凝集素基因克隆以及功能研究

凝集素基因克隆以及功能研究

林春江1 ,杨义1 ,马振华1 ,李成久2

1大连水产学院生命科学技术学院 （116023）

2辽宁省水产种苗管理局 （116015）

E-mail：yangyi0403@

摘要：凝集素研究近年来发展迅速。本文从凝集素的分布、结构、分类、理化性质以及基因克隆等方面进行了综述，并讨论了凝集素基因在植物基因工程中的应用。

关键词：凝集素，功能，分布结构，基因克隆

1．凝集素定义的不断深化

早在1888 年，俄Dorpt大学的Herman Stillmark偶然间观察到蓖麻籽的蛋白提取物能凝集血红细胞，从而开始了植物凝集素的研究。但直到本世纪60年代，人们认识到凝集素在生物体内具有多种重要生理功能，在医药、农业上具有巨大应用前景，凝集素的研究文献才开始大量涌现(Etzler,1985)。植物凝集素（Lectin）一词来源于拉丁文“Legere”,意思是选择，以强调其能选择性地与糖复合物相结合的特性。一般说来，植物凝集素是指能可逆结合特异单糖或寡糖的蛋白质。但伴随着植物凝集素家族成员的增加，对其结构、功能研究的深入，分子生物学水平上新的发现，植物凝集素的定义已几经修正。最近Peumans等认为一蛋白质被定义为:Lectin 的唯一前提是至少应有一个非催化结构域，且其能可逆结合在特异碳水化合物上。因此现在植物凝集素定义为：含有至少一个非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的所有蛋白质(Peumans,1995)。

2．凝集素的结构

凝集素是一种糖蛋白，它有依赖共价键相连结的蛋白质和糖两个部分，蛋白质占的百分比大，糖的含量较少。一般都是几个单糖构成寡糖链，寡糖链再以两个方式与蛋白质肽链相连，分别构成 N-连接寡糖蛋白和O-连接糖蛋白。

2．1 N-连接寡糖蛋白

先在粗面内质网和高尔基复合体中合成N-连接寡糖，此过程与蛋白质肽链的合成同时进行。合成过程是在内质网上以长萜醇作为糖链载体，在糖基转移酶的作用下，先将 UDPGLcNAc 分子中的 GLcNAc转移至长萜醇，然后再逐个加上糖基，形成N-连接寡糖链。此寡糖链再作为一个整体转移至蛋白质肽链的糖基化位点上，即糖蛋白氨基酸序列上的 Asn-x-Ser/Thr(其中 x 可以是脯氨酸以外的任何氨基酸) 等三个氨基酸组成的序列子上，一般是和天冬酰胺残基的酰胺氮连结，

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2．2 O-连接糖蛋白

首 先 也 是 先 合 成 O-连 接 寡 糖 ,O-连接寡糖的合成是在蛋白质多肽链合成后进行的，合成过程中不需要糖链载体，只在 GalNAc转移酶作用下，将UDPGLcNAc 分子中的 GLcNAc基转移至多肽链的丝氨酸或苏氨酸的羟基上，形成O-连接寡糖，即：

然后再逐个加上糖基，直至完成糖蛋白的合成。

3．凝集素的分布和功能

凝集素广泛分布于植物、动物和微生物中。目前已有1000多种植物被报道含有凝集素（1），它们在植物根、茎、叶、花、果实、种子、汁液中广泛分布，可存在于细胞膜上、细胞质内和细胞外基质。自Ashwell和Morell发现肝细胞凝集素（2）以来，人们在高等动物体内陆续发现了多样的凝集素，大量分布在血清、卵、淋巴细胞、精子等不同部位。已发现的微生物凝集素一般分布在体表，胞质中少见。Pseudomonas aseruginosa是原核生物中仅知的分布于胞质内的凝集素（3）。凝集素的功能似乎与其来源有关系，即凝集素在不同生物及同一生物不同组织中的分布的多样性决定了其在进化过程中适应并产生了许多独特的功能。 3．1 动物凝集素

动物的凝集素分子按照糖识别域肽链序列分有三类：C型凝集素、S型凝集素和P型凝集素，以及一些目前尚未确切归类的凝集素。C．型因其活性需钙离子而得名，均位于细胞外；S．型，因其活性的完全表达通常依赖巯基而得名；P-型则因其主要配体为甘露糖-6-磷酸盐而得名（4）。它们分别以膜整合或水溶性的形式存在，通过与体液中的糖配体(如某些激素、细胞因子、生长调节因子等)或细胞表面的糖配体相互作用，进行识别与结合来对细胞产生信号作用，引发细胞产生一系列反应，来参与动物体的发育、内环境的稳定以及机体防御等功能。如哺乳动物肝细胞表面识别半乳糖与鸟类肝细胞表面识别N一乙酰氨基葡萄糖的凝集素分别介导一定糖链结构的血浆糖蛋白内吞来维持内环境的稳定。

3．2 植物凝集素

植物凝集素亦藉其对糖基特异的识别和可逆结合的特点，在体内具重要的生理作用。除

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某些酶(几丁质酶、葡糖酶、葡糖苷酶)，凝集素是唯一能够识别和结合微生物或暴露于昆虫及哺乳动物消化道中的糖复合物的植物蛋白。鉴于微生物和动物体内的糖类的分布，以及凝集素的糖结合活性的广谱性，目前认为植物已成功进化出各种类型的糖结合受体的识别／反应分子（5）。分子生物学、生物化学、细胞学、生理学和进化论的各种证据都暗示凝集素在植物防卫反应中具重要作用。而决定它们抗性的就是它们的糖结合活性，即通过识别并结合入侵者上的糖结构，来参与抵抗植物病原和摄食者入侵。自然界中植物凝集素介导防御反应主要以两种方式来进行（6）。一种是直接作用，植物凝集素对无脊椎动物和脊椎动物的毒性效应很显著，所以凝集素的这种保卫性质特别针对植食动物，如核糖体失活蛋白Ⅱ型对高等动物的致死效应从古代就已存在，蓖麻毒蛋白对四纹豆象(Callosobruchus maculatus)和墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis)具有很高的毒性等。目前研究较多的是植物凝集素的抗虫研究，其作用机制与凝集素和昆虫的肠内壁的糖缀合物特异结合有关。另一种是植物凝集素对病毒、细菌和真菌的间接作用方式。关于植物凝集素保护植物抵抗病原菌的研究，国外已有一些报道。例如草藤(Vicia cracca)凝集素能抑制土壤中分解其中皮的微生物生长，麦胚凝集素(WGA)对绿色木霉(Trichoder—ma viride)具有抑制作用。事实上，除核糖体失活蛋白Ⅱ型之外，还没有其它植物凝集素抑制病毒侵染、复制和系统传播的报道，但某些植物凝集素可能具有间接的抗毒活性，例如杀虫凝集素的存在可能阻止或减少昆虫介导的病毒病的传播。植物凝集素的抗细菌活性也是一种间接机制，通过细胞壁糖类或胞外多糖相互作用的机制起作用。需要指出的是凝集素并非植物中唯一的防御相关蛋白，而是协同其它的保护性蛋白(如几丁质酶)一起建立一个高效的防御系统。

植物凝集素的内源功能是充当典型的植物储存蛋白，其功能是作为氮源或硫源。还可以作为一种特异性识别因子与其它有机体中的糖复合物相互作用，协调自身与外界的关系。如为建立共生关系，豆科根部凝集素可能参与对根瘤菌和布氏根癌的识别和／或结合过程。因此，植物凝集素的功能应该是多价的。

3．3 微生物凝集素

从1908年，Gugot从大肠杆菌(Escherchia coli)中找到了能凝集血细胞的凝集素至今，已发现了208种微生物凝集素，其中以细菌凝集素为最多，达到了132个，其次为真菌凝集素为57个。目前发现的微生物凝集素大多通过其壁上凝集素对糖基的识别而实现对宿主的感染，所以它们往往在吸附事件中发挥着重要作用。如不具有细胞壁凝集素的细菌突变株失去致病力（7）。

近年来关于微生物凝集素还具有贮存蛋白的功能也有报道，这些凝集素多分布在微生物体的胞质内。如Arthrobotrys oligospora胞质内的凝集素(AOI )具有氮源的作用，主要表现在：AOL的水平受代谢及生长的调控；处于高氮时，AOI 可以大量积累，而处于氮饥饿时，AOI 较其它蛋白下降很多（8）。

4． 凝集素基因的克隆

1982年Hoffman等克隆了第一个凝集素基因，它编码一个菜豆凝集素蛋白，现在已克隆了大量的凝集素基因，仅植物凝集素基因就达222个，它们大多编码豆科凝集素和单子叶植物甘露糖结合凝集素家族成员。包括：雪花莲凝集素( G N A ) 基因，豌豆凝集素(P-Lec)

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