新生BALB／c小鼠大脑皮质神经元细胞培养方法的建立

生　物　技　术　通　讯　ＬＥＴｒＥＲＳ　ＩＮ　Ｂ１０ＴＥＣＨＮ０Ｌ０ＧＹ　Ｖｏ１．２２　Ｎｏ．１　Ｊａｎ．，２０１１　

ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２０１１．０１．０２０　技术方法　

新生ＢＡＬＢ／ｃ小鼠大脑皮质神经元细胞培养方法的建立　辛岗，苏芸，王革非，许燕璇，李康生　汕头大学医学院微生物与免疫学教研室，广东省免疫病理重点实验室，广东汕头５１５０４１　

［摘要】　目的：经改良和优化，建立高纯度ＢＡＬＢ／ｃ小鼠大脑皮质神经元培养的方法。方法：采用Ｌ一多聚赖氨酸包被　细胞培养板，取新生ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（出生２４　ｈ内）大脑皮质组织，经Ｏ．２５％胰酶消化后吹打成单个细胞，按ｌｘ１０６／孔　接种于３５　ｍｍ的六孔板中，用神经元细胞培养种植液培养６　ｈ后换神经元细胞培养饲养液，培养４０　ｈ时加入阿糖　胞苷抑制神经胶质细胞的生长，随时观察神经元培养情况。结果：培养５　ｄ的神经元细胞形态最为典型；经免疫荧光　方法鉴定，神经元细胞纯度为９３％。结论：经方法改良与优化，获得了高纯度的原代培养小鼠大脑皮质神经元细胞。　［关键词】　大脑皮质；神经元细胞；培养；ＢＡＬＢ／ｃ小鼠　【中图分类号］Ｑ８１３．１　［文献标识码】Ａ　［文章编号】１００９—０００２（２０１１）０１—００８５－０４　

Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｒｅｂｒａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　Ｎｅｗｂｏｒｎ　ＢＡＬＢ／ｃ　Ｍｉｃｅ　

Ｘ／Ｎ　Ｇａｎｇ，ＳＵ　Ｙｕｎ，ＷＡＮＧ　Ｇｅ—Ｆｅｉ，ＸＵ　Ｙａｎ－Ｘｕａｎ，ＬＩ　Ｋａｎｇ－Ｓｈｅｎｇ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｔｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｋｅｙ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｈａｎｔｏｕ　５１５０４１，Ｃｈｉｎａ　

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｎｅｗｂｏｒｎ　ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｃｏｒｔｅｘｅｓ　ｆｒｏｍ　ｎｅｗｂｏｒｎ（１ｅｓｓ　ｔｈａｎ　２４　ｈ１　ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　０．２５％　ｔｒｙｐｓｉｎ．ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ．Ａｂｏｕｔ　ｌ￣１０　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｅｄｅｄ　ｏｎｔｏ　ｅａｃｈ　３５　ｍｍ　ｄｉｓｈ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｃｏａｔｅｄ　ｂｙ　ｐｏｌｙ—Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ　ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ　ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ．Ａｆｔｅｒ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｉｎ　ｓｅｅｄｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　６　ｈ．ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｎ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｂ２７，　ＦＢＳ，　ａｎｄ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ．　Ｃｙｔｏｓｉｎｅ　ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ　ｗａｓ　ａｄｄｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ａｔ　ａ　ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　５　ｍｇ／ｍＬ　ｏｎ　４０　ｈ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｎ　ｃｅｌｌｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｍｏｒｐｈｏｒｌｏｇｙ　ａｔ　ｄａｙ　５．Ａｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｕｓｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｎｅｕｒｏｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＢⅢ　ｔｕｂｕｌｉｎ．ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｗａｓ　９３％．Ｃｏｎｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｎｅｕｒｏｎ　ｆｒｏｍ　ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ；ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌｓ；ｃｕｌｔｕｒｅ；ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅ　

中枢神经系统包含２类细胞，即神经元和神经　胶质细胞，这些细胞构成高度复杂的神经元和神经　胶质细胞网络。神经元细胞体外培养是研究神经系　统疾病、神经元与神经胶质细胞关系的重要技术。　神经元细胞培养一般采用孕鼠，多数采用大鼠【ｌ】。小　鼠虽然是研究神经系统疾病的重要模型，但用新生　小鼠进行神经元培养的方法文献却较少，仅见Ｂｏｎ—　ｇａｒｚｏｎｅ等采用新生ＳＪ／Ｌ／Ｌ小鼠［２１、Ａｈｌｅｍｅｙｅｒ等采　用新生ＣＤ５７Ｂ１／６Ｊ小鼠皮层［３１进行了神经元培养。　小鼠神经细胞与大鼠神经细胞具有很大的不同，在　神经元培养上需要注意胰酶消化的浓度和时间、加　入阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的时机等。我们经过　改良和优化，建立了一种高密度、高纯度的ＢＡＬＢ／ｃ　小鼠大脑皮质神经元细胞的培养方法。　

１材料和方法　１．１材料　出生２４　ｈ内的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，由汕头大学医学　院实验动物中心提供。　神经元培养中所需Ｌ一多聚赖氨酸（ｐｏｌｙ—Ｌ—Ｉｙ—　ｓｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ，相对分子质量≤１５０　０００）、阿糖　胞苷购自Ｓｉｇｍａ公司；Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培养基、ＤＭＥＭ／　Ｆ１２培养基、Ｌ一谷氨酰胺、Ｂ２７、抗生素一抗真菌素、　

［收稿日期］　［基金项目］　

［作者简介】　［通信作者】　２０１０—０６—１　ｌ　国家自然科学基金（３０７７１９８８）；广东省医学科研基金　（Ａ２０１０３９２）；汕头市科技计划项目（汕府科［２００９１７０号）　辛岗（１９７３一），女，硕士，副教授　李康生，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｋｓｌｉ＠ｓｔｕ．ｅｄｕ．ａｎ　８６　１Ｔｒ热Ｉ　Ｉ术通Ｉ ｖ・．２２　Ｎ．１　Ｊ．２０１１０ＴＥＣＨＮ０　Ｙ　ｏｌ　Ｎｏ　Ｊａｎ　２ＵＩ　Ｉ　ＥＴｒＥＲＳ　ＩＮ　ＢＩ　Ｌ０Ｇ　Ｖ　・　ｌ　・，　０．２５％胰酶（含０．０２％ＥＤＴＡ）购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛　血清（ＦＢＳ）购自杭州四季青公司。　神经元鉴定中所需试剂兔抗神经元特异Ｂ　１１Ｉ微　管蛋白（ａｂ１８２０７）购自Ａｂｃａｍ公司；荧光素标记的　山羊抗兔ＩｇＧ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。　１．２　小鼠大脑皮质神经元细胞原代培养　细胞培养板（Ｃｏｓｔａｒ）在使用前用０．０１％的Ｌ一多　聚赖氨酸包被，室温过夜后用双蒸水洗３次，置超　净台内风干。　取新生ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，剥离硬脑膜，摘下大脑皮　质（冰上操作），置于装有预冷磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）　的离心管中，取完全部大脑皮质后吸去上清，用冷　ＰＢＳ冲洗２次，弃上清，在预冷的含ＰＢＳ的培养皿　中剪碎组织；加入等量预热至室温的０．２５％胰酶，　３７℃消化５　ｒａｉｎ，用含２Ｏ％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２终止　消化，吹打成匀浆；３００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，弃上清；　加入神经元细胞种植液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２，１％抗生素一抗　真菌素，１％谷氨酰胺，１０％ＦＢＳ），过２００目筛网，进　行细胞计数；接种６孑Ｌ板（３５　ｍｍ），密度１×１０６／孔；　用种植液培养细胞６　ｈ后，以３７℃的ＤＭＥＭ／Ｆｌ２　洗细胞，换饲养液（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ，１Ｏ％ＦＢＳ，２％Ｂ２７，　ｌ％抗生素一抗真菌素，１％谷氨酰胺）培养，观察细胞　生长情况，４０　ｈ时换用阿糖胞苷培养液（５￣ｇ／ｍＬ　于饲养液中，换半液）培养，以抑制神经胶质细胞及　杂细胞等的生长，即可获得纯培养的原代神经元细　胞。　以上是优化后的培养方法。同时，采用以下实　验过程进行了比较：培养前用０．Ｏ１％的Ｌ一多聚赖氨　酸包被或不包被细胞培养板，观察神经元生长情　况；胰酶消化过程采用０．２５％胰酶于３７℃消化５　ｍｉｎ或用０．１２５％胰酶于３７℃消化１０　ｍｉｎ后，比较　单个细胞的数量是否有差别；分别按５ｘｌＯ　／？Ｌ、１×　ｌ０６／孔、５￣１０６／孔接种细胞于细胞培养板中，选取最　合适的细胞密度，再在不同时间点（４０、６４、１２０　ｈ）　加入５或１０　ｍＬ阿糖胞苷，比较神经元细胞的　生长纯度。　１．３　免疫荧光技术鉴定神经元细胞　神经元特异的ＢＨＩ微管蛋白在胚胎和出生后的　中枢和外周神经系统中表达丰富，分布在神经元整　个细胞中，包括细胞浆、轴突和树突，是神经元的特　异性标志之一。由于其表达量大，且分布于整个细　胞，因此免疫染色效果较好。神经元细胞培养５　ｄ　后，用预冷的ＰＢＳ洗３次，用预冷的４％多聚甲醛固　定１５　ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３次；再用０．１％的Ｔｒｉｔｏｎｌ００穿透　细胞１０　ｒａｉｎ，ＰＢＳ洗３次；加抗神经元特异　１１１微　管蛋白抗体，至终浓度为１　ｍｇ／ｍＬ，３７ｏＣ孵育１　ｈ，　ＰＢＳ洗３次；加荧光素标记的山羊抗兔ＩｇＧ，ｌ：１０００　稀释，３７ｃｌＣ避光孵育１　ｈ，ＰＢＳ洗３次；用５０％甘油　ＰＢＳ封片后于荧光显微镜下观察，荧光阳性细胞即　为神经元细胞。随机选取视野，比较相差显微镜和　荧光显微镜下的结果，相差显微镜下计数５００个细　胞，计算荧光阳性细胞与相差显微镜下观察到的细　胞数量的比例，即为神经元细胞的纯度。　

２结果　２．１　大脑皮质神经元细胞纯培养　采用改良优化后的方法，小鼠神经元细胞接种　于细胞培养板中后，可见大而圆的神经元细胞，６　ｈ　可观察到明显的细胞突起，随后可见粗大的轴突形　成；４０　ｈ左右神经元细胞轴突形成的网状结构逐渐　密集，此时可见部分神经胶质细胞开始明显增多，　应立即加入阿糖胞苷以抑制神经胶质细胞的分裂　增殖，此后神经胶质细胞生长受到抑制。培养第５　ｄ　时神经元细胞形态最为典型（图１），其轴突和树突　交织成稳定的网状结构。典型成熟的神经元具有大　而清晰的核，主要特征为具有圆锥形长突起，轴突　的直径全长均一，而树突的直径从胞体向末梢逐渐　变细。　在培养前，采用０．０１％的Ｌ一多聚赖氨酸包被细　

图１　小鼠神经元原代培养不同时间形态变化图（４００ｘ）　Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ：培养时间分别为２Ｏ、４Ｏ、６Ｏ和ｌ２０　ｈ