程序.１.２.５㊀标准曲线的绘制以小鼠ＧＶ期卵母细胞的ｃＤＮＡ为模板ꎬ将其以１０倍比稀释并用１００~１０－４５个浓度以１.２.４得到的方法进行ｑＰＣＲ.记录各个浓度的Ｃｔ值ꎬ以ｃＤＮＡ浓度为横坐标ꎬＣｔ值为纵坐标ꎬ绘制标准曲线ꎬ分析模板浓度与Ｃｔ值的线性关系.１.２.６㊀敏感性的测定以ＧＶ期卵母细胞的ｃＤＮＡ为模板ꎬ将１００~１０－５６个浓度的ｃＤＮＡ分别进行ｑＰＣＲ和普通ＰＣＲ.比较两种方法的最低检测稀释度ꎬ以评估所建立方法的敏感性.１.２.７㊀特异性的测定分别提取ＧＶ期小鼠㊁牦牛㊁鸡及兔卵母细胞ＲＮＡꎬ反转录后进行ｑＰＣＲ检测各样本的ＧＰＲ５０表达情况ꎬ以评估该方法的特异性.１.２.８㊀重复性的测定以３组ＧＶ期小鼠卵母细胞的ｃＤＮＡ为模板进行ｑＰＣＲꎬ分别进行３次组内重复和组间重复ꎬ记录样品对应的Ｃｔ值.组内重复性是指各个样品的平均值㊁标准差和变异系数ꎬ组间重复是指３个样品间的平均值㊁标准差和变异系数.通过对组内重复性和组间重复性的分析ꎬ评估该方法的重复性.１.２.９㊀ｑＰＣＲ检测ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞的动态表达利用１.２.３的方法提取小鼠各时期卵母细胞的总ＲＮＡꎬ并将其反转录为ｃＤＮＡꎬ利用优化后的ｑＰＣＲ方法ꎬ测定ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞减数分裂４个阶段的动态表达.１.２.１０㊀ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞的免疫荧光染色将各时期卵母细胞置于固定液中固定３０ｍｉｎꎬ清洗３次后在透膜液中透膜２０ｍｉｎꎻ用含１％牛血清蛋白(ＢＳＡ)的ＰＢＳ中清洗３次后ꎬ将卵母细胞转移至封闭液中封闭１５ｍｉｎꎻ清洗后将卵母细胞转移至ＧＰＲ５０Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ(１ʒ２５０)中ꎬ４ħ孵育过夜ꎻ洗涤卵母细胞３次ꎬ将其转移至ＣｏｒａＬｉｔｅ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＧｏａｔＡｎｔｉ－ＲａｂｂｉｔＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)(１ʒ５００)中ꎬ在室温下７４２西南民族大学学报(自然科学版)第４９卷孵育１ｈ.清洗卵母细胞ꎬ并将其置于ＤＡＰＩ溶液中染核ꎻ２ｍｉｎ后清洗卵母细胞ꎬ并用抗荧光淬灭剂封片ꎬ整个过程在避光条件下进行.１.２.１１㊀数据的统计分析使用Ｅｘｃｅｌ２０１６进行标准曲线线性回归分析和平均值㊁标准差和变异系数分析ꎬ使用ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６软件和２－ΔΔＣｔ法进行ｑＰＣＲ数据分析ꎬ使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ９进行单因素方差分析.所有试验均进行３次重复以保证数据的可靠性.２㊀结果２.１㊀小鼠卵母细胞的收集和培养在成熟培养液中培养０㊁４㊁８㊁１４ｈꎬ分别得到ＧＶ㊁ＧＶＢＤ㊁ＭＩ及ＭＩＩ时期卵母细胞(图１).(ａ)(ｂ)(ｃ)(ｄ)图１㊀不同时期的小鼠卵母细胞(２００´)Ｆｉｇ.１㊀Ｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓ(２００´)注:(ａ):ＧＶ期卵母细胞ꎻ(ｂ):ＧＶＢＤ期卵母细胞ꎻ(ｃ):ＭＩ期卵母细胞ꎻ(ｄ):ＭＩＩ期卵母细胞Ｎｏｔｅ:(ａ):ＧＶｓｔａｇｅｏｏｃｙｔｅꎻ(ｂ):ＧＶＢＤｓｔａｇｅｏｏｃｙｔｅꎻ(ｃ):ＭＩｓｔａｇｅｏｏｃｙｔｅꎻ(ｄ):ＭＩＩｓｔａｇｅｏｏｃｙｔｅ２.２㊀ｑＰＣＲ体系的建立及优化２.２.１㊀最优引物的筛选用不同的引物进行普通ＰＣＲꎬ得到６个不同的条带(图２).由图２可知ꎬ各条带的长度与引物对应的扩增长度一致ꎬ表明成功扩增出目的基因和管家基因.另外ꎬ不同条带的亮度表明ＧＡＰＤＨ和ＧＰＲ５０最优引物均为第２对.８４２第３期王甜ꎬ等:ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位㊀图２㊀各引物ＰＣＲ结果Ｆｉｇ.２㊀ＰＣＲｗｉｔｈｅａｃｈｐｒｉｍｅｒ注:Ｍ:２０００Ｍａｒｋｅｒꎻ１:ＧＡＰＤＨ１ꎻ２:ＧＡＰＤＨ２ꎻ３:ＧＰＲ５０１ꎻ４:ＧＰＲ５０２ꎻ５:ＧＰＲ５０３ꎻ６:ＧＰＲ５０４Ｎｏｔｅ:Ｍ:２０００Ｍａｒｋｅｒꎻ１:ＧＡＰＤＨ１ꎻ２:ＧＡＰＤＨ２ꎻ３:ＧＰＲ５０１ꎻ４:ＧＰＲ５０２ꎻ５:ＧＰＲ５０３ꎻ６:ＧＰＲ５０４２.２.２㊀ｑＰＣＲ最优浓度的筛选以ＧＶ期小鼠卵母细胞ｃＤＮＡ为模板ꎬ在０.１㊁０.２㊁０.３㊁０.４㊁０.５μＭ五个浓度下进行ｑＰＣＲ.其中ꎬＧＰＲ５０和ＧＡＰＤＨ引物终浓度为０.３μＭ时Ｃｔ值最小(表２)ꎬ且扩增曲线出峰最早㊁信号最强(图３㊁图４)ꎬ因此将０.３μＭ作为所建立荧光定量ＰＣＲ方法最佳的引物终浓度.表２㊀不同ＰＣＲ引物终浓度的Ｃｔ值Ｔａｂｌｅ２㊀ＣｔｖａｌｕｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＰＣＲｐｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓＰＣＲ引物终浓度/μＭＧＰＲ５０Ｃｔ值ＧＡＰＤＨＣｔ值０.１３６.７３３２.８５０.２３６.０５３２.４３０.３３３.８９２９.６８０.４３５.９６２９.６８０.５３６.５０３１.７１图３㊀ＧＰＲ５０在不同引物终浓度条件下的扩增曲线Ｆｉｇ.３㊀ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆＧＰＲ５０ｕｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ图４㊀ＧＡＰＤＨ在不同引物终浓度条件下的扩增曲线Ｆｉｇ.４㊀ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆＧＡＰＤＨｕｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｉｍｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ㊀㊀经优化后的ｑＰＣＲ体系为２０μＬꎬ其中２ˑＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘＵＤＧ１０μＬ㊁１０μＭＦｏｒ￣ｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ０.６μＬ㊁１０μＭＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ０.６μＬ㊁ｃＤＮＡ２μＬ㊁ＰＣＲ－ｇｒａｄｅＷａｔｅｒ６.８μＬꎬ反应程序为５０ħ２ｍｉｎ㊁９４ħ１０ｍｉｎ㊁９５ħ３ｍｉｎ㊁９５ħ５ｓ㊁６０ħ３０ｓ(４５ｃｙｃｌｅｓ).９４２西南民族大学学报(自然科学版)第４９卷２.３㊀标准曲线的绘制将５个稀释度的ＧＶ期卵母细胞ｃＤＮＡ模板进行ｑＰＣＲꎬ得到的扩增曲线和溶解曲线如图(图５).生成的溶解曲线单一ꎬ溶解温度均为８８ħ~８９ħ.以模板浓度的对数值为横坐标ꎬＣｔ值为纵坐标ꎬ绘制标准曲线ꎬ得到线性方程为ｙ＝－０.８５６ｘ＋２８.３７４ꎬ其相关系数ｒ２＝０.９８８ꎬ截距为２８.３７４(图６)ꎬ说明模板浓度和Ｃｔ值具有良好的线性关系ꎬ该方法符合预期.图５㊀溶解曲线和扩增曲线Ｆｉｇ.５㊀Ｍｅｌｔｉｎｇａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓ图６㊀ｑＰＣＲ的标准曲线Ｆｉｇ.６㊀ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｆｏｒｑＰＣＲ２.４㊀敏感性的测定将６个浓度稀释度的ＧＶ期卵母细胞ｃＤＮＡ分别进行ｑＰＣＲ和普通ＰＣＲꎬ发现ｑＰＣＲ的最大检测稀释度为１０－４(图７)ꎬ而普通ＰＣＲ的最大检测稀释度为１００(图８)ꎬ表明所建立ｑＰＣＲ方法的敏感性优于普通ＰＣＲ敏感性.图７㊀溶解曲线和扩增曲线Ｆｉｇ.７㊀Ｍｅｌｔｉｎｇａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓ０５２第３期王甜ꎬ等:ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位㊀图８㊀普通ＰＣＲ灵敏度的测定Ｆｉｇ.８㊀ＧｅｎｅｒａｌＰＣＲｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ注:Ｍ:２０００Ｍａｒｋｅｒꎻ１:１００ꎻ２:１０－１ꎻ３:１０－２ꎻ４:１０－３ꎻ５:１０－４ꎻ６:阴性对照Ｎｏｔｅ:Ｍ:２０００Ｍａｒｋｅｒꎻ１:１００ꎻ２:１０－１ꎻ３:１０－２ꎻ４:１０－３ꎻ５:１０－４ꎻ６:ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２.５㊀特异性的测定将兔卵母细胞㊁鸡卵母细胞㊁牦牛卵母细胞及小鼠卵母细胞的ｃＤＮＡ以最优浓度的引物进行ｑＰＣＲꎬ发现只有小鼠卵母细胞的ｃＤＮＡ有荧光信号(图９)ꎬ除小鼠卵母细胞以外的模板还出现非特异性扩增(图１０)ꎬ证明所建立的方法特异性良好.图９㊀不同模板ｑＰＣＲ的扩增曲线Ｆｉｇ.９㊀ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆｑＰＣＲｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｌａｔｅｓ图１０㊀不同模板ｑＰＣＲ的溶解曲线Ｆｉｇ.１０㊀ＭｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅｓｏｆｑＰＣＲｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｌａｔｅｓ２.６㊀重复性的测定选择３个不同的ＧＶ期卵母细胞ｃＤＮＡ进行３次组间和组内重复性实验ꎬ发现扩增曲线和溶解曲线重合度较高(图１１)ꎬ同时该ｑＰＣＲ方法组内变异系数在０.６９％~０.８２％ꎬ组间变异系数在０.１０％~０.４０％(表３)ꎬ均小于１％ꎬ证明所建立的ｑＰＣＲ方法重复性良好.１５２西南民族大学学报(自然科学版)第４９卷图１１㊀扩增曲线和溶解曲线Ｆｉｇ.１１㊀Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅｓ表３㊀重复性的测定Ｔａｂｌｅ３㊀Ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ样品组内变异试验平均值标准差变异系数％组间变异试验平均值标准差变异系数％１３３.３００.２３０.６９３３.３００.０３０.１０２３４.３６０.２８０.８２３４.４５０.０７０.２０３３２.６３０.２４０.７４３２.５００.１３０.４０２.７㊀ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞成熟过程中的动态表达利用ｑＰＣＲ技术检测ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞中表达情况的结果表明ꎬＧＰＲ５０在不同时期卵母细胞中均有表达.生发泡破裂后ꎬＧＰＲ５０表达显著增多ꎬＧＶＢＤ期的表达量显著高于ＧＶ期(Ｐ<０.０５)ꎻ而ＧＶＢＤ期发生后ꎬＧＰＲ５０的表达量缓慢升高ꎻ卵母细胞减数分裂到达ＭＩ后ꎬＧＰＲ５０的表达量极显著升高ꎬ在ＭＩＩ期表达量最高ꎬ显著高于ＧＶ㊁ＧＶＢＤ及ＭＩ期(Ｐ<０.０１)的表达量(图１２).图１２㊀ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞发育过程中的动态表达Ｆｉｇ.１２㊀ＤｙｎａｍｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｄｕｒｉｎｇｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ图中误差线表示标准差.ｎｓ表示表达量差异不显著(Ｐ>０.０５)ꎬ∗表示表达量差异达到显著(Ｐ<０.０５)ꎬ∗∗∗表示表达量差异达到极显著(Ｐ<０.０１)Ｔｈｅｅｒｒｏｒｂａｒｓｉｎｔｈｅｆｉｇｕｒｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ.ｎｓｍｅａｎｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ(Ｐ>０.０５)ꎬ∗ｍｅａｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ(Ｐ<０.０５)ꎬ∗∗∗ｍｅａｎｓｖｅｒｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ(Ｐ<０.０１)２５２第３期王甜ꎬ等:ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位㊀２.８㊀ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞成熟过程中的亚细胞定位免疫荧光结果表明ꎬＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞细胞核和细胞质均有表达ꎬ且随着卵母细胞的发育ꎬ表达量不断升高ꎬ到ＭＩＩ期表达量最高(图１３)ꎬ与ｑＰＣＲ结果保持一致.在ＭＩＩ期时ꎬＧＰＲ５０大量分布在细胞膜.图１３㊀ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞ＧＶ(０ｈ)㊁ＧＶＢＤ(４ｈ)㊁ＭＩ(８ｈ)及ＭＩＩ(１４ｈ)期的亚细胞定位Ｆｉｇ.１３㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧＰＲ５０ｉｎｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓａｔＧＶ(０ｈ)ꎬＧＶＢＤ(４ｈ)ꎬＭＩ(８ｈ)ａｎｄＭＩＩ(１４ｈ)ｓｔａｇｅｓ３㊀讨论㊀㊀由于ＲＮＡ易降解㊁小鼠卵母细胞ＲＮＡ含量低及样品收集困难等原因ꎬ利用ｑＰＣＲ技术在卵母细胞或胚胎中进行基因表达检测具有一定困难.针对小鼠卵母细胞㊁胚胎等微量样品的基因表达测定ꎬ建立一种高效㊁稳定且灵敏度高的ｑＰＣＲ体系尤为重要.引物的设计是影响ｑＰＣＲ质量的最关键因素之一ꎬ准确可靠的定量取决于使用有效的引物[１３].本研究针对ＧＰＲ５０和管家基因设计了多条引物ꎬ为ｑＰＣＲ准确性奠定了基础.同时ꎬ对于微量ｍＲＮＡ的定量ꎬ最优的敏感性和重复性分析是建立在最优引物浓度的基础上.本研究以Ｃｔ值最低和荧光信号最强为标准ꎬ筛选的最优引物终浓度为０.３μＭꎬ其选择标准与Ｍ.Ｒ.Ｇｒｅｅｎ[１４]等人一致.根据绘制的标准曲线ꎬ本研究模板浓度和Ｃｔ值具有良好的线性关系.本研究建立的ｑＰＣＲ方法敏感性优于普通ＰＣＲ的敏感性ꎬ符合之前的研究结果[１５－１７].在对特异性的结果进行评估时ꎬ发现将兔卵母细胞㊁鸡卵母细胞及牦牛卵母细胞进行ｑＰＣＲ时均无法产生信号ꎬ证明该ｑＰＣＲ方法特异性良好.而对重复性进行评估时ꎬ组间变异系数和组内变异系数均小于１％ꎬ证明所建立的ｑＰＣＲ方法重复性较高ꎬ可用于后续试验.据报道ꎬＧＰＲ５０在哺乳动物各组织中广泛表达ꎬ尤其在脑组织㊁生殖器官及胎盘中表达量最高[１８].ＧｒüｎｅｗａｌｄＥ[１９]等人发现ꎬＧＰＲ５０在小鼠胚胎第１３ｄ(Ｅ１３)开始表达ꎬ到第１８ｄ(Ｅ１８)达到峰值.而在胚胎第１３ｄ(Ｅ１３)时ꎬ原始生殖细胞正处于增殖阶段ꎬ随后形成卵原细胞ꎬ之后形成原始卵泡[２０].因此ꎬＧＰＲ５０在卵泡的发育过程中可能发挥着重要的作用.颗粒细胞与卵母细胞可进行ｃＧＭＰ交换[２１]ꎬｃＧＭＰ进入卵母细胞后可通过影响ｃＡＭＰ进而影响卵母细胞的发育[２２]ꎬ该过程为原始卵泡的形成奠定了基础.ＧＰＲ５０作为膜蛋白受体ꎬ可能间接参与了ｃＧＭＰ的扩散过程ꎬ同时与调控ｃＧＭＰ的ＣＮＰ－ＮＰＲ２信号通路[２３]具有潜在的联系.而目前还没有学者对ＧＰＲ５０与卵泡发育的关系进行研究ꎬ具体的分子机制和信号通路还有待挖掘.根据姚颖[２４]等人的研究ꎬＧＰＲ５０基因在牦牛卵母细胞ＧＶ期就有表达ꎬ并在成熟过程中逐渐升高ꎬ在ＭＩＩ期达到顶峰ꎬ且极显著高于ＧＶ与ＧＶＢＤ期(Ｐ<０.０１).本研究通过收集ＧＶ㊁ＧＶＢＤ㊁ＭＩ㊁ＭＩＩ期的小鼠卵母细胞ꎬ利用ｑＰＣＲ技术测定ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞发育过程中的表达情况.结果表明ꎬＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞减数分裂各阶段均有表达ꎬ其表达量随卵母细胞的发育逐渐升高且于ＭＩＩ期时达到顶峰ꎬ其表达规律与姚颖[２４]等人的研究结果保持一致.但不同的是ꎬＧＶ到ＧＶＢＤ进程中ＧＰＲ５０表达量显著增高ꎬＧＶＢＤ到ＭＩ进程中ＧＰＲ５０表达量缓慢升高ꎬＭＩ到ＭＩＩ进程中表达量显著升高ꎬ这可能是小鼠和牦牛物种差异导致的结果.本研究对ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞发育过程的亚细胞定位研究得知ꎬＧＰＲ５０在细胞质和细胞膜广泛表达ꎬ且随着卵母细胞的发育ꎬＧＰＲ５０表达量逐渐升高ꎬ在成熟卵母细胞中广泛分布在细胞膜区域.姚颖[２４]等人发现ꎬＧＰＲ５０在牦牛卵母细胞中的分布主要集中于细胞膜ꎬ且随着卵母细胞的发育逐渐向细胞质弥散３５２西南民族大学学报(自然科学版)第４９卷分布ꎬ而在小鼠卵母细胞中ꎬＧＰＲ５０广泛分布在细胞质和细胞膜ꎬ这可能是小鼠和牦牛物种差异导致的结果.同时ꎬＧＰＲ５０在ＣＡ１－３锥体细胞㊁齿状回的颗粒细胞及神经元相关细胞的分布主要集中于细胞膜和细胞质[１９ꎬ２５]ꎬ与ＧＰＲ５０在卵母细胞的亚细胞定位一致ꎬ这表明ＧＰＲ５０作为膜受体蛋白在细胞信号传导过程中具有重要的作用.４㊀结论㊀㊀本研究基于ＧＰＲ５０基因和小鼠卵母细胞建立了一种准确高效的实时荧光定量ＰＣＲ方法ꎬ该方法重复性高㊁特异性强㊁灵敏度高ꎬ可用于ＧＰＲ５０在小鼠各时期卵母细胞相对表达量的测定ꎻ随着卵母细胞的发育ꎬＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞的表达量逐渐增高ꎬ到ＭＩＩ期到达顶峰ꎻＧＰＲ５０主要分布于小鼠卵母细胞的细胞质和细胞膜.本研究结果为解析ＧＰＲ５０在小鼠卵母细胞减数分裂进程的分子机制提供依据.参考文献[１]ＭＡＵＲＩＣＥＰꎬＧＵＩＬＬＡＵＭＥＪＬꎬＢＥＮＬＥＵＬＭＩ－ＣＨＡＡＣＨＯＵＡＡꎬｅｔａｌ.ＧＰＣＲ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓꎬｍａｊｏｒｐｌａｙｅｒｓｏｆＧＰＣＲｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｙꎬ２０１１ꎬ６２:３４９－３８０. 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不同屠宰方式山羊卵巢卵母细胞的体外成熟比较
的体外成熟。
关 键 词 ： 方式； 屠宰 山羊； 卵巢； 细胞 ； 卵母 体外成熟
卵 母 细 胞 的 体 外 成 熟 是 山羊 胚 胎 生 物 技 术 研 究 的 基 础 ， 充 分 利 用 各 种 卵 巢 来 源 开 展 山 羊 卵母 细 胞 的 体 外 成 熟 研 究 ， 以 可 为 胚 胎 生 物 技 术 发 展 奠 定 坚 实 的基 础 。 １ ｒｔｏ／ Ｐ Ｓ Ｎａ ５ ｔｏ／ Ｎ ＨＣ ３ １ ｍ ／ 肝 素 ＋ ０ ｏ ｌＩ ＨＥ Ｅ － ＋ ｒｏ ｌ Ｉ ａ ０ ＋ Ｏ ｇ Ｌ ｅ ｅ ０ ４ Ｂ Ａ ＋ ６ ｍｇ Ｉ 青 霉 素 ＋５ ／ 链 霉 素 ＋１ ０ｍｇ Ｌ谷 ． Ｓ ５ ／ ０ｍｇ Ｉ ０ ／ 氨 酰 胺 ， 卵液 各 成 分 除 谷 氨 酰胺 、 Ｓ 分 别 为 Ｇ Ｂ ｏ和 Ｒ ｃ ｅ 抽 ＢＡ ｉｃ ｏｈ 产 品 外 ， 他 均 为 Ｓｇ 其 ｉ ｍａ产 品 ； 熟 培 养 液 ： １ ９（ Ｂ ｏ ＋ １ 成 Ｍ ９ Ｇｉｃ ） ０
后 ， 于 卵 巢上 没有 大 卵 泡 的 不 良影 响 ， 时 进 行 超 排 处 理 能 够 由 此 使 同一 卵 泡 波 的生 长 卵 泡 的 生 长 和 成 熟 排 卵 同 步 进 行 ， 样 能 这
够 获 得 产 量 高 和 质 量 好 的胚 胎 。本 研 究 也 证 实 了这 一 观 点 。从
高中生物选修三课件-3.2体外受精及早期胚胎培养
牛卵巢 牛卵巢中采卵
2.精子的收集和获能
1) 收集的方法:
假阴道法、手握法和电刺激等
2) 获能处理:
培养法：把精子放入人工配制的获能液中培养一段时间。 （适用对象：啮齿动物、家兔和猪等）
化学诱导法：把精子放入一定浓度的肝素或钙离子载体A23187 溶液中，化学药物诱导。
无机盐、有机盐 无机盐、微量元素 氨基酸、核苷酸 葡萄糖、氨基酸
维生素、激素
促生长因子
血清
血清、血浆
1.采集的方法有哪些? 2.采集到的细胞能直接受精吗？
2.精子的采集和获能 1.采集的方法有哪些?
2.采集到的精子能直接和卵子受精吗？
3.受精
在体外受精要准备什么条件？
1.卵母细胞的采集和培养
方法一：超数排卵法
用促性腺激素处理，使供体母畜的卵巢超数排卵，之后从输 卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。
（适用对象：牛、羊等）
3.受精
在获能溶液或专 用的受精溶液 中完成受精过 程
目的是增加精子的浓度
使卵母细胞发育至减 数二次分裂中期
二 胚胎的早期培养
概念：应用人工创造条件，对获取的早期胚胎 进行体外 培养。 盐类：无机盐和有机盐
培养液成分： 营养物质：氨基酸、核苷酸
调节物质：维生素、激素 特有物质：动物血清
3.2 体外受精和早期胚胎培养
试管动物技术： 通过 人工操作 使卵子和精子在 体外条件 下成熟
和受精，并通过培养发育成 早期胚胎 后，再经 移植 产 生后代的技术。 优点是：大量快速繁殖
试管动物技术的三个基本操作环节： 第一步：体外受精
第二步：早期胚胎培养
第三步：胚胎移植
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添加卵泡刺激素 （FSH）培养
添加人绒毛膜促性 腺激素（hCG）培养
联合使用FSH和hCG 当体外培养卵母细胞时，联合使用FSH和hCG可进一步 提高获卵数、卵母细胞成熟率、种植率和临床妊娠率
三、卵母细胞体外成熟技术的优化和 临床应用评估
一般来讲，未成熟卵子需要在体外培养24～48小时，国际报道 的成熟率可以达到60～75%。这些体外成熟卵子可以体外受精 发育成胚胎，进行宫腔移植。
图1 调节垂体生长激素释放（引自 Kojima M and Kangawa K,2005)
图2 人和大鼠Ghrelin的结构（引自 Kojima M and Kangawa K,2005)
2 Ghrelin的结构及其分布
调节细胞 增殖分化
影响食物摄 入、睡眠和 行为
影响心脏 功能与血 管阻力
刺激GH、 ATCH、PRL 的分泌
卵巢多囊综合征 （PCOS）患者
目 前 应 用
卵巢高度反应有卵巢过度 刺激综合征（OHSS）病史
卵巢不适于药物刺激而本 身又没有成熟卵泡生长 对自然周期IVF治疗同时取 出其余小卵泡（IVF/IVM）
一、卵母细胞体外成熟的定义、应用及其 发展现状
3、体外成熟技术安全吗？
这同样也是我们医护人员们最为关心 的问题。 IVM出生的孩子遍布世界各地， 目前全世界大概有5000～10000名体外成熟 卵试管婴儿健康成长。其妊娠率可达到与 体内成熟卵相当（35～50%）。结果表明， 较其他辅助生殖技术，IVM技术并没有增加 子代异常的风险 但是，毕竟卵母细胞体外成熟技术， 将使卵子暴露于体外条件更长时间，理论 上增加了卵子受培养环境影响的风险，在 基因编程、表观遗传学、伦理学等方面， 还需要更加深入的研究和探索。因此目前 该技术只是适用于特殊人群，还没有普及 到每一例试管婴儿
（图：胚胎发育的不同阶段）
三、卵母细胞体外成熟技术的优化和 临床应用评估
1、卵母细胞体外成熟技术的优化
培养液的优化： 将未成熟的小窦状卵泡从人体内取出后，卵母细胞所处环境即发 生变化，与其直接接触的培养液成分将对卵母细胞的发育、成熟、 受精能力等产生重要的影响。
适当添加促性腺激素Gn 有助于获取高质量的IVM的卵母细胞 添加促性腺激素释放激 可促进人IVM的卵母细胞的成熟和排卵 素GnRHa 添加表皮生长因子EGF 添加减数分裂抑制剂 添加cAMP因子 可增加人IVM的成功率 可延迟IVM的卵母细胞减数分裂的恢复 可促进减数分裂的发生，有利于IVM的卵 母细胞的发育
2褪黑素受体及其信号通路
MT1和MT2褪黑素受 体信号通路： A:褪黑素和MT1受体 结合后激活两条通 路，通过Gq偶联受 体α-亚单位抑制 cAMP的合成及通过 βr亚单位增强憐酸 肌醇的分解。 B：MT2褪黑素和结 合后的信号通路。
3 褪黑素对卵母细胞成熟的影响
褪黑素具有抗氧化活性，褪黑素能通过多条途径降低氧 化应激，是一种高效的自由基清除剂。 图为褪黑素在卵泡中的作 用示意图。 褪黑素可以调控卵泡壁细 胞和颗粒细胞固醇类合成 酶的表达而影响类固醇激 素的分泌。褪黑素同时可 以调控LHmRNA的表达， Bcl2和Casp3的生成，IGF和 TGF-β的活性和成熟透导激 素的活性。褪黑素能调节 颗粒细胞SOD、Gpx和CAT 的表达。过多ROS的会引 起凋亡和卵泡闭锁，而卵 泡内的视黑素可以直接或 间接清除ROS而抑制卵泡 闭锁，从而使卵泡继续发 育为优势卵泡。
卵母细胞体外成熟的 机制与临床应用
主讲人：郑月慧 南昌大学江西医学院 2017年7月8日
我将从以下三个方面陈诉：
一、卵母细胞体外成 熟的定义、应用及其 发展现状 二、卵母细胞体外成 熟的机理及其调控 三、卵母细胞体外成 熟技术的优化和临床 应用评估
一、卵母细胞体外成熟的定义、应用及其 发展现状 IVM Treatment
三、卵母细胞体外成熟技术的优化和 临床应用评估
1、卵母细胞体外成熟技术的优化
授精方式的优化：
体外成熟卵子的体外授精：既可采用常规体外授精技术完 成受精，或用单精子卵胞浆内注射（ICSI）技术授精。为了 提高受精率，卵子体外成熟后一般建议选择ICSI授精方式。
单精子显微注射流程图
三、卵母细胞体外成熟技术的优化和临床 应用评估
1、什么是卵母细胞的 第一步：取出 未成熟卵母细胞 体外成熟技术？
体外培养至成熟
卵母细胞的体外成 熟技术(IVM)是一项辅助 生殖技术，简单地讲就 是，将卵巢小卵泡中的 未成熟卵子取出，放在 模拟体内卵泡微环境的 培养液中进行体外培养 到成熟阶段，排出第一 极体，再进行体外授精 技术帮助受精，体外受 精过程与体内成熟的卵 子大同小异。
白黎芦醇能改善卵 母细胞线粒体的功能；
白黎芦醇减少纺锤 体染色体的异常率从而 改善卵母细胞的质量
图一
10X
20X
40X
图二
10X
40X
40X
LH通过EGF旁分泌作用介导卵丘细胞Activinβ A、FS 表达调控卵母细胞核成熟模式图
二维培养
三维培养
“两步法”
3、IVM实施方案 • 根据Gn使用情况，将IVM实施方案大致分为以下几种：
经典IVM方式 最早的IVM技术方案中不加入任何Gn。当卵泡直径达 到10～12 mm而未形成优势卵泡时结束培养。该方案 不仅适用于PCOS患者，还适用于排卵正常的个体 FSH对卵泡发育和卵母细胞成熟十分重要，FSH水平不 足或缺乏会影响排卵。在培养时加入小剂量FSH可增加 获卵数、体外培养成熟率以及妊娠率。一般在体外培 养的第3天加入100～150 U的FSH，连续3d至卵泡达到 10～12 mm 在培养时，加入hCG（一般为10000 U）有助于卵母细 胞减数分裂的恢复，并能够增加妊娠率。
二、褪黑素对卵母细胞成熟的影响
1褪黑素的结构及其分布 2褪黑素受体及其信号通路 3 褪黑素Ghrelin对卵母细胞成熟的影响
1 褪黑素的结构及其分布
褪黑素（Melatonin, MT），化学结构为乙酰基甲氧基色胺，分子量为， 是首先在松果体中发现的一种胺类物质，褪黑素合成前体是色氣酸
延缓衰老 主 要 用 途 抗击肿瘤 调节免疫 改善睡眠
1 Ghrelin的结构及其分布 2 Ghrelin受体的信号通路及其分布 3 Ghrelin对卵母细胞成熟的影响
1 Ghrelin的结构及其分布
Ghrelin的结构 哺乳动物中，Ghrelin被发现是 一种协调能量和生殖活动平衡 的促进食欲的胃肠激素，是生 长激素促分泌物受体（Growth hormone secretagogue receptor， GHS-R ）的内源性配体 Ghrelin是28个氨基酸组成的肽， 其第三个丝氨酸是N端酰化的， 这是ghrelin活性所必需的。大鼠 和人类的Ghrelin只有两个氨基 酸残基的差异
1、卵母细胞体外成熟技术的优化
• 胚胎移植前的优化：
移植前胚胎的辅助孵 出（AH）：就是采用 激光在胚胎的透明带 上产生一个薄弱点， 辅助囊胚易于孵出着 床。因为卵子体外成 熟的培养时间较长， 理论上卵子的透明带 结构可能比较厚硬， 为了提高着床率，移 植前往往建议进行胚 胎的辅助孵出。
三、卵母细胞体外成熟技术的优化和临 床应用评估
IVM取卵时间：
由于未成熟卵母细胞主要来源 于小卵泡，所以取卵技术略不同 于含有成熟卵子的大卵泡。取卵 难度相对大一些，因为卵巢游动 度较大，患者容易产生不适，所 以一般都在麻醉下完成取卵。一 般每个患者大约可以取到7～30余 个不成熟卵子。 卵泡越小，卵母细胞恢复减数 分裂进而发育成熟的能力越弱， 但体积较大的优势卵泡可分泌大 量雌激素而引起周围卵泡闭锁。 因此，过早或过晚结束培养都会 对卵母细胞的质量产生不利影响。 目前，一般在卵泡直径达到10～ 12 mm时结束培养
Ghrelin
影响能量 代谢和糖 代谢
影响胃酸 分泌与胃 运动 影响胰腺外 分泌和内分 泌功能
影响生殖功能
2 Ghrelin受体的信号通路及其分布
Ghrelin受体（GHS-R）是典型的七次跨膜G蛋白偶联体，受体有7次跨膜 的α螺旋区和3个细胞内和外的氨基酸环 GHS-R和GHRH引起GH释放的信号通路（引自 Teresa Lorenzi et al.）
2、卵母细胞体外成熟技术的临床应用评估
术前不需要应用昂贵药物刺激，可以 避免药物治疗副作用，大大减少费用 且降低本病常见的促排卵引起的卵巢 过度刺激综合征风险
由于卵泡未成熟体积小，取卵需要特 定装备与高超技术，培养技术也非同 一般，体外受精则必需显微操作
优点
缺点
一、Ghrelin对卵母细胞成熟的影响
三、白藜芦醇对卵母细胞成熟的影响
1 白藜芦醇的结构及其性质 2 白藜芦醇作用相关信号通路及其分布 3 白藜芦醇对卵母细胞成熟的影响
1 白藜芦醇的结构及其性质
白黎芦醇 （Resveratrol，RES) 是一类多龄类化合 物，存在于红色葡 萄皮、红酒或其他 的植物提取物中。
分子式
相 关 保 健 品
第二步： 体外受精
第三步： 胚胎移植
一、卵母细胞体外成熟的定义、应用及其 发展现状
2、未成熟卵体外成熟技术 的应用及其发展
上世纪九十年代，试管婴 儿之父——爱德华兹先生就把卵 母细胞体外成熟技术（IVM）， 作为辅助生殖技术未来发展的 三大前景技术之一，其它两个 技术是微刺激和自然周期试管 婴儿技术。 近十余年来，IVM技术遍布 全世界，对于一种不用或减少 卵巢刺激，提高患者舒适度的 治疗理念，人们一直在努力尝 试更好的体elin作用ERK1/2和PI-3激酶信号通路（引自 Choi K et al.）
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI-3激酶是主要参与激活核 转录因子以控制细胞增殖，分化和凋亡的丝氨酸/苏氨酸激酶
3 Ghrelin对卵母细胞成熟的影响
Ghrelin蛋白在牛卵母细胞胞质中表达，而GHS-R蛋白则 特异性的定位于卵母细胞膜表面，在卵丘细胞中均有 Ghrelin和GHS-R蛋白表达。 体外成熟过程中卵母胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA相对表达 量随着成熟进程显著下降 FSH抑制卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA表达，而FSH显 著促进卵丘细胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA表达；FSHBI解除FSH 对卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA表达的抑制作用和FSH对 卵丘细胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA表达的促进作用