微生物基因组测序作图流程
测序原理及流程图
测序原理及流程图
测序原理
目前关于测序方法主要采用双脱氧链终止法，双脱氧链终止法又称为Sanger法，其原理是DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下进行复制时，在四管反应体系中分别按一定的比例引入四种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，当ddNTP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。
如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段，相邻的片段长度相差一个碱基。
经放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可获得合成片段的碱基排列顺序。
我们使用的是ABI3730测序仪以及配套的BigDye Terminator Kit，original v3.1我公司目前采用Applied Biosystems 3730XL测序仪是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛。
3730XL可同时分析96个样品，该仪器采用4色荧光同时检测，可不间断24小时运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。
测序流程图。
基因组测序方法和流程
基因组测序方法和流程基因组测序是一种重要的分子生物学技术，用来确定生物个体的全基因组序列。
下面将介绍几种常见的基因组测序方法和其流程。
Sanger测序方法Sanger测序是最早被广泛应用的测序方法之一。
它通过DNA链终止反应来测定DNA序列。
Sanger测序的流程如下：1. DNA片段的扩增：通过聚合酶链反应(PCR)或其他扩增方法，将待测序的DNA片段扩增。
2. 序列反应：将DNA片段与DNA聚合酶、起始引物和四种特殊的二进制核苷酸（即各种类型的氮碱基）一起反应，使DNA聚合酶在复制DNA过程中停止。
这些停止的位置代表了DNA序列中的不同碱基。
3. 凝胶电泳：将反应产物经过凝胶电泳分离，根据酶在不同位置停止的情况，可以逐个测定DNA序列。
454测序方法454测序是一种高通量测序技术，利用酶依赖法合成技术进行测序。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
2. 测序反应：将DNA片段与特殊的引物和酶（即磷酸巯基核苷酸转化酶）一起反应，使每个DNA片段在酶的作用下合成一链自由的DNA。
3. 测序仪读取信号：将反应产物加载至测序仪中，通过光学信号或电信号读取DNA合成时释放的磷酸巯基核苷酸的数目和位置，从而确定DNA序列。
Illumina测序方法Illumina测序是当前最常用的高通量测序技术之一。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
2. 测序反应：将DNA片段和两种特殊的引物一起反应，引物与DNA片段的一端连接，形成桥式PCR产物。
然后，引物依次结合并延伸DNA链，生成补充DNA链。
3. 测序仪读取信号：将反应产物加载至测序仪中，通过荧光信号的强度和位置来确定DNA序列。
测序方法是一种基于单分子实时测序技术的测序方法。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
基因测序绘图实验报告
基因测序绘图实验报告
实验目的：
本实验旨在通过基因测序技术对样本进行绘图分析，以获取样本的基因组信息，进一步研究基因与表型之间的关系。
实验材料：
- 样本：包括DNA或RNA样本。
- 基因测序仪器：用于对样本进行测序。
- 数据分析软件：用于分析测序数据并生成测序图。
实验步骤：
1. 样本准备：从待测序的组织或细胞中提取DNA或RNA，并进行纯化和浓缩。
2. 建库：将提取的DNA或RNA进行片段化，并在片段的末
端添加适配器。
3. 测序：将建好的DNA文库进行测序，可以采用Illumina测
序技术，方法包括Illumina HiSeq、Illumina MiSeq等。
4. 数据分析：将测序得到的原始数据进行质量控制，去除低质量的reads，并将剩余的高质量reads映射到参考基因组上。
5. 可视化分析：使用数据分析软件对映射结果进行可视化处理，生成测序图。
实验结果：
通过基因测序技术，我们获得了样本的基因组序列信息，并得到了相应的测序图。
测序图可以用来探究样本的基因组结构、基因的表达模式、突变位点的分布等信息。
这些信息可以帮助我们研究基因之间的相互作用、基因与表型之间的关系，进一
步揭示基因的功能和调控机制。
结论：
基因测序绘图实验为研究基因组学和遗传学提供了有力的工具。
通过测序图的分析，可以深入了解基因的结构和功能，为进一步的研究提供基础和指导。
在未来，基因测序技术的持续发展将极大地推动基因研究和生物医学领域的发展。
微生物领域中的基因测序技术使用教程
微生物领域中的基因测序技术使用教程基因测序技术是现代生命科学研究中的重要工具，它可以揭示生物体内基因组的组成和结构，从而更好地理解微生物的功能和遗传特性。
本篇文章将向您介绍微生物领域中常用的基因测序技术及其使用教程。
1. Sanger测序法Sanger测序法是一种经典的基因测序技术，它基于DNA合成中的“链终止法”原理。
首先，将待测的DNA片段在PCR反应中扩增，然后将扩增产物与引物、DNA聚合酶和一种特殊的二进制分子链终止剂（如二进制dTTP）一起放入反应体系。
这样，在DNA复制的过程中，发生终止反应的碱基将会在扩增产物中引入一些短的链终止片段。
通过电泳分离这些链终止片段，并用荧光标记的引物进行测序，就可以获得DNA序列的信息。
2. 双链DNA测序（Shotgun测序）双链DNA测序是一种高通量基因测序技术，该技术广泛应用于微生物全基因组测序。
它通过将基因组DNA随机剪切成小片段，并进行文库构建，然后将文库进行扩增和测序。
随后，利用计算机算法将这些片段拼接起来，从而得到完整的基因组序列。
相较于Sanger测序法，双链DNA测序具有更高的测序效率和通量。
3. 16S rRNA测序16S rRNA测序是一种常用于微生物分类和鉴定的技术。
16S rRNA是细菌和古菌中高度保守的基因，因而每个菌株的16S rRNA序列都具有一定的差异。
通过将微生物样品中的16S rRNA基因进行扩增和测序，可以得到微生物的16S rRNA 序列信息，并通过与数据库中已知的16S rRNA序列比对，进行微生物分类和鉴定。
这种方法可广泛应用于微生物多样性研究、环境样品中微生物群落的研究和微生物致病性的评估等领域。
4. 宏基因组测序宏基因组测序（metagenomics）是一种用于研究复杂微生物群落的技术。
与传统的基因组测序技术不同，宏基因组测序对微生物群落样品中所有的DNA进行高通量测序。
通过使用二代测序技术，可以同时测得微生物群落中所有个体的基因组序列。
微生物基因组denovo测序分析流程
#流程大放送#微生物基因组Denovo测序分析知因无限一介绍微生物基因组De novo测序分析也叫微生物基因组从头测序分析，指不依赖于任何参考序列信息就可对某个微生物进行分析的测序分析技术，用生物信息学的方法进行序列拼接获得该物种的基因组序列图谱，然后进行注释等后续一系列的分析。
微生物Denovo基因组测序及分析技术可以应用于医药卫生等领域。
二技术应用领域1、基因组图谱的系统性构建例子：过去几个月，肠病毒D68令数百名美国儿童患病。
华盛顿大学的研究人员测序和分析了肠病毒D68（EV-D68）的基因组，这一成果将发表在新一期的Emerging Infectious Diseases杂志上。
（Genome Sequence of Enterovirus D68 from St. Louis, Missouri, USA）肠病毒D68（EV-D68）能在儿童中引起严重的呼吸道疾病。
其基因组序列可以“帮助人们开发更好的诊断测试，”共同作者Gregory Storch说。
“有助于解释病毒感染为什么会造成严重的疾病，以及EV-D68为什么比过去传播得更广。
”（来自于生物通的报道）2、微生物致病性和耐药性位点检测及相关基因功能研究例子：根据分泌蛋白、毒力因子、致病岛、必需基因等结果去探讨所测物种致病性和耐药性。
3、微生物的比较基因组分析，确定各个近缘微生物中的系统发育关系二基本分析流程图三可能的结果展示图示例图1 微生物基因组的功能注释示例图2 微生物基因组的系统进化关系注：以上图片和文字来自参考文献21。
六参考文献[1] Hong-Bin Shen, and Kuo-Chen Chou, "Virus-mPLoc: a fusion classifier for viral protein subcellular location prediction by incorporating multiple sites", Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 2010, 28: 175-86.[2]Hong-Bin Shen and Kuo-Chen Chou, "Virus-PLoc: A fusion classifier for predicting the subcellular localization of viral proteins within host and virus-infected cells.", Biopolymers. 2007, 85, 233-240.[3] Ren Zhang and Yan Lin, (2009) DEG 5.0, a database of essential genes in both prokaryotes and eukaryotes. Nucleic Acids Research 37, D455-D458.[4] The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. BMC Bioinformatics. 2007 May 23;8(1):172.[5] The Pfam protein families database: M. Punta, P.C. Coggill, R.Y. Eberhardt, J. Mistry, J. Tate,C. Boursnell, N. Pang, K. Forslund, G. Ceric, J. Clements, A. Heger, L. Holm, E.L.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman, R.D. Finn Nucleic Acids Research (2014) Database Issue 42:D222-D230.[6] Clustal W and Clustal X version 2.0.(2007 Nov 01) Bioinformatics (Oxford, England) 23 (21) :2947-8.PMID: 17846036.[7] Felsenstein, J. 2004. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6. Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle.[8] Li et al (2010). De novo assembly of human genomes with massively parallel short readsequencing. Genome Res vol. 20 (2).[9] Li et al (2008). SOAP: short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics Vol. 24 no.5 2008.[10] A.L. Delcher, D. Harmon, S. Kasif, O. White, and S.L. Salzberg (1999) Improved microbial gene identification with GLIMMER, Nucleic Acids Research 27:23 4636-4641.[11] S. Salzberg, A. Delcher, S. Kasif, and O. White (1998) Microbial gene identification using interpolated Markov models, Nucleic Acids Research 26:2, 544-548.[12] Delcher AL, Bratke KA Powe,rs EC，et al(2007). Identifying bacterial genes and endosymbiont DNA with Glimmer. Bioinformatics,23(6):673-679.[13]G. Benson(1999). Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences. Nucleic Acids Research, Vol. 27, No. 2, pp. 573-580.[14] Kanehisa M, Goto S, Kawashima S, Okuno Y, Hattori M (2004). The KEGG resource for deciphering the genome. Nucleic Acids Res 32 (Database issue): D277–80.[15] Kanehisa M, Goto S, Hattori M, Aoki-Kinoshita KF, Itoh M, Kawashima S, et al. (2006). From genomics to chemical genomics: new developments in KEGG. Nucleic Acids Res 34(Database issue): D354–7.[16] Tatusov RL, Koonin EV, Lipman DJ(1997). A genomic perspective on protein families. Science. Oct 24;278(5338):631-7.[17] Tatusov RL, Fedorova ND et al.(2003). The COG database: an updated version includes eukaryotes. BMC Bioinformatics. Sep 11;4:41.[18] Magrane, M. and UniProt Consortium (2011) UniProt Knowledgebase: a hub of integrated protein data. Database (Oxford) , bar009.[19] Bard J, Winter R (2000). Gene Ontology：tool for the unification of biology. Nat Genet. 25:25-29.[20] ZODOBNOV．E．M，APWEILER．R．InterProScan—an intergration plaftorm forthe signature recognition methods in InterPro[J]．Bioinform atics，2001，17(9)：847-848．[21] Van den Bogert B1, Boekhorst J2, Herrmann R1, Smid EJ3, Zoetendal EG1, Kleerebezem M4. Comparative genomics analysis of Streptococcus isolates from the human small intestine reveals their adaptation to a highly dynamic ecosystem. PLoS One. 2013 Dec 30;8(12):e83418.。
基因组作图
双杂合子， 具有所有4 个等位基因
隐性配子对于 后代的基因型 不产生影响
后代的表型完全 由双杂合子配子 的基因型提供
测交实验可以对一次减数分裂进行直接分析，从 而计算出重组频率及所研究的两个基因间的间距
显隐性等位基因间的测交
外侧标记只需 一次重组事件 即可去连锁
两次重组的频率肯定低于一次重组，因此中间标记去连锁 发生的频率也就相对较低。所以利用三点测交则可以快速
生化标记
啤酒酵母遗传分析中使用的典型的生化标记
标记 ADE2 CAN1 CUP1 CYH1 LEU2 SUC2 URA3 表型 腺苷依赖性 刀豆氨酸抗性 耐受铜 耐受放线菌酮 亮氨酸依赖性 能发酵蔗糖 尿苷依赖性 确定细胞具有该标记的方法 只在含有腺苷的培养基中生长 可在刀豆氨酸存在下生长 可在铜存在下生长 可在放线菌酮存在下生长 只在含有亮氨酸的培养基中生长 可在蔗糖为唯一碳源的培养基中生长 只在含有尿苷的培养基中生长
微卫星（ 2、微卫星（Microsatellites) 微卫星 Microsatellites)或简单串联重复（Simple tandem repeats, STRs)：重复单位往往6bp或更短。
等位基因 814 Weissenbach J., et al. A second-generation linkage 标记 markers
Linkage analysis with different types of organism
• 果蝇、小鼠等:有计划的育种实验（planned breeding 果蝇、小鼠等 experiments) • 人类:系谱分析（family pedigree) 人类 • 细菌 细菌：DNA在细胞间的转移
直接配子分型：酵 母配子单倍体克隆 的生化判定；真核 生物DNA标记分型
真菌全基因组甲基化测序流程
真菌全基因组甲基化测序流程真菌全基因组甲基化测序是一种用于研究真菌基因组甲基化模式的高通量测序技术。
甲基化是指在DNA分子上添加甲基基团的修饰过程，可以影响基因的表达和细胞功能。
真菌全基因组甲基化测序可以帮助研究人员了解真菌基因表达的调控机制，以及甲基化在真菌生物学过程中的重要作用。
真菌全基因组甲基化测序的流程如下：1. DNA提取：首先，需要从真菌样本中提取DNA。
这可以通过化学方法或商用DNA提取试剂盒来完成。
确保提取到的DNA质量高，并且没有RNA和蛋白质污染。
2. DNA片段化：将提取到的DNA样本进行片段化处理。
传统的片段化方法包括超声波片段化和酶切。
超声波片段化是通过超声波震荡将DNA分子随机切割成约200-500碱基对长的片段。
酶切则是使用限制性内切酶切割DNA，生成具有亚满分内切酶识别位点的DNA片段。
3.甲基化处理：接下来，在片段化的DNA样本中进行甲基化处理。
真菌的DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸位点，即C（胞嘧啶）与G（鸟嘌呤）相邻的碱基对。
甲基化可以通过使用DNA甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸等试剂进行。
4.文库构建：将甲基化处理后的DNA样本进行文库构建。
文库构建可以使用Illumina HiSeq平台的标准操作流程。
简单来说，就是把DNA片段连接到文库接头上，然后进行PCR扩增，以产生足够的DNA模板用于高通量测序。
5.高通量测序：使用Illumina HiSeq平台或其他高通量测序平台进行文库的测序。
这一步骤会产生大量的测序数据，可以得到整个真菌基因组的甲基化信息。
6.数据分析：对测序数据进行分析和解读。
首先，对测序reads 进行质量控制和过滤，剔除低质量的序列。
然后，将过滤后的reads 与参考基因组进行比对，以确定甲基化位点的位置和甲基化水平。
最后，将甲基化数据与真菌基因组注释信息进行整合，分析甲基化模式和甲基化位点与基因表达的关系。
传统的真菌全基因组甲基化测序需要较大的样本量和较高的测序深度，以获得准确的甲基化信息。
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4 采样方法
Sampling Method
• 必须在无菌操作下进行 • 袋装、瓶装、罐装品，应采完整的未开封的样品 • 如果样品很大，用无菌采样器采集 • 固体样品：粉末状的边取边混，小块大包装品从不同
部位的小块取样，大块整体样品从不同部位取样，兼 顾表面和深度 • 半固体样品，用无菌勺从几个部位挖取 • 液体样品振摇混匀，用100mL无菌注射器抽取 • 冷冻品，保持冷冻状态 根据检验目的，确定取样方案
可疑微生物检测
病原体 指示菌
二级抽样方案
三级抽样方案
选择n值
选择n值和c值
美国食品药品管理局（FDA） 联合国粮农组织（FAO）
二级抽样方案
• 由n、c和m组成 • n是从一批被检查食品中抽取样品的数量 ，
取样数 • c是样品检测值超过指标值m的最大可接受
抽样单位数，如果超过该值，则拒绝接受 该批产品 • m是每克样品中相关细菌的合格菌数限量， 即指标值
(1)药品取样
Drug sampling
• 抽样： ▪ 供试品为随机抽样，一般抽样量为检验用量（2个
以上最小包装单位）的3倍量。 ▪ 对异常的供试品应针对性的抽样，对外观可疑污
染或对有争议复验的样品应抽取可疑污染或对有 争议复验的原样品。 ▪ 从药品、瓶外观看出发霉、生虫及变质的药品不 必再继续检验，直接判为不合格。 • 检样： ▪ 每次最少应分取二瓶（盒）以上的样品共10g或 10ml。 ▪ 中药蜜丸至少应分取4丸以上共10g。
广泛扩散
严重、直接
二级法，n=15,c=0 二级法，n=30,c=0 二级法，n=60,c=0
蛋制品的抽样方案
蛋制品的抽样方案
目标微生物 抽样方
n
案
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• 利用paired-end关系的reads的mapping信息，给出scaffold 序列的组装质量值。并得出各条scaffold之间的潜在连接关 系进行统计分析。
组装结果评价
• 基因组覆盖度分析
• 基于参考序列：由合作伙伴提供的参考序列，与组装结果进行比对分析，得 出两者间的交集区域，进而估算基因组的覆盖度。
微生物基因组测序作图流程
2010年9月
内容
• 微生物基因组DNA Survey服务 • 细菌框架图 • 细菌精细图 • 细菌完成图 • 细菌群体进化分析 • 真菌框架图 • 真菌精细图 • 真菌重测序 • 病毒_质粒_BAC (fosmid_线粒体_叶绿体) • 个性化分析
质控
a) 处理后的所有read上每个位置上的碱基分布; b) 处理后的read上 每个位置上碱基的质量值分布; c) 插入片段分布图; d) 单碱基测序 错误率分布图．
• Survey升级成精细图（加测50 × 的数据）或直 接做精细图。中级分析或高级分析（可选）。
分析流程（中级分析或高级分析）
数据处理和质控参考Survey 组装
• SOAPdenovo组装。
• velvet和Abyss等组装，以SOAPdenovo结果为参照，综合其 它组装结果，构建最好的组装结果。
scaffold序列的组装质量值。
组装后质控统计
a. GC含量分析统计 b. Depth分析统计 c. GC含量与Depth关联分析统计
Percent (%)
非一致序列分析(K-mer分析和NT库比对）
Depth
利用短插入片段测序reads，选取中间高质量测序区域， 逐碱基取长度 为17的片段即17-mer。统计各17-mer深度和各个深度的频数所占比例， 计算作图获得如下深度~频率分布图和统计表。 图中横坐标为深度（depth），纵坐标为各深度下的频数占总频数的比 例（proportion）。
基因预测和基因注释参考细菌框架图
GO功能分类图
重复序列分析（ ） RepeatMasker 、 RepeatProteinMasker 、 TRF
ncRNA预测
• rRNAmmer or RNA库：rRNA • tRNAscan：tRNA • Rfam： miRNA、sRNA和snRNA
细菌完成图
KEGG代谢通路二级分类图COG功能分类图Fra bibliotek细菌精细图
• 采用500bp,100PE和2k,50PE测序策略。
• 提供100×的数据量，承诺指标为：
正常GC，scaffold数量，基因组小于5M，100个，基因组5-10M，150个； 不正常GC，scaffold数量，基因组小于5M，200个，基因组5-10M，300个； 单碱基错误率小于1/100，000； 基因组覆盖度大于98 %，基因区覆盖度大于95 % 。
细菌框架图
• 采用500bp,100PE测序策略。 • 提供100×的数据量，不承诺指标。 • Survey+细菌中级分析内容。
分析流程
数据处理、 质控、 组装、 组装后质控统计、 非一致序列分析。 参考survey
中级生物信息分析
• 基因预测（ Glimmer3.0基因预测软件）
基因功能注释（ KEGG、SwissProt、COG库 的比对）
• 基于k-mer分析：根据基因组的k-mer性质，利用k-mer分布的统计规律估算出 基因组的大小，与组装出来的基因组大小进行比较，进而估算基因组的覆盖 度。
• 基于reads比对：根据reads的比对信息，得到reads的利用率，推测基因组的覆 盖度。
• 基因区覆盖度分析
• 根据测序reads与参考序列的比对，来确定用于评价的基因序列（这里取 coverage > 50%的基因）。然后用组装结果与这些基因序列进行比对，进而估 算得到组装结果的基因区覆盖度信息。
• 完成精细图
• 加测大片段降低scaffold，合同中不写降到 多少。目标是达到20个以下scaffold，一般 2-3个大片段 （2kb，5kb library等）
• 由我们分析原始数据，设计，合成引物， 采取Sanger法测序，并对测序结果进行拼接。
细菌群体进化分析
• 细菌精细图 (中级分析)。
SNP分析
在一致序列的基础上，对于检测到的基因型与 参考序列存在着多态性的位点进行过滤，最后 可以得到高可信度的SNP数据集。
InDel分析
进化分析
• 构建进化树
• Ka/Ks计算
真菌框架图
• 采用500bp,100PE测序策略。 • 提供50×数据量，不承诺指标。 • Survey+真菌中级信息分析。
组装
• (1) 运用华大自主研发的SOAPdenovo组装软件对reads数据 进行组装，得到我们的组装结果，组装原理图请参见图3.2。
• (2) 利用reads的mapping信息，对软件组装结果进行补洞、 单碱基校对。
• (3) 利用paired-end关系的reads的mapping信息，给出
• 个性化内容中群体分析。
• Core and pan genome构建和分析 • 变异分析（SNP，Indel) • 进化分析（构建进化树，Ka/Ks计算）
Core and pan genome构建和分析
A) Core-genome based on genes. B) Pan-genome based on genes. C) Core-genome based on genomic sequences. D) Pan-genome based on genomic sequences.
分析流程
数据处理、 质控、 组装、 组装后质控统计、 非一致序列分析。 参考survey
中级生物信息分析
• 基因预测（ Augustus基因预测软件）
真菌精细图
• 采用500bp,100PE和2k,50PE测序策略。
• 提供50×的数据量，承诺指标为：
正常GC，scaffold N50≥300 Kb； 双核，高重复序列，异常GC，杂合率大于0.5%等复杂现象,具体指标另行协商； 单碱基错误率小于1/100，000； 基因组覆盖度大于98 %，基因区覆盖度大于95 % 。