基因组测序与序列组装
利用生物大数据技术进行基因组分析的步骤和方法
利用生物大数据技术进行基因组分析的步骤和方法随着科技的不断发展，生物大数据技术在生物医学领域中的应用日益广泛。
其中，基因组分析是一项重要的工具，可以帮助我们深入了解生物个体的遗传信息，并在疾病诊断、药物研发和农业改良等领域有广泛的应用。
本文将介绍利用生物大数据技术进行基因组分析的基本步骤和方法。
一、数据获取与预处理：在进行基因组分析之前，需要首先获取并准备好适合分析的生物数据。
数据获取可以通过公共数据库、文献资料或者实验室实施。
常见的基因组数据包括DNA 序列数据、RNA表达数据以及甲基化数据等。
在获取到数据后，还需要进行一系列的预处理步骤来去除噪音和确保数据的质量。
这些步骤包括数据清洗、去除低质量序列、去除污染等。
二、基因组测序与拼接：数据预处理完成后，需要进行基因组测序，以获得目标生物个体的全部DNA 序列信息。
目前常用的测序技术有Sanger测序、454测序、Illumina测序和Ion Torrent测序等。
通过这些测序技术获得的测序片段需要进行数据拼接，将散乱的测序片段重新组装成完整的基因组序列。
拼接步骤需要借助于基因组组装软件，如SOAPdenovo、Velvet和SPAdes等。
三、基因组注释与功能预测：基因组测序和拼接完成后，需要对基因组进行注释，确定基因和其它功能元件的位置和功能。
基因组注释可以通过比对到已知基因库、转录本库和蛋白库等来进行。
常用的注释工具有BLAST、GeneMark、HMMER和TopHat等。
通过基因组注释可以预测出基因的编码区和非编码区，帮助我们深入了解基因的结构和功能。
四、基因差异表达分析：基因差异表达分析是生物大数据技术中常用的分析方法之一，可以帮助我们了解不同基因在不同生物状态下的表达量变化情况，从而找出与特定生物过程或疾病相关的基因。
常用的差异表达分析方法包括DESeq2、edgeR和limma等。
这些方法可以通过统计学模型和假设检验等方法来确定差异表达的基因。
基因组测序实验报告
基因组测序实验报告一、实验背景随着生命科学的快速发展，基因组测序技术已经成为研究生物遗传信息的重要手段。
通过对基因组的测序，可以深入了解生物的基因组成、遗传变异、基因功能以及与疾病的关系等。
本次实验旨在对_____样本进行基因组测序，以获取其详细的遗传信息。
二、实验目的1、掌握基因组测序的基本原理和实验流程。
2、对_____样本进行全基因组测序，获得高质量的测序数据。
3、分析测序数据，查找可能存在的基因突变和遗传变异。
三、实验材料与方法（一）实验材料1、样本来源：＿____2、试剂与仪器：DNA 提取试剂盒测序试剂盒测序仪离心机移液器等（二）实验方法1、 DNA 提取按照 DNA 提取试剂盒的说明书，从_____样本中提取高质量的基因组 DNA。
对提取的 DNA 进行浓度和纯度检测，确保其质量符合测序要求。
2、文库构建将提取的 DNA 进行片段化处理，使其大小适合测序。
对片段化的 DNA 进行末端修复和加接头等操作，构建测序文库。
3、测序将构建好的测序文库加载到测序仪上，进行测序反应。
选择合适的测序模式和参数，以获得高质量的测序数据。
4、数据处理与分析对测序得到的原始数据进行质量评估和过滤，去除低质量的数据。
使用专业的生物信息学软件对处理后的数据进行比对、组装和变异检测等分析。
四、实验结果（一）测序数据质量评估1、测序深度：平均测序深度达到_____X，覆盖度良好。
2、碱基质量：碱基质量值的分布符合预期，大部分碱基的质量值在 Q30 以上。
（二）基因组装结果成功组装出_____样本的基因组序列，与已知的参考基因组相比，具有较高的一致性。
（三）变异检测结果1、单核苷酸多态性（SNP）：共检测到_____个 SNP 位点，分布在不同的染色体上。
2、插入缺失（InDel）：检测到_____个 InDel 变异，其长度和位置分布具有一定的特征。
（四）功能注释与分析对检测到的变异进行功能注释，发现其中一些变异可能与_____疾病的发生发展相关。
基因组的组装及质量评估技术
基因组的组装及质量评估技术基因组是生物学领域内一个非常重要而又复杂的研究对象，是由DNA分子组成的，包含了一个生物整个遗传信息的全集。
这个遗传信息会影响到生物的特征、生物学过程、生物交互作用以及适应性。
因此，了解基因组的组装及质量评估技术对于生物学研究者或者生物工程学家来说都十分重要和关键。
下面，我们将讨论基因组组装和质量评估技术的相关内容。
1. 基因组组装技术当基因组被破解并测序后，就需要进行组装。
组装是指将测序数据按照一定的方式进行拼接，最终得到基因组DNA序列的过程。
但这个过程是十分复杂而且需要一定的计算资源的。
目前，常见的组装方法包括重叠、图形和罚函数等。
在组装过程中，首先需要完成将所有测序数据进行排序，以便于找出共有的序列，即所谓reads。
重叠就是利用reads之间的共同区域进行对齐和匹配，然后拼接生成较长的序列。
图形是利用计算机的图形处理技术，先建立一个图形和可以用来序列化的节点，然后根据节点之间的基因片段来构建图形结构，再对比节点之间的共同区域来将图形连接起来，获得更长的序列。
罚函数是将所有序列视为一个图，利用染色体片段之间的交错特征来拼接。
组装完成后，可以使用一系列工具和技术检查结果的准确性。
这些挑战包括测序数据小RNA定量、同源重复选择和组装错误。
其中，最主要的误差来自数据本身产生的错误，工具可以检测这些错误并将它们分离出来。
其他的挑战包括提高基因组组装的连续性和正确性，以及处理基因组中嵌入的复杂重复区域。
2. 基因组质量评估技术随着高通量基因序列技术的提高和普及，越来越多的基因组数据获得了高水平的测序技术，但数据的可靠性和准确性却变得不可避免地面临了严峻的挑战。
因此，为了准确评估基因组数据的质量和可靠性，需要重点关注基因组质量评估技术。
在基因组质量评估技术中，最重要的一项是数据的评估工具。
不同的评估工具适用于不同类型的数据。
例如，可以使用QUAST来生成全基因组组装萃取基本特征的-基因组中的contig、N50、L50、NGX、ED50、N珂朵妮数、各种Gap大小等等参数。
基因组测序实验报告
基因组测序实验报告简介：本实验旨在通过测序技术对样本的基因组进行测序，以获得DNA 序列信息，并利用这些数据来研究基因组的结构、功能以及与疾病之间的关联。
以下是对实验过程、方法和结果的详细描述。
实验材料和方法：材料：1. 样本 DNA：从细胞中提取的 DNA 样本，采用常规的提取方法获得。
2. 高通量测序仪：使用 Illumina HiSeq 2000 进行高通量测序。
方法：1. DNA 提取：使用DNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤从细胞中提取 DNA 样本。
2. DNA 文库构建：将样本 DNA 进行片段化处理，通过末端修复、加入接头等步骤，构建 DNA 文库。
3. 测序：将构建好的 DNA 文库装入高通量测序仪中，进行测序。
4. 数据处理：经过测序仪的运行后，得到原始的测序数据，需要进行数据处理和分析。
结果及讨论：1. 数据质量评估：对测序得到的原始数据进行质量评估，包括测序质量、测序深度和 GC 含量等。
通过评估，我们可以得出数据的可靠性，并为后续数据分析提供基础。
2. 数据预处理：对原始数据进行去除接头序列、低质量碱基修剪、过滤和去除PCR 重复等预处理步骤，以得到更加干净和高质量的数据。
3. 读长组装：使用序列拼接软件将测序数据进行组装，得到尽可能长的连续序列，称为 contig。
通过 contig 可以获得样本的基因组信息。
4. 基因注释：对得到的基因组序列进行注释分析，包括基因预测、基因功能注释、基因富集分析等，以揭示基因组的结构和功能。
5. 变异检测：通过比对样本的基因组序列与参考基因组序列，识别样本中的变异位点，包括SNP、InDel等。
这些位点的分析可以帮助我们了解个体之间的遗传差异，并探索与疾病相关的变异位点。
6. 结果分析和总结：根据实验的结果进行分析，并结合相关文献资料进行讨论，总结出实验的结果和相关的结论。
结论：本实验通过基因组测序技术对样本进行了测序，并得到了样本的基因组序列信息。
基因组测序与序列组装
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本章内容结束，谢谢!
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假基因(Pseudogene)
起源于功效基因 但已失去活性DNA序列
产生假基因原因有: 1. 由重复产生假基因; 2. 加工假基因, 由RNA反转录为cDNA 后再整合到
基因组中; 3. 残缺基因(Truncated gene)
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重合基因:
动物
真菌 等 细菌
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重复次序
➢ 高度重复次序： 长度：几个——几千个bp 拷贝数：几百个——上百万个 首尾相连，串联排列
集中分布于染色体特定区段（如端粒，着丝粒等）
也称卫星DNA
➢ 中度重复次序： 普通分散于整个基因组中； 长度和拷贝数差异很大
➢ 单一次序：
基因主要位于单一次序
动物中单一次序约占50％
一些已绘制了遗传图与物理图微生物基因 组测序中也采取这一方法.
如高等植物拟南芥基因组测序完全依据克 盛大叠群，先进行各个BAC克隆随机测序，再 进行序列组装；
水稻基因组测序计划采取策略与此相同.
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4.3 指导测序与序列组装
建立在基因组图谱基础上”鸟枪法”,即所谓”指导 鸟枪法”或”指导测序”。
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基因组测序与序列组装
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3.4 非常规测序
毛细管电泳
用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳，节 约时间，加紧测序进程，其它程序同链终止法或 化学测序法。
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基因组学-课件-4基因组测序与序列组装
4.1 DNA测序的方法
• DNA测序技术主要有两种方法，都是在20 世纪70年代中期发明的。 • A. 双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过合成与单 链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA 分子的顺序。 • B. 化学降解法（chemical degradation method），是将双链DNA分子用化学试剂 处理，产生切口，用同位素标记进行测序。
A.通用引物：与载体DNA中 附近插入片段的顺序退火， 可引入新链的合成。 B.内部引物：提供一系列端 部以及内部可完成长序列顺 序的克隆。
中英联合实验室
B.化学降解法
• 基本原理：在选 定的核苷酸碱基中 引入化学基团，再 用哌啶处理使DNA 分子在被修饰的核 苷酸位置降解。
中英联合实验室
同时完成4组反应，A、G、C、T 链终止法：主流技术，易于机械化自动控制 化学降解法：试剂含有毒性主要原因是链终止法。
测序技术的发展
• 放射性同位素标记底物：灵敏度高 • 荧光标记物：灵敏度与分辨力，便于仪器阅 读。一种碱基一种颜色（A红色，G黄色，C 蓝色，T绿色） • 毛细管电泳：取代聚丙烯凝胶平板电泳，96 个泳道，每次可同时进行96次测序，每轮实 验不到2小时，1天可完成近千次反应
• 光点测序pyrosequencing：无须电泳，每 连接dNTP时释放1个焦磷酸，焦磷酸在磷 酸化酶的作用下转换为化学能，发出光亮 。每次只加入1种dNTP • DNA芯片测序：将各种排列顺序的寡聚核 苷酸点在芯片上，DNA分子与芯片温浴， 能杂交的寡聚核苷酸都会在确定位置发出 信号，获取信息进行对比组装。
A.双脱氧链终止法
• 天然的DNA聚合酶不能满足，需要进行改造
宏基因组测序的流程
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1. 样品采集和DNA提取。
从目标环境中采集样品，例如土壤、水或动物肠道。
基因组测序和序列组装-文档资料
得到精细图谱
Thank you！
Sanger 双脱氧链终止 DNA测序法：
利用DNA聚合酶和 双脱氧链终止物测定 DNA核苷酸顺序的方法， 是由英国剑桥分子生物 学实验室的生物化学家 F. Sanger等人于1977年 发明的。
1980年诺贝尔奖金获得者F. Sanger
Sanger 双脱氧链终止DNA 测序法的基本原理：
•聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分 长度只差一个核苷酸的DNA分子。 • 利用DNA聚合酶不能够区分 dNTP和ddNTP的特性，使 ddNTP参入到寡核苷酸链的3’末端。因为ddNTP 3’不是-OH， 不能与下一个核苷酸聚合延伸， 从而终止DNA链的增长。
DNA 样 品 TATGCAATCTAG 与基因芯片上 65,000 种可能的 八聚体进行杂交从而形成特定 的结合图形 1 ATACGTTA CGTTAGAT 22 GTTAGATC
4 CGTTAGAT 4 ACGTTAGA 33 TACGTTAG ACGTTAGA 5 GTTAGATC 1 ATACGTTA 3 TACGTTAG 4 2 5 ACGTTAGA CGTTAGAT GTTAGATC 计算机分析杂交图象 并由探针的重叠情况 推导样品的核酸序列 互补序列为：ATACGTTAGATC 样品序列为：TATGCAATCTAG
Maxam-Gilbert化学降解法的原理： 用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基 的特异性切割。由此产生的一组具有各种不同长度的 DNA链的反应混合物，经凝胶电泳和放射自显影后，直 接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。
碱基特异的化学切割反应
碱基 G A+G
特异修饰方法 Ph8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性 pH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从 而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤 的糖苷键 肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后 易除去 1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶
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3.4 非常规测序 毛细管电泳
用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时 间,加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法.
光点测序
脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA 3’-末端时会释放1 个焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化 学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核 苷酸,当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点,并记录 核苷酸种类;当核苷酸未结合时,反应液中的核苷酸酶 迅速分解此核苷酸,由此来测定DNA序列.
Genome Size (Mb)
Zea mays Homo sapiens Oryza sativa Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana Saccharomyces cerevisiae E.coli 8,000 3,000 400 165 100 12 4.6
化学法测序实例
哌啶
3.3 自动化测序
基本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同 的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红 色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标 记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于 每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而 简化为由1个泳道同时判读4种碱基.
假基因(Pseudogene)
来源于功能基因 但已失去活性 的DNA序列
产生假基因的原因有: 1. 由重复产生的假基因; 2. 加工的假基因, 由RNA反转录为cDNA 后再整合 到基因组中; 3. 残缺的基因(Truncated gene)
重叠基因: 同一段DNA 能携带两种不同蛋白的信息.
重迭基因有以下几种情况：
第一讲 基因组测序与序列组装
任科教师: 余爱丽 生命科学院 分子生物 学与生物信息学系
主要内容:
什么是基因组 什么是基因 DNA测序的方法 DNA序列的组装 人类基因组计划 水稻基因组计划 后基因组学
1. 什么是基因组
基因组就是一个物种中 所有基因的整体组成。 基因组有两层意义：遗 传物质和遗传信息。 要揭开生命的奥秘， 就需要从整体水平研究 基因的存在、基因的结 构与功能、基因之间的 相互关系。
什么是C 值？
通常是指一种生物单倍体基因组DNA的 总量.
在真核生物中，C值一般随着生物的进化而 增加，高等生物C值一般大于低等生物。 C值悖理： 生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比 例增加
阴影部分为一个门内C-值的范围
动物
真菌 等 细菌
重复顺序
高度重复顺序： 长度：几个——几千个bp 拷贝数：几百个——上百万个 首尾相连，串联排列 集中分布于染色体的特定区段（如端粒，着丝粒等） 也称卫星DNA 中度重复顺序： 一般分散于整个基因组中； 单一顺序： 基因主要位于单一顺序 动物中单一顺序约占50％ 植物中单一顺序约占20％ 长度和拷贝数差别很大
D 终止密码子 -------TAATG-------
J 起始密码子
3. DNA测序的方法
链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序
3.1 链终止法测序(the chain termination method) 基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链， 由于合成的互补链可在不同位置随机终止反 应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而 来读取待测DNA分子的顺序。
基因家族
一群具有一致的或相似顺序的基因,有的还担负 类似的生物学功能, 可以相互补偿, 比如:E2f transcription factor
Mouse symbol E2f1 E2f2 E2f3
Human Ortholog E2F1 E2F2 E2F3
E2f4 E2f5 E2f6
E2F4 E2F5 E2F6
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
3.2 化学降解法测序
基本原理: 在选定的核苷酸碱基中引入化学集 团,再用化合物处理,使DNA分子在被修 饰的位置降解.
技术路线
将双链DNA样品变为单链 ↓ 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素 标记,以便显示DNA条带 ↓ 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的 降解DNA群体 ↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序
顺序复杂性
DNA 的复性 遵循二级反应动力学，可表述为： dCt / dt = -KC02
反应达 t 时，单链DNA浓度 = Ct
C0 = 单链 DNA起始浓度 K＝ 复性速度常数
Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 常数
Ct/C0 1
1
0
0
C0t(1/2)
C0t(1/2)
技术路线与要求
制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸
A 高酶活性
B 无5’→3´外切酶活性 C 无3´→5´外切酶活性 ddATP/ddCTP/ddGTP/ ddTTP 的3’碳原子连接 的是氢原子,不是羟基
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性
B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
Maxam-Gilbert 法所用的化学技术
碱基 特异修饰方法
G
A+G
C+T C
Ph8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性 pH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从 而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤 的糖苷键 肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后 易除去 1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶
*一个基因完全在另一个基因内部Biblioteka *部分重叠 * 两个基因共用少数碱基对
*一个基因完全在另一个 基因内部 如：B和A， E和D 其读码结构互不相同
---ATG-----//------AATGCC ----//---ATAACG---//--TAA---A*
B
ATGCCN----NNATAA
*部分重叠 如： K和C *两个基因共用少数 碱基对 如： D和J
C0t(1/2)值与基因组复杂性成正比。
2. 什么是基因？
是遗传信息的物理和功能单位，包含产生 一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸 序列。 基因分类： 编码RNA的基因，如rRNA基因，snRNA 基因等； 编码蛋白质的基因
基因的不连续性
Intron 和Exon:
大多数真核生物蛋 白质基因的编码顺 序(Exon)都被或长 或短的非编码顺序 (Intron)隔开