应用ELISA对畜产品瘦肉精残留的快速筛选

第１０卷第３期２００６年９月河北农业科学ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｂｅｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＶ０１．１０Ｎｏ．３Ｓｅｐ．２００６文章编号：１００８．１６３１（２００６）０３－００６８－０４应用ＥＬＩＳＡ对畜产品瘦肉精残留的快速筛选左晓磊１，张峰孙，褚素巧１，刘海生１（１．石家庄市畜牧水产局，河北石家庄０５００００；２．河北省农林科学院粮油作物研究所，河北石家庄０５００３１）摘要：应用竞争酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ），能够快速对猪尿、猪肝中的克伦特罗残留进行检测筛选，一般实验只需２～３ｈ，而且准确性高和重复性强，检测费用相对低廉。

关键词：ＥＬＩＳＡ；克伦特罗；残留；检测中图分类号：Ｓ．文献标识码：ＡＴｈｅＱｕｉｃｋＡｎｌｙｓｉｓｏｎＭｅｔｈｏｄＣｌｅｎｂｕｔｅｒａｌＲｅｄｉｄｕｅｏｆＡｎｉｍａｌＰｒｏｄｕｃｔｂｙＥＬＩＳＡＺＵＯＸｉａｏ．１ｅｉｌ，ＺＨＡＮＧＦｅｎｇ¨，ＣＨＵＳｕ．ｑｉａ０１，ＬＩＵＨａｉ．ｓｈｅｎ９１（１．ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙＭａｒｉｎｅＰｒｏｄｕｃｔｓＢｕｒｅａｕｏｆＳｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００００，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｅｒｅａｌａｎｄ０ｉｌＣｒｏｐｓ．ＨｅｂｅｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００３１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ｐ－ｈｅｒｍｏｎｅ，ｃｅｎｂｕｔｅｒａｌ，ｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅａｄｒｅｎａｌｇｌａｎｄｉｓｗｉｄｅｕｓｅｄｉｎｔｈｅａｎｉｍａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｂｕｔｉｔｉｓｄａｎｇｅｒｏｕｓｔｏｐｅｏｐｌｅｓｈｅａｌｔｈｂｅｃａｕｓｅｒｅｍａｉｎｅｄｉｎｔｈｅｏｒｇｎｉｓｍ．Ａｌｏｔｏｆｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｎｌｙｓｉｓｃｌｅｎ。

ｂｕｔｅｒａｌ．Ａｎｅｗａｎｄｑｕｉｃｋｍｅｔｈｏｄｏｆｃｌｅｎｂｕｔｅｒａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｔｈｉｓｒｅｐｏｒｔｂｙａｎｔｉｇｅｎ—ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅ’ａｃｔｉｏｎｏｒＥＬＩＳＡｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥＬＩＳＡ；Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒａｌ（ＣＬＢ）；Ｒｅｓｉｄｕｅｓ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ“瘦肉精”学名克伦特罗，属Ｂ一肾上腺类激素，是美国Ｃｙａｎａｍｉｄ公司化学合成制得的一种呼吸系统药物，临床用于治疗哮喘病［Ｉ］。

２０世纪８０年代初研究发现，将一定量的克伦特罗添加到饲料中，可显著促进动物生长和提高瘦肉率。

２０世纪９０年代我国开始作为饲料添加剂引人并推广。

但一连串的“瘦肉精”食物中毒事件发生后，克伦特罗成为世界上普遍禁用的添加剂［２，］。

１９９７年以来，我国农业部等相关部门多次发文，禁止生产和使用“瘦肉精”。

但仍有很多瘦肉精中毒事件发生，严重威胁消费者的健康。

因此检测动物产品及饲料中的瘦肉精具有重要意义。

测定克伦特罗的方法有高效液相色谱一质谱联用法（ＨＰＬＣ．ＭＳ）、气相色谱．质谱联用法（ＧＣ．ＭＳ）和高效液相色谱法（ＨＰＬＣ），这些都是比较传统的办法，目前仍作为确认方法，但由于检测仪器费用昂贵、步骤繁琐以及耗时较长，现已不适用于畜牧兽医部门的检测［４］。

目前常用的是竞争酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ），运用抗原抗体反应的原理，能快速地对“瘦肉精”作出定量分析及快速筛选，一般实验只需２～３ｈ，而且准确性高和重复性强，检测费用相对低廉［５］。

１材料与方法１．１材料１．１．１仪器酶标仪及酶标工作站（配备４５０ｎｍ滤光片，奥地利ｓｕｎｒｉｓｅ公司生产），洗板机（ｔｅ一收稿日期：２００６－０３．２８作者简介：左晓磊（１９７８一），男，石家庄人，硕士，主要从事动物营养及畜产品研究与检测工作。

通信作者：张蜂（１９７６一），男，河北邯郸人，硕士，主要从事动物营养研究。

第３期左晓磊等：应用ＥＬＩＳＡ对畜产品瘦肉精残留的快速筛选・６９・ｃａｎ），回旋振荡器（江西金坛医疗器械厂生产），微量可调移液器（单道２０斗Ｌ、５０ＩｘＬ、１００斗Ｌ和１０００斗Ｌ，八道５０～３００ｌｘＬ），高速冷冻离心机（速率＞ｔ３０００ｒ／ｍｉｎ，ＧＬ－２１ＬＭ，湖南星科），氮吹仪（１ＴｒＬ．ＤＣ，北京同泰联），组织匀浆机（ＸＨＦ．１，宁波新芝），ＲＩＤＡＣ，。

柱，离心管（５０ｍＬ），滤纸（０．４５“ｍ），酶标板（１２孔×８孔，英国ｒａｎｄｏｘ公司生产）。

１．１．２试剂甲醇（分析纯），ＨＣｌ（５０ｍｍｏＬ／Ｌ和１０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＫＨ：ＰＯ，缓冲液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ和５００ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值均为３．０），ＮａＯＨ（１ｍｏｌ／Ｌ）。

１．２方法１．２．１样品前处理（１）猪尿。

取猪尿样品１０ｍＬ，过滤或离心至清亮。

（２）猪肝和猪肉。

称取粉碎的猪肝或猪肉样品５ｇ，与５０ｍｍｏｌ／ＬＨＣＬ２５ｍＬ混合，振荡１．５ｈ。

取均质物６ｇ加入离心管中，１０一．１５℃下离心（４０００转／ｍｉｎ）１５ｒａｉｎ。

转移上清液至另一离心管，加１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ３００ｔｒＬ混合１５ｍｉｎ。

加入５００ｍｍｏｌ／ＬＫＨ：ＰＯ，缓冲液４ｍＬ，混合并在４℃条件下保存至少１．５ｈ。

１０。

１５℃下离心（４０００转／ｍｉｎ）１５ｍｉｎ，分离全部上清液，使其升至室温（２０—２４℃），然后用ＲＩＤＡＣ，。

柱纯化。

ＲＩＤＡＣ。

柱纯化样品必须在室温条件下（２０～２４℃），并严格控制过柱时的流速。

用甲醇３ｍＬ洗涤柱子使其活化，控制流速为１滴／ｓ。

用洗涤液（ｐＨ值３．０的５０ｍｍｏｌ／ＬＫＨ：ＰＯ，缓冲液）２ｍＬ洗涤柱子。

分离的全部上清液进柱，控制流速为０．２５滴／ｓ。

用洗涤液（ｐＨ值３．０的５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾缓冲液）２ｍＬ洗涤柱子，流速为１滴／ｓ。

用正压除去残留的流体并用空气或氮气吹２ｍｉｎ，干燥柱子。

用甲醇１ｍＬ洗脱样品，控制流速为０．２５滴／ｓ。

在５０～６０℃并在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇溶剂。

用蒸馏水１ｍＬ溶解干燥的残留物，取２０斗Ｌ备用。

１．２．２检测方法所有试剂及样品在开始检测前必须回升至室温（１９～２５ｏＣ），测定操作在１９～２５℃下进行。

用盒中缓冲液按试剂盒的规定和实际需用量稀释克伦特罗抗体浓缩液和克伦特罗酶标记物浓缩液。

稀释前轻轻混匀抗体浓缩液、酶标记物浓缩液和缓冲液。

不要猛烈振荡，避光放置。

取出实验需要数量的微孔板条，足够标准和样品所用的数量，标准和样品做２个平行试验，记录标准和样品的位置。

剩余的微孔板条放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，置于２～８℃冷藏。

每个微孔中加入１００斗Ｌ抗体稀释溶液，轻轻振动酶标板，使抗体液混合均匀，用封口膜封好，室温（２０。

２４ｏＣ）孵育微孔板１５ｒａｉｎ，避免光线照射。

用洗板机洗涤酶标板，用洗涤缓冲液２５０～３００ＩｘＬ充入孔中洗涤，重复操作３次。

加洗涤水的移液器管尖必须置于微孑Ｌ上方约０．５ｅｎｌ处打出洗涤水，避免将板孔中的游离抗体带人洗涤水中。

洗板后立即进行下一步操作，不要让板孔干燥。

用移液枪吸取标准溶液或处理好的样品溶液２０斗Ｌ，分别加入到指定的每个微孔中，标准和样品均需做２个平行孔实验。

然后加入酶标记物１００斗Ｌ，用密封胶纸盖好酶标板，轻轻振荡板边缘并在桌面上作圆周运动以混合均匀，置于室温（１９～２５ｏＣ）孵育３０ｍｉｎ，避光放置，每隔１０ｍｉｎ轻轻振荡１次。

用洗板机重复洗板３次。

用８道移液枪移取酶基质／发色剂１００ＩｘＬ到每一孔中，轻轻震荡微孔板并在桌面上作圆周运动以混匀，在１９～２５℃孵育（２０±２）ｍｉｎ，加入０．２Ｍ硫酸１００止中止反应，反应物颜色由蓝色转为黄色，１０ｍｉｎ内用酶标仪测量４５０ｎｍ波长的吸光度值。

计算标准和样品的吸光度值。

吸光度值ｃ％，＝蕉萼篱藉墨嵩蔫詈翡霎鲁舀差铲×，ｏｏ％绘制克伦特罗浓度一吸光度坐标系统标准曲线图。

从校正曲线上读出供试样品中克伦特罗的浓度（斗ｇ／Ｌ），或用专业计算机软件求出供试样品中的克伦特罗的浓度。

・７０・河北农业科学第１０卷在５０ｍＬ离心管中加人５ｍＬ空白组织样品，再分别添加１０ｒｉｇ／ｍＬ的克伦特罗标准溶液０．５ｍＬ和１．０ｍＬ，３次重复。

按１．２．２方法处理后在酶标仪上测定，计算添加回收率和变异系数。

２结果与分析２．１工作曲线检测畜产品中克伦特罗浓度在０．０１～１０．００ｎｇ／ｍＬ，线性回归方程为】，＝一１０．１５１７ｘ＋７２．０２１７（ｒ＝０．９９９９），检测限为０．１ｎｇ／ｍＬ（表１）。

说明应用ＥＬＩＳＡ快速对畜产品中瘦肉精残留筛选准确性较高。

表１克伦特罗的回归方程与相关系数的测定结果Ｔａｂｌｅ１ＣＬＢｅｑｕａｔｉｏｎｉｎｄｅｘａｎｄｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ图１克伦特罗浓度一吸光度标准曲线图Ｆｉｇ．１ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｂｅｔｗｅｅｎＣＬＢｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｌｉｇｈｔａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ１０克伦特罗浓囊（ｎｇ／ｍＬ）２．２灵敏度与回收率在空白组织中添加１．０ｎｇ／ｍＬ克伦特罗标准液的样品，平均回收率为８５．３％（ＣＶ＝３．２１％）；浓度为２．０ｒｉｇ／ｍＬ的样品，平均回收率为８３．７％（ＣＶ＝１．８９％）（表２）。

说明应用ＥＬＩＳＡ快速检测畜产品瘦肉精残留灵敏度较高。

表２试样的加标回收率及变异系数Ｔａｂｌｅ２Ｒａｔｅｏｆｒｅｇａｉｎａｎｄｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ３结论与讨论尿液中的克伦特罗可直接用ＥＬＩＳＡ检测，肝脏和肉中的克伦特罗经萃取提纯后进行检测，适合对生猪体内瘦肉精的检测㈧引。

运用竞争酶标检测“瘦肉精”具备以下优点㈨：①实验特异性强，试舯孙∞∞们∞加ｍ０％崮＼∞第３期左晓磊等：应用ＥＬＩＳＡ对畜产品瘦肉精残留的快速筛选・７ｌ・验结果较为准确；②高度灵敏，对尿液中克伦特罗的检测下限为１００ｎｇ／ｋｇ；③实验重复性强，对尿样做重复试验，定量分析结果误差在１００ｒｉｇ／ｋｇ的为８７％，误差在２００ｎｇ／ｋｇ的为１２％，误差在３００ｎｇ／ｋｇ的为ｌ％；④实验平行性高，在检测过程中，对标准液和样品做２个平行试验，其相对误差小于５％。

酶标法也有缺点，如出现非特异性反应，即酶促反应的有色产物会快速放大，实验中只要沾少许酶分子就会产生明显的非特异反应。

因此，一般将酶标检测做筛选法而不做仲裁法吲。

参考文献：［１］张吟，陈一农．克伦特罗药理作用的研究进展［Ｊ］．海峡药学，２００２，（５）：１０一１２．［２］李杰．瘦肉精残留危害与动物性食品安全［Ｊ］．中国饲料，２００３（４）：３ｌ一３２．［３］赵彦光，戴志明．瘦肉精的查禁和检测方法［Ｊ］．饲料广角，２００３，（２１）：２２—２３．［４］刘国艳，柴春彦．动物性产品中盐酸克伦特罗（瘦肉精）检测方法研究进展［Ｊ］．动物科学与动物医学，２００２，（４）：３２—３４．［５１黄只间．运用ＥＬＩＳＡ检测“瘦肉精”的技术要点［Ｊ］．福建畜牧兽医，２００４，（４）：４０．『６１余光涛，吴存悌．浅谈禁用“瘦肉精”监控工作的体会及存在问题［Ｊ］．中国动物检疫，２００２，（１９）：１９—２０．ｆ７］吴存悌．生猪“瘦肉精”问题的现状与对策［Ｊ］．福建畜牧兽医，２００２，（２）：１８—１９．［８］王东卫．畜产品中瘦肉精快速检测技术［Ｊ］．农产品市场周刊，２００３，（４）：２３—２４．［责任编辑杜晓东］＊ｅ斗ｅ斗窜斗ｅ斗ｅ斗辜■ｅ斗ｇ＊ｅ斗搴斗ｇ牛ｇ斗ｇ牛辜艇！牛阜牛晕斗ｅ斗窜斗皋冲ｅ斗搴艇ｆ艇！艇！斗辜斗ｅ艇！拍ｃ斗ｅ牛ｅ牛ｅ斗ｅ斗ｅ斗辜斗ｅ斗ｅ垮ｅ斗皋斗ｅ斗ｅ耳ｅ斗枣■ｅ欢迎订阅２００７年《西南农业学报》《西南农业学报》是由西南六省、市农科院联合主办的国内外公开发行的综合性农业学术期刊。