大鼠大脑皮质神经元的原代培养
大鼠皮层神经元细胞原代培养 ppt课件
Hale Waihona Puke ppt课件11实验步骤
5 剪碎：
将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用 手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗 三次，转移至离心管中离心1000 rpm 5min 。
6 消化：
加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化 20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。
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9
实验步骤
布局
器械
PBS 剪碎组织块
取脑，分离皮层神经 元
剥离血管及筋膜
PBS
冰盒
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酒精
PBS
断头
清洗血液
10
实验步骤
3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿
内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无 菌的生理盐水冰浴上。
4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯
培养基
材料
包被
剥膜
消化
低温操作
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影响因素
材料选择
胎鼠就要胎鼠，新 生鼠就要新生鼠， 不能混淆
★易于操作 ★有一些受体，在 培养的工作中失去 功能，会不能再生
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影响因素
培养基选择
不建议血清培养
1 血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量； 2 抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验； 3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，
皮层神经元细胞原代培养
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1
☞ 主要内容 :
1
2
3
4
实验原理
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代、试剂Poly-L-lysine (Sigma,P2636)DMEM (Invitrogen,11995-065)二、器械手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪x13ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-011) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B )7) dd H 2O8) 75％酒精1) 2) 100 ml 小烧杯3) 200 目不锈钢筛4) 细胞计数器（求精）5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790)6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641)7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛）8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)9)10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B11) 注射器：50ml、5ml 各112) Pipette and pipette tips13) 冰袋、手套、口罩Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。
2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。
2.3以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。
一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定_姜茜
·技术方法·一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定姜 茜,姜玉武■,王静敏,秦 炯,吴希如(北京大学第一医院儿科,北京 100034)[摘 要]目的:对原有大鼠皮层神经元原代培养方法进行改进,以获得数量更多、纯度更高、体外生长时间更长的神经细胞进行相关实验研究。
方法:使用3种不同成分的液体对培养器皿进行序贯预处理,分离16～17d 胎龄的Wi s t a r 大鼠胎鼠皮层,采用木瓜蛋白酶化学消化与机械吹打相结合的方法制备单细胞悬液,经细胞计数后按照不同实验目的进行梯度密度接种。
细胞接种当日4～6h 将含有血清的接种培养液换为添加B 27的N e u r o b a s a l 无血清培养基,培养第3天(D I V 3)用终浓度10μm o l /L 的阿糖胞苷(c y t o s i n e a r a b i n o s i d e ,A r a -C )处理24h 抑制胶质细胞增殖,以后每周半量换液1次。
用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e dp r o t e i n 2,M A P 2)与细胞核双标记法鉴定培养神经细胞的纯度,并以免疫荧光法检测突触前、后标记物以评估突触形成情况。
结果:与单纯多聚赖氨酸预处理培养器皿,胰蛋白酶化学消化法分离细胞及含血清培养基培养的原方法相比,方法改进以后收获的细胞产量明显增加,且消化过程对细胞损伤小,接种后细胞分散均匀,杂质少,纯度高,树突、突触发育正常,可长期存活。
结论:该方法简便可行,结果稳定,用该方法培养的大鼠皮层神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型。
[关键词]大脑皮质;神经元;细胞,培养的;木瓜蛋白酶;免疫组织化学[中图分类号]R 329.2 [文献标识码]A [文章编号]1671-167X (2009)02-0212-05d o i :10.3969/j .i s s n .1671-167X .2009.02.019A ni m p r o v e dm e t h o df o r p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n a n d c e l l i d e n t i f i c a t i o nJ I A N GQ i a n ,J I A N GY u -w u ■,WA N GJ i n g -m i n ,Q I NJ i o n g ,WUX i -r u (D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s ,P e k i n g U n i v e r s i t y F i r s t H o s p i t a l ,B e i j i n g 100034,C h i n a )A B S T R A C T O b j e c t i v e :T o i m p r o v e p r e v i o u s m e t h o d o f p r i m a r y r a t c o r t i c a l n e u r o nc u l t u r e t o g e t p u r e ra n d m o r e l o n g -l a s t i n g c e l l s f o r s t u d y .Me t h o d s :T i m e d -p r e g n a n t W i s t a r r a t s a t a g e s t a t i o n a l a g e o f 16o r 17d a y s (16-17d )w e r e u s e d .F e t a lb r a i n s w e r e r e m o v e d a n d t h ec e r e b r a l c o r t i c e s w e r ed i s se c t e d o u t .P a p a i n d i g e s t i o na n dm e c h a n i c a l d i s s o c i a t i o nw e r ec o m b i n e dt oc o n d u c t m o n o -c e l l s u s p e n d i n g m e d i a .F o u r t o s i x h o u r s (4-6h )p o s t -p l a t i n g ,a l l p l a t i n g m e d i a w e r e r e m o v e df r o mc u l t u r e s a n d r e p l a c e d w i t h N e u r o b a s a l m e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t h B 27.O n t h e t h i r d d a y ,10μm o l /L c y t o s i n e a r a b i n o s i d e (A r a -C )w a s a d d e d t o t h e c u l t u r e f o r 24h t o i n h i b i t t h e o u tg r o w t ho f g l i a l c e l l s .H a l f o f th e c u l t u r e m e di u mw a s c h a n g e d e v e r yw e e k .T h e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f n e u r o nc e l l s w e r eo b s e r v e db yl i g h t m i c r o s c o p e .D o u b l e i m m u n o -s t a i n i n g o f m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e d p r o t e i n 2(M A P 2)a n d k a r y o n w e r e a p p l i e d t o a s s e s s t h e c u l t u r e p u r i t y .E v a l u a t i o n o f s y n a p s e f o r m a t i o n w a s p r o c e s s e d b y i m m u n o c y t o c h e m i c a l a n a l y s i s u s i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t b o t h p r e -a n d p o s t s y n a p t i c p r o t e i n m a r k e r s .R e s u l t s :T h e i m p r o v e d m e t h o d c o u l dr e -m a r k a b l y i n c r e a s e t h e c e l l n u m b e r a n d r e d u c e n e u r o n a l d a m n i f i c a t i o n .T h e p r i m a r y c u l t u r e w a s c h a r a c t e -r i z e d b y h i g h u n i f o r m i t y ,p u r i t y ,n o r m a l s y n a p s e f o r m a t i o n a n d l o n g t i m e l i v a b i l i t y .C o n c l u s i o n :T h i s i s a s i m p l e a n d r e l i a b l e t e c h n i q u e f o r t h e i n v i t r o p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n s .K E Y WO R D S C e r e b r a l c o r t e x ;N e u r o n s ;C e l l ,c u l t u r e d ;P a p a i n ;I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270448、30470555、30870865)S u p p o r t e db yN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a (30270448,30470555,30870865)■C o r r e s p o n d i n ga u t h o r 's e -m a i l ,j i a n g y w @263.n e t 神经细胞是构成神经系统的基本结构和功能单位。
新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定
新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【摘要】目的探讨新生大鼠视皮层神经元的原代培养方法,以获取数量多、纯度高的视皮层神经元.方法取新生1d内的SD大鼠视皮层,通过胰酶消化法获取单细胞悬液,倒置相差显微镜下计数后种植于6孔培养板内培养.培养24 h后用终浓度10μmol·L-1阿糖胞苷处理,抑制非神经元的生长,作用24h后半量换液,以后每隔1d半量换液1次.每天倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况和形态变化,Nissl染色法进行视皮层神经元鉴定,免疫荧光显示神经元特异性烯醇化酶鉴定培养视皮层神经元的纯度.结果接种4h后,大部分细胞已贴壁,细胞立体感较强；接种后24h,大部分细胞长出短的突起,细胞形态发生变化,胞体呈多边形或三角形,细胞周围有或多或少的光晕；培养4d后,细胞突起伸长、增粗；培养6～8d后,细胞状态较佳,细胞胞体饱满,光晕明显,突起进一步伸长、增粗,且分支多,突起交织成网状,非神经元细胞减少,为实验的最佳时间；培养14 d后,细胞开始退化.培养6d行焦油紫染后,倒置相差显微镜下观察,可见细胞内的尼氏体呈蓝紫色的颗粒或斑块.免疫荧光染色结果显示,原代培养的细胞中,大部分细胞为绿染细胞,形态良好,核大而清晰,神经元所占比例高.结论本研究获得视皮层神经元的方法简单经济,通过形态学观察、Nissl 染色及免疫荧光染色可以对体外培养的视皮层神经元细胞进行准确鉴定.【期刊名称】《眼科新进展》【年(卷),期】2013(033)008【总页数】3页(P733-735)【关键词】视皮层;神经元;原代培养;大鼠【作者】宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【作者单位】453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453000 河南省新乡市,解放军371医院;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室【正文语种】中文视皮层是视觉系统的高级中枢，培养观察视皮层神经元对弱视等与视皮层相关性眼科疾病的基础研究具有重要的意义。
新生鼠海马、皮层神经元原代培养
新生鼠海马、皮层神经元原代培养实验材料1. 实验动物新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。
2. 试剂Hibernate ANeurobasal AB27 serum-free supplementsPapin （木瓜蛋白酶）DNAase IOptiPrep Density Gradient MediumPoly-L-lysine （多聚赖氨酸）L-glutamine （L-谷氨酰胺）Penicillin （青霉素）Streptomycin （链霉素）D-Hank’s solutiondd H2O3. 溶液配制1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。
（可配成25×）2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。
3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。
在使用前3h内配制。
4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。
可一次配好，-20°C保存，每次取用。
4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。
现用现配，37°C保存备用。
5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。
5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。
现用现配，37°C保存备用。
4．实验方法1. 包被培养皿使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。
大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养
大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月一、试剂1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636）2)DMEM（Invitrogen,11995-065）3)FBS（Invitroge,10099-141）4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）5)B27（Invitrogen ,17504-044）6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）9)DPBS（HyClone，SH30028.01B）10)dd H2O11)10％水合氯醛12)75％酒精二、器械1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x12)200 ml小烧杯（盛放胎鼠）3)200目不锈钢筛4)细胞计数器（求精）5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）10)注射器：50ml、5ml各 111)Pipette and pipette tips12)冰袋、手套、棉球、棉签Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
原代神经元培养
神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。
器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。
辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。
2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。
4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。
5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。
用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。
胚胎大鼠皮质神经元培养中细胞消化及重悬改进-细胞生物学论文-生物学论文
胚胎大鼠皮质神经元培养中细胞消化及重悬改进-细胞生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——随着现代神经科学及分子生物学的发展，在多个研究领域中原代大鼠大脑皮层神经细胞的培养日益被广泛应用，不仅促进了对神经元结构和功能的进一步了解，还为大脑神经系统疾病发病机制研究及药物的作用机制研究提供了一个平台。
但在具体的实验操作中，胎鼠大脑皮层神经元的分离和体外培养方面仍然存在一系列问题，如胎鼠胎龄难以控制，新生鼠进行神经元培养时细胞存活率较低，细胞数量少、细胞损伤大及神经元纯度欠佳等，严重限制了后续研究的进行。
因此，本研究在参照相关文献[1-5]及反复实验的基础上，对细胞消化及重悬细胞等步骤进行了适当改进，得到了较理想的培养结果。
详情如下。
1 材料与方法1.1材料1.1.1实验动物将适龄的Wistar大鼠（吉大医学部实验动物中心提供）雌雄各一只合笼过夜，次日观察，以见到阴栓开始将该雌鼠单独饲养并计算时间。
以24h为1d,至第16d时可用于实验。
1.1.2实验试剂及溶液的配制多聚赖氨酸（分子量70,000-150,000）购自美国Sigma公司。
L-谷氨酰胺（200mM 100X）、DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司。
细胞爬片（24孔）购自alafa公司。
胎牛血清购自四季青公司。
B27、Neurobasal神经元专用培养液、兔抗大鼠一抗、山羊抗兔荧光二抗购自美国life公司。
PBS缓冲液pH调至7.3-7.4,高压灭菌，4℃保存。
PDL包被液：用三蒸水配制1mg/ml的PDL储液，微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。
含血清培养液：87%Neurobasal+2%B27（50）+1%L-glutamine（200mmol/L）+10%胎牛血清，混匀，4℃保存。
无血清培养液：97%Neurobasal+2%B27（50）+1%L-glutamine（200mmol/L）,混匀，4℃保存备用。
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大鼠大脑皮质神经元的原代培养【摘要】目的探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法。
方法体外原代培养新生大鼠大脑皮质神经元，应用免疫细胞化学法及电子显微镜鉴定神经元。
结果用神经基础培养基(Neurobasal-A)+B27培养的神经元纯度可达85%，生长状态较佳。
结论以Neurobasal-A+B27培养的大鼠大脑皮质神经元活性较佳，纯度较高，是体外研究神经系统相关理论的良好模型。
【关键词】大脑皮质; 神经元; 疾病模型，动物；细胞，培养的ABSTRACT: Objective To establish a primary culture method of the rat cortical neurons. Methods Primary culture of cortical neurons was made from newborn rats. Immunocytochemical and electronic micoscopic methods were used to identify the cultured neurons. Results The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 grew quite well and the purity was about 85%. Conclusion The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 medium are active and rather pure and could be a good model for research of the nervous system.KEY WORDS: cerebral cortex; neurous; disease models，animal; cells，cultured; nuride中枢神经系统的各种疾病如缺氧缺血性脑病、中风等对大脑皮质神经元均有不同程度的损伤，为研究其具体的作用机理及防治措施，建立合适的体内外模型至关重要。
神经元原代培养是研究神经元形态结构及缺氧、缺血、中毒、外伤等病理因素影响的重要方法之一，为进一步的研究提供良好的原代神经元生物学材料，笔者探讨大鼠大脑皮质神经元的原代培养方法。
1 材料与方法1.1 试剂和动物神经基础培养基(Neurobasal-A)、胎牛血清(FBS)、B27(美国Gibco公司)，左旋多聚赖氨酸(PLL，美国Sigma公司)，DF-12(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶(美国Amerisco公司)，NSE(Neuron-Specific enolase，神经元特异性烯醇化酶)多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，UltraVision二抗试剂盒(美国Neomarker公司)，其他试剂为国产分析纯。
新生健康SD大鼠(<24 h)［福建医科大学实验动物中心，许可证号SCXK(闽)2004-002］。
1.2 皮质神经元原代培养培养方法按参考文献［1-3］改进后进行。
大鼠3只，75% 冷乙醇浸泡3~5 min，无菌条件下断头杀死，取出大脑，放入预冷的D-PBS平衡盐液中。
在解剖镜下仔细分离去除脑膜及血管，分离出大脑皮质并剪碎成约1 mm×1 mm×1 mm大小。
组织块以0.25% 胰蛋白酶消化，并用含10%FBS的DF12完全培养基制成单细胞悬液，以1×106mL-1密度接种在经PLL处理过的培养瓶，于37 ℃、相对体积分数为0.05的CO2培养箱中进行培养。
细胞培养4 h后，将种植液(含10% FBS的DF12)全量换成含2%B27的Neurobasal-A培养基维持培养，以后每隔3 d以Neurobasal-A/B27半量换液。
培养瓶包被方法:用0.01 mg/mL的PLL 37 ℃包被1 h，PBS洗2遍，直接接种。
1.3 形态学观察将培养不同时间的神经元于LEITZ倒置显微镜下进行观察，注意神经元的生长状况。
1.4 免疫细胞化学鉴定神经元培养4 d，弃去培养液;冷4％多聚甲醛固定20 min;3％H2O2阻断内源性过氧化物酶;封闭后滴加一抗NSE多克隆抗体(1∶200)，4 ℃过夜;加二抗(生物素标记羊抗免IgG)，室温孵育30 min;DAB显色;中性树胶封固，镜下观察。
阴性对照实验用0.01 mol/L PBS代替一抗，其余步骤同上。
镜下随机选取30个视野，计数NSE阳性神经元的百分率。
1.5 电子显微镜观察用玻璃瓶常规培养细胞至4 d时，以胰蛋白酶消化分离并收集细胞，迅速投入3 %戊二醛＋1.5 %多聚甲醛混合电镜固定液中，经1 %锇酸后固定，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，透射电镜下观察，注意神经元的超微结构。
2 结果2.1 细胞形态学变化培养4 h细胞基本贴壁，呈圆形透亮，体积小，立体感强，偶见少数细胞伸出细小短突起。
培养1 d，大部分细胞长出突起，长度约为胞体直径的1~2倍，偶见相邻突起相连接;胞体圆形或椭圆形，饱满，光晕明显(图1A)。
培养2 d，细胞数目增多，突起增长(图1B)。
培养3 d，胞体明显增大，呈圆形、椭圆形或锥体形，表面光滑，折光性强;突起明显增长，较多突起相连接(图1C)。
培养4 d后，突起进一步增多、增长。
培养6 d时，神经元胞体开始聚集，突起相连呈网络样生长(图1D)。
培养7 d，胞体聚集更明显。
随着培养时间的延长，神经元突起纵横交错，难以辨认突起的起源(图1E)。
2.2 神经元的免疫组织化学鉴定取不同培养时间的细胞行NSE免疫组化染色发现:培养4 d以前的细胞含有较多的非神经元细胞，神经元阳性率低;培养5 d以后的细胞神经元阳性率增高，但其胞体开始聚集，甚至突起互相交错、难以辨认突起的起源，染色阳性的神经元形态不典型。
取培养4 d的细胞进行染色，发现神经元的形态比较典型，阳性率也较高，其结果显示:NSE阳性神经元的细胞质和突起呈棕色或棕褐色，细胞核淡染，神经元胞体呈圆形、椭圆形或锥体形等，有较长的突起伸出，突起为单极、双极或多极(图2)。
阴性细胞的细胞质和突起未呈棕色或棕褐色。
计算NSE阳性细胞百分率，神经元数目可达85%以上。
2.3 神经元的超微结构常规条件下培养4 d的神经元超微结构最典型，在电镜下可见其细胞膜完整，细胞质含有丰富的核糖体、粗面内质网等细胞器;核大，呈圆形或椭圆形，常偏位，核膜完整，染色质分布均匀(图3)。
3 讨论神经元体外培养是神经元发育分化、神经再生、神经系统疾病的发生机制等众多研究领域的重要模型，该模型具有影响因素单一、机体复杂因素干扰少和结果易分析等优点。
因此神经元体外培养随之成为神经科学研究领域的关键技术。
在神经元的体外培养过程中应注意以下几个方面。
3.1 培养液的选取培养液是否合适是神经元培养能否成功的关键因素之一。
血清中含有多种蛋白质、多肽、激素、生长因子等营养物质能够促进神经元贴壁生长及对体外环境的适应，但血清对胶质细胞的增殖作用很强。
在神经组织的分离细胞悬液中，除了神经元之外，还有一些非神经元细胞是无法完全去除的，包括神经胶质细胞、脑脊膜细胞以及成纤维细胞等［4］。
因此所采用的培养液应尽量减低非神经元细胞的存活力，提高神经元的纯度。
以往神经元的培养多采用DMEM培养基，并以抗有丝分裂剂阿糖胞苷来抑制神经胶质细胞的生长［3，5］，获得较高的纯度。
但阿糖胞苷对神经元亦有一定的毒性，对其活性有不同程度的影响，并且大量胶质细胞死亡后的产物也不利于神经元的生长。
故本实验选用富含神经元生长所需的各种营养物质的神经基础培养基，它被认为是神经元培养的良好基质［6］。
本实验对神经元原代培养方法的改进之处在于:不用阿糖胞苷等有丝分裂抑制剂，培养中不是全程使用有血清培养基，而是以有血清培养基(含10%胎牛血清的DF12培养基)作为种植液，种植培养4 h后，全量换为无血清限定性培养基(Neurobasal＋B27)维持培养。
由于培养中不加入阿糖胞苷，避免了其毒性作用。
其中种植液中所含的血清能够保证细胞基本贴壁，提高了培养细胞的存活率;而维持液中的Neurobasal-A+B27添加物不仅能够促进原代培养神经元的存活和生长分化，还能抑制非神经元的分裂增殖［1］，因此大大提高了神经元的纯度。
实验结果发现采用此法培养神经元时，神经元的生长更接近体内自然环境，细胞状态良好，神经元突起间形成网络样的生长趋势，神经元培养4 d时的阳性率可达85%左右;电镜结果亦表明所培养的神经元超微结构完整、细胞器丰富。
故笔者以为，此法不需使用抑制胶质细胞的药物，减少药物对神经细胞的损伤，培养的神经元活性较佳，可以推广应用。
文献报道用Neurobasal＋B27培养的神经元纯度高达90%甚至99%［1，7-8］，但本实验培养的神经元纯度仅为85%，相差甚远，可能是取材部位不同，或者取材不够准确、非神经细胞过多、神经元活性差，抑或细胞培养时间不同等因素的影响。
笔者认为培养的神经元中含有少量的杂质细胞如胶质细胞等，使二者处于共存状态，更接近体内环境，更有利于神经元的生长;培养神经元纯度达85%已基本能满足体外研究的需要。
3.2 促贴壁物质的使用用于培养神经元的瓶、皿及盖玻片宜用多聚赖氨酸、层粘连蛋白或鼠尾胶原预先包被。
未用PLL等包被时神经细胞易聚集成团、基本不贴壁或仅有少数几个贴壁，无法继续培养。
用PLL包被时，其浓度从0.01 mg/mL到0.25 mg/mL均可，本实验室曾用过0.01，0.025，0.1 mg/mL未发现有明显区别。
但大剂量PLL对细胞有毒性，有时神经元生长缓慢可能与此有关，故在保证贴附的前提下，浓度越低越好。
3.3 细胞接种密度的选择体外培养的神经元在缺乏外源性神经营养因子的情况下，存活率与接种的细胞密度尤为相关，接种密度过小时，神经元很难存活;而细胞密度过高时又可产生接触抑制，神经元的存活率也很低，且密度高时神经元间突起互相交错而不便于观察单个神经元体外发育过程中树突、轴突、生长锥、突触等亚细胞结构的变化。
因此，选择合适的接种密度尤为重要。
本实验经过较长时间的摸索发现，大鼠大脑皮质神经元以1.0×105cm-2 (1.0×106mL-1)的密度接种时生长状态较佳，笔者认为细胞培养至4 d时形态最典型可能与此接种密度有关。
因此，不同实验室采用不同密度接种时，细胞出现典型形态的时间不一致，对细胞进行干预的时间随之而异。
3.4 杂质的去除研究发现刚接种培养的神经元前2~3 d背景较脏，可见较多杂质，但并不影响神经元的生长，经换液后背景逐渐变清晰。