反相色谱法用的乙腈与甲醇的区别
方法开发小常识
HPLC1、甲醇、乙腈1）乙腈紫外吸收较甲醇低，特别是在低波长处。
2）乙腈比甲醇柱压低3）与水混合时，混合溶液的极性变化。
乙腈，比例与极性线性变化。
甲醇，非线性。
4）纯乙腈的洗脱能力比纯甲醇强。
同比例的乙腈水比同比例的甲醇水洗脱能力强。
5）乙腈与水混合，吸热，溶液温度低，在缓慢恢复至室温时产生气泡。
甲醇与水混合，放热。
气泡容易放出。
6）乙腈价格高。
总结：开发方法时，优选乙腈。
但要注意气泡可能对基线造成的影响。
最终可以考虑甲醇替代乙腈，以降低成本。
2、缓冲盐1）流动相pH值得改变可影响弱酸弱碱的保留时间，对酯等中性化合的保留时间基本无影响。
一般规律是抑制电离，保留时间增加。
2）磷酸盐比醋酸盐的紫外吸收低3）钾盐比钠盐的溶解度高。
4）一般浓度为几十个mmol/L。
太低缓冲能力达不到，太高盐析出。
5）如果要用MS检测技术，一定选用挥发性缓冲体系，例如，甲酸铵体系。
6）强的酸、碱一般不能用调节pH的方法改变保留。
选用相应的离子对试剂。
1、实验室必备，弱极性，中等极性，强极性三根柱子。
2、降低温度可以延长保留时间。
但是对于甲醇，乙醇这种极性溶剂来讲，换极性色谱柱更有效增加保留时间。
3、水做溶剂，直接进样。
最大的压力不是来自于对色谱柱的的损伤。
而是在常用溶剂里面水的蒸发膨胀系数最大。
1μl的水蒸发后气体体积在1000μl以上。
而安捷伦气相的进样衬管体积不到900μl。
多于的体积会四散流走。
有可能向来气方向扩散，造成管路污染,精密度差，基线升高，甚至鬼峰出现。
而通过清洗进样口是无法消除，必须换管路。
4、GC难点不是开发方法本身，而是在于仪器设备的维护。
建议动手能力强、思维活跃的男生来做GC。
流动相的选择技巧
流动相的选择技巧LG GROUP system office room 【LGA16H-LGYY-LGUA8Q8-LGA162】流动相的选择技巧常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。
但是有时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试是一个很好的选择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。
对流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加盐，从而改善峰形、提高分离度。
流动相里加碱的情况比较少，主要还是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波长下没有紫外吸收，而三氟乙酸在低波长下有，但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行，所以单纯做液相，低波长下磷酸最合适，三氟乙酸有吸收，运行梯度时基线漂移很严重，而做液质就要考虑首选三氟乙酸了，近些年还比较流行加甲酸或乙酸。
一般情况下这几种酸没有太大区别，我们更多的是考虑通过加酸改变流动相的pH值，从而改善样品的分离度和峰形。
相同进样量样品峰越高则意味着峰形越好，从图中可以看出多数样品在低pH值下峰形都比中性要好，这个主要是由色谱柱本身的性质所决定的。
色谱柱主要都是硅胶基质，现有的填料处理工艺无法将硅胶上残余的硅羟基全部去除，硅羟基会造成样品峰拖尾，一般认为硅羟基的pKa在到之间，低pH值能帮助抑制硅羟基的活性，减小拖尾，从而改善峰形，提高分离度。
反相色谱柱常用溶剂
反相色谱柱常用溶剂
反相色谱柱常用溶剂包括以下几种：
1. 乙腈：乙腈是反相色谱中最常用的溶剂之一，具有良好的溶解性能和洗脱能力，能够适应各种样品的需求。
2. 甲醇：甲醇与乙腈类似，也是一种常用的溶剂，具有良好的溶解性和洗脱能力。
3. 水：水在反相色谱中起到双重作用，既可以作为溶剂用于洗脱样品，又可以作为移动相的组成部分，调节柱内相互作用。
4. 醋酸：醋酸一般用于调节移动相的酸碱度，可以改变离子对分离的选择性。
5. 磷酸盐缓冲溶液：磷酸盐缓冲溶液也常用于调节移动相的酸碱度，而且可以提供足够的离子强度以增加样品保持在柱上的时间。
除了以上常用溶剂外，还有一些特殊的溶剂在反相色谱中有特定的应用，如二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)等。
色谱专用溶剂
色谱专用溶剂
色谱专用溶剂主要用于色谱分析中，作为流动相，帮助分离样品中的各个组分。
以下是一些常见的色谱专用溶剂及其应用：
1. 水：在高效液相色谱（HPLC）中，水是最常用的溶剂，尤其在生物化学和环境分析中。
它可以与许多有机化合物混溶，有助于样品的分离。
2. 甲醇：在气相色谱（GC）和液相色谱（HPLC）中，甲醇是一种常用的强溶剂，尤其适合分离极性化合物。
3. 乙腈：在液相色谱中，乙腈是一种常用的中等强度溶剂，适合分离多种有机化合物。
4. 丙酮：在气相色谱中，丙酮是一种常用的溶剂，特别适合分离含氮和含硫的化合物。
5. 二甲基甲酰胺：在液相色谱中，二甲基甲酰胺是一种常用的强溶剂，尤其适合分离多肽和蛋白质。
6. 醋酸：在液相色谱中，醋酸常被用作添加剂，调节流动相的pH值，影响样品的离子状态，从而实现更好的分离效果。
以上就是一些常见的色谱专用溶剂及其应用。
需要注意的是，选择合适的溶剂需要考虑到样品的性质、分析的目标以及色谱仪的性能等因素。
实验里常用的乙腈和甲醇在色谱分析中的区别
实验里常用的乙腈和甲醇在色谱分析中的区别乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)是在反向色谱柱方法开发中广泛使用的两种常见溶剂。
所以，除了知道乙腈比甲醇有更高的洗脱能力这一事实外，色谱分析人员还应该知道其他的特性吗?让我们来讨论一些所有色谱专家都应该知道的问题。
首先，对流动相溶液的准备提出几点意见。
只有纯水溶液部分才能正确调整pH值。
不要尝试测量或调整有机或有机混合物的pH值。
制备二元混合物的方法有两种，即V/V流动相溶液。
方法#1是用特定体积的“A”溶液填充一个量瓶，然后用“B”溶液将量瓶填满。
方法#2是用指定数量的“A”溶液填充量筒(或容量瓶)；用指定数量的“B”溶液填充第二个量筒(或容量瓶)，然后将两者的内容混合在一起。
无论您使用哪种方法，请在您的高效液相色谱法中完整地记录它，以便任何阅读它的人都能准确地复制它。
上面描述的两种方法在设计上都是正确的，但是会产生不同性质的结果。
紫外线吸光度对于HPLC级溶剂(我们在HPLC分析中应始终使用HPLC级溶液)，乙腈的吸光度在这两种溶剂中最低，非常适合低紫外光分析。
甲醇在205-210nm左右有较高的紫外光吸收值，在非常低的紫外光范围内略有限制。
溶剂溶解性乙腈和甲醇在溶解多种缓冲盐和样品的能力上存在显著差异。
这些差异在方法开发中至关重要。
1.流动相溶解度梯度运行显示低重现性或失败的一个常见原因可能与运行高浓度缓冲液和高浓度有机溶液有关。
而含有浓度小于10mM盐溶液的水溶液/有机溶液在大多数梯度条件下不太可能沉淀（最多98%是有机溶剂，而不是100%)，大多数与高效液相色谱应用一起使用的缓冲溶液会有更高的盐浓度，当分析条件中有机溶剂含量较高时可能会从溶液中析出（导致堵塞，泄漏，插头和不准确的结果）。
在反向色谱法中选择有机组成时要谨慎。
确保使用的溶液在所有浓度下都是稳定的。
还要验证缓冲能力是否仍然存在，当使用高有机浓度时(当缓冲液被稀释时)。
不确定盐是否会溶解?只要把同样浓度的溶剂混合起来做测试就行了。
甲醇和乙腈在反相液相色谱中作用的（介绍，静电强度，选择性，结论）
甲醇和乙腈在反相液相色谱中作用的（介绍，静电强度，选择性，结论）甲醇和乙腈在反相液相色谱中作用的介绍反相流动相通常包含水和极性较小的有机溶剂（有机改性剂），以及诸如缓冲液，酸或碱之类的添加剂。
在反相状态下，流动相的水相组分的洗脱强度较弱，而有机相的洗脱强度较高。
因此可以调节水和有机物的相对比例，以控制分析物的保留。
多种有机溶剂适合用作反相液相色谱中的有机改性剂，尽管在实践中，常规仅使用了少数几种。
在选择有机溶剂时，必须考虑诸如与水的混溶性，极性，紫外线阻隔性，粘度和安全性等特性。
每种有机改性剂都有其优缺点，应在使用前加以考虑。
例如，四氢呋喃（THF）和异丙醇（IPA）都可以使用，因为它们均提供了高洗脱强度。
但是，由于IPA的高粘度（导致较低的性能和较高的背压），因此IPA的使用受到限制，而THF会降低泵的密封性以及PEEK管路和配件，并需要使用稳定剂（例如BHT）来防止过氧化物的形成。
丙酮是一种廉价的溶剂，多年来，乙腈和甲醇已成为许多反相应用中选择的两种有机改性剂。
两种溶剂都可以与水完全混溶，并且与常见的流动相添加剂和缓冲液兼容（尽管在有机成分较高的情况下使用缓冲盐时应格外小心）。
两种溶剂都有其优点和缺点，最终改性剂的选择通常取决于应用。
例如，乙腈的成本明显高于甲醇，而甲醇的毒性也较小。
但是，乙腈的紫外截止值要比甲醇低（190 nm和205 nm），这使其更适合用于需要低UV检测波长的应用中（但是请注意，对于LC，使用HPLC级或更好的溶剂很重要分析）。
此外，乙腈/水混合物的粘度低于甲醇/水混合物，因此在LC色谱柱上产生的背压要低得多。
人们通常认为这种较低的背压是有利的，因为它对LC系统组件和色谱柱施加的压力较小，并提供了增加流速和减少运行时间的余地。
甲醇和乙腈在反相液相色谱中作用的静电强度对于反相色谱，乙腈比甲醇具有更高的洗脱强度，因此，对于有机物与水等比例的样品，保留的分析物保留时间较短。
在此示例中，对于这些中性分析物的分离，使用甲醇/水可获得大约1.7倍的保留时间。
液相流动相缓冲盐选择讲解学习
液相流动相缓冲盐选择下面内容综合了Agilent和网上查到的一些资料：一般来说，反相HPLC的流动相包括有机相和水相，有机相常用的为色谱甲醇和乙腈，不太常用的还有四氢呋喃和异丙醇。
甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。
但是当样品峰形不好或者分离不好时，更换溶剂是一个很好的选择，因为不同的溶剂可提供不同的选择性。
在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。
对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化，因此控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要，通常在pH2~4的条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高，因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。
考虑到重现性，所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH单位。
当待分析物pKa 或pKb未知时，应测试一种以上流动相pH（如pH2.0和pH6.5缓冲盐溶液），可提供最好结果。
对流动相的优化主要体现在水相上。
流动相pH值对色谱分离的影响有多钟方式，根据待分析物的结构性质，pH可能影响选择性、峰形和保留。
如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。
如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随pH改变非常明显。
（1）酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。
了解分析物的pKa，才能有效的选择流动相pH。
缓冲范围应在其缓冲液离子pK值±1 pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。
例如，醋酸盐的pKa 为4.8，缓冲范围为pH3.8~5.8。
甲醇乙腈学习资料
甲醇乙腈截止波长的区别，用甲醇做，紫外波长须设在大于230nm，乙腈则大于210nm即可。
甲醇的极性参数是5.1，乙腈的是5.8，水的极性参数是10.2，用一定比例的乙腈和水代替纯甲醇，极性会更强呀给你一个计算公式：C乙腈=0.32*C甲醇*C甲醇+0.57*C甲醇以上公式是为保持相同的保留时间，乙腈、甲醇的比例换算公式，其中C乙腈、C甲醇分别为乙腈/水、甲醇/水的百分比。
从上式可以算出，纯甲醇相当于89%的乙腈/水，90%的甲醇/水相当于77%的乙腈/水。
对反相色谱来说，70%乙腈/水的极性比90%甲醇/水的极性强，对溶质的洗脱能力减弱，因而保留值增大，出峰晚。
但不能只考虑溶剂的强度，还必须同时考虑到对选择性的改变，即“溶剂诱导选择性的变化”，有时极性相近的不同溶剂系统对某一具体样品的分离效果有很大的差异，这个溶剂组成能分离，同样极性的另一组溶剂可能就不能分离。
1、首先，乙腈价格高乙腈，特别是HPLC级的价格很高，但是，文献或LC厂家所示的条件，多用乙腈，这是为什么呢？现就此谈谈。
2、吸光度。
乙腈HPLC级的小。
乙腈和甲醇的市销HPLC级和优级的吸收光谱中，乙腈HPLC吸收最小（特别是在短波长上小）。
所谓HPLC级是除去具有吸收UV的杂质，在规定的波长上吸光度限制在规格值以内。
在UV 检测时，产生的噪声小，因此在进行UV短波长上的高灵敏度分析时乙腈HPLC级最适宜。
另外，在UV检测中的梯度基线上也是乙腈HPLC级产生鬼峰少，虽然，其他与水相溶性高的有机溶剂有各种各样，但很难能找到比乙腈HPLC级吸收更小的。
另外，甲醇的HPLC级和优级，虽然所得的光谱相差不大，但是优级不能保证吸光度，有可能产生偏差，价格也相差不大，所以尽量使用HPLC级。
3、压力。
乙腈低，柱内承受的压力，根据有机溶剂的种类或混合比率的不同而异，水/乙腈，水/甲醇混合液的比率与输液压力的关系中,甲醇与水混合，压力增高，而乙腈同样与水混合且并不如此。
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反相色谱法用的乙腈与甲醇的区别
乙腈又名甲基腈，无色液体，极易挥发，有类似于醚的特殊气味，有优良的溶剂性能，能溶解多种有机、无机和气体物质。
有一定毒性，与水和醇无限互溶。
1、首先，乙腈价格高乙腈，特别是HPLC级的价格很高，但是，文献或LC厂家所示的条件，多用乙腈，这是为什么呢?现就此谈谈。
2、吸光度乙腈HPLC级的小。
乙腈和甲醇的市销HPLC级和优级的吸收光谱中，乙腈HPLC吸收最小(特别是在短波长上小)。
所谓HPLC级是除去具有吸收UV的杂质，在规定的波长上吸光度限制在规格值以内。
在UV检测时，产生的噪声小，因此在进行UV短波长上的高灵敏度分析时乙腈HPLC级最适宜。
另外，在UV检测中的梯度基线上也是乙腈HPLC级产生鬼峰少，虽然，其他与水相溶性高的有机溶剂有各种各样，但很难能找到比乙腈HPLC级吸收更小的。
另外，甲醇的HPLC级和优级，虽然所得的光谱相差不大，但是优级不能保证吸光度，有可能产生偏差，价格也相差不大，所以尽量使用HPLC 级。
3、压力乙腈低，柱内承受的压力，根据有机溶剂的种类或混合比率的不同而异，水/乙腈，水/甲醇混合液的比率与输液压力的关系中，甲醇与水混合，压力增高，而乙腈同样与水混合且并不如此。
所以，乙腈一方，在同样的流速下不在柱内加上多余的压力。
从上述两项，可以确认使用乙腈的意义，那么，甲醇除了价格以外，还有没有其化优点呢?
4、洗脱能力一般而言，乙腈较强。
乙腈和甲醇分别用同样的比率与水混合时，一般情况下，乙腈的洗脱能力强。
特别是混合比率低时，从咖啡因和苯酚的洗脱来看，获得同样的保留时间，乙腈的比率，只需甲醇的比率的一半以下即可。
另一方面，有机溶剂100%或与此极接近时，从胡萝卜素和胆甾醇来看，常常都是甲醇的洗脱能力强。
混合比在50比1等较为特殊时，调制的误差大，影响保留时间，或平衡化的时间长，乙腈遇到这种情况时，用甲醇的10比1混合代替乙腈，这样操作方便些。
溶剂受温度影响时，不采用容器定量，而采用重量的方法(考虑比重)，可使混合比的误差减小。
5、分离(洗脱)的选择性两者的差异，乙腈和甲醇在分离的选择性上不同。
由于有机溶剂分子的化学性质(甲醇和乙醇是质子性，乙腈和四氢呋喃是非质子性)不同所致。
因此，在用乙腈类不能获得分离的选择性，就试用甲醇类看看。
6、峰形用时出现差异。
像水杨酸化合物(在邻位上具有羧基或甲氧基的苯酚化合物)等，用乙腈类时拖尾大，用甲醇类可抑制。
可是，一般情况下，聚合物类反相柱，与硅胶柱相比，更具有峰形宽的倾向，特别是用聚苯乙烯分析柱芳香族化合物等时常见。
这在流动相是甲醇时非常显著，而用乙腈时不明显。
为此，用聚合物类反相用柱时建议采用后者(乙腈类)，这是因为乙腈使凝胶膨润。
7、流动相的脱气，乙腈类要注意混合溶剂的置制，不说在LC装置内，只谈预先在流动相瓶内进行时，(等浓度系统)。
甲醇与水混合时发热，多余的溶解空气较易变为脱出气泡(脱气容易)。
而乙腈由于吸热冷却，随着慢慢回到室温，产生气泡，所以要考虑脱气(加温搅拌，过滤膜，He脱气等)。
8、结论以上反相色谱法流动相常用的乙腈和甲醇进行了比较。
粗略地讲是，使用乙腈HPLC级最好，在选择性，峰形差时试用甲醇HPLC，但根据各种不用性质设计分析条件也是必要的。
本文由广州深华实验室仪器设备整合发布。