红霉素合成基因簇
微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新
微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新【关键词】 ,微生物次级代谢产物；,,生物合成基因簇；,,药物创新；,,组合生物合成；,,代谢工程摘要：微生物产生众多结构和生物活性多样的次级代谢产物，其生物合成基因簇的克隆是药物创新和产量提高的必要前提。
迄今为止已有超过150种生物合成基因簇通过各种方式被克隆，并被用于组合生物合成、体外糖类随机化、代谢工程的定向改造。
我们研究室已经克隆并测定了氨基糖苷类井冈霉素/有效霉素、多烯类抗生素FR008/克念菌素、聚醚类南昌霉素、聚酮类梅岭霉素、杂合聚酮多肽类口恶唑霉素等生物合成基因簇。
深入的基因功能分析揭示了他们独特的生物合成途径和调节机理，为正在进行的组合生物合成结构改造和代谢工程产量提高奠定了基础。
关键词：微生物次级代谢产物；生物合成基因簇；药物创新；组合生物合成；代谢工程Secondary metabolic pathway genes and new drug discoveryABSTRACT Microorganisms produce myriads of secondary metabolites with both structural and functional diversities. The cloning of corresponding biosynthetic gene clusters is essential for new drug discovery and yield improvement by metabolic engineering. To date, more than 150 biosynthetic geneclusters had been cloned via different strategies, which are subsequently manipulated through combinatorial biosynthesis, in vitro glycorandomization, or other biotechnological methods. In our laboratory, several biosynthetic gene clusters have been cloned and sequenced, representatives of which are responsible for the biosyntheses of the aminoglycoside jinggangmycin/validamycin, polyene antibiotic FR008/candicidin, polyether nanchangmycin, polyketide meilingmycin, PKSNRPS oxazomycin and others. Extensive analyses of gene functions, their unique biosynthetic pathways and regulatory mechanisms have now paved the way for more rational structural modifications through combinatorial biosynthesis and yield improvements using metabolic engineering.KEY WORDS Microbial secondary metabolites; Biosynthetic gene cluster; New drug discovery; Combinatorial biosynthesis; Metabolic engineering微生物产生的次级代谢产物在化学结构和生物活性方面多种多样，主要的产生菌类群包括放线菌、芽孢杆菌、粘细菌、假单胞菌、蓝细菌、真菌等，其中已知抗生素的三分之二以上是以链霉菌为代表的放线菌产生的。
放线菌药物高效生物合成关键技术及其产业应用
放线菌药物高效生物合成关键技术及其产业应用发布时间：2021-09-14T02:15:59.176Z 来源：《基层建设》2021年第17期作者：阿•娜清[导读] 摘要：放线菌具有丰富多样的次级代谢产物，一直是抗生素及其先导化合物的主要来源之一。
伊犁川宁生物技术股份有限公司新疆伊宁市 835000摘要：放线菌具有丰富多样的次级代谢产物，一直是抗生素及其先导化合物的主要来源之一。
放线菌的基因工程和抗生素生物合成的代谢调控也是近年来微生物次级代谢研究的热点。
结合近期的研究成果，导致基因表达的调控、基因簇拷贝数和基因簇异源表达的增加、抗性和转运基因的过度表达、前体代谢通量和核糖体工程代谢的改善。
关键词：抗生素；生物合成；代谢调控；放线菌微生物可以产生多种具有生物活性的次级代谢产物。
大多数活性次生代谢物来自放线菌。
这些物质具有抗菌、抗肿瘤、杀虫、免疫抑制和免疫刺激作用，应用广泛。
近年来，农业、兽医、食品工业等，随着耐药菌的不断涌现，对放线菌次级代谢调控的深入研究，放线菌抗生素生物合成的改进，以及耐药菌的发现和生产。
耐药菌的抗生素治疗越来越紧迫。
重组DNA技术或其他技术被用来刻意改变生物体现有的代谢和表达调控网络，破坏细胞性能、化学转化、能量转移和大分子。
本文介绍了基因表达的调控，基因簇拷贝数的增加，基因簇的异质表达，抗性和转运基因的过度表达，以及前体的改进。
1利用合成生物学元件开发放线菌产素潜力1.1基因簇扩增元件当营养物质耗尽或生长减慢时，放线菌会产生次级代谢产物。
这通常发生在细菌生长进入稳定期时。
初级代谢物通常是次级代谢的前体，如乙酰辅酶 A。
为了得到尽可能多的次生代谢物，如核苷，人们使用多种方法将初级代谢的中间产物冲入次级代谢。
目前，某些基因的过度表达或前体竞争途径的丧失是最直接有效的方法之一。
基因是合成抗生素的重要步骤。
虽然增加拷贝数和表达数不难，但操作几十或几百kb的基因簇却非常困难。
基因簇往往需要细菌人工染色体文库的建立和筛选。
微生物次级代谢产物生物合成基因簇技术分析
微生物次级代谢产物生物合成基因簇技术分析作者：宫克飞来源：《中国科技博览》2013年第28期[摘要]微生物产生众多结构和生物活性多样的次级代谢产物，其生物合成基因簇的克隆是药物创新和产量提高的必要前提。
[关键词]生物合成技术中图分类号:[Q528+.2] 文献标识码:A 文章编号:1009-914X(2013)28-0296-01微生物产生的次级代谢产物在化学结构和生物活性方面多种多样，主要的产生菌类群包括放线菌、芽孢杆菌、粘细菌、假单胞菌、蓝细菌、真菌等，其中已知抗生素的三分之二以上是以链霉菌为代表的放线菌产生的。
根据结构特点可以基本上将抗生素分为β内酰胺、氨基糖苷、核苷、四环素、多肽、糖肽、大环内酯、安莎、聚醚和类萜等种类。
以上多种多样抗生素的结构特点也决定了它们生物活性的多样性，除了可以抑菌杀菌外，还可以作为抗癌药、抗寄生虫药、除草剂、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、低血胆固醇治疗剂等等，在医疗、工业、农牧渔业和环境保护等领域均发挥着重要作用。
随着大量微生物次级代谢产物的分离，从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物变得越来越困难，已知结构化合物分离的重复性很高。
另一方面，临床上病原微生物的耐药性日益严重，伴随着多耐药性、高耐药性病原菌以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病不断出现，如何利用已有资源，定向创造新结构、新活性化合物以及提高微生物次级代谢产物的产量，成为当务之急。
分子生物学基础上的组合生物合成(combinatorial biosynthesis)和代谢工程(metabolic engineering)成为解决上述问题的重要手段，但是次级代谢产物生物合成基因(簇)的克隆与功能鉴定是这两项技术实施的必要前提。
一、微生物次级代谢产物生物合成基因簇的组成特点自从Malpartida等1984年克隆了放线紫红素的全部生物合成基因，以及随后克隆的榴菌素、红霉素、泰乐星等生物合成基因，揭示了微生物次级代谢产物生物合成基因成簇排列的特征，即与特定产物合成相关的结构基因、调节基因、耐药性基因和转运蛋白等集中位于染色体的一段连续区域。
红霉素生产工艺
红霉素生产工艺
红霉素是一种重要的广谱抗生素，具有广泛的应用领域，在医药行业中具有重要地位。
下面介绍一种常见的红霉素生产工艺。
红霉素生产的原料主要有发酵基质、齐夏姆素和种子菌。
首先，将红霉素的种子菌通过悬浮液接种到含有高糖量和氮源的发酵培养基中。
随后，在适宜的条件下进行培养和发酵。
一般采用液态发酵，可以提高生产效率和纯度。
在发酵过程中，需要控制温度、pH值、溶氧量和搅拌速度等
因素，以保证菌体的正常生长和代谢。
此外，还需添加适量的齐夏姆素作为抗生素产生启动物。
发酵培养基的配方也影响着红霉素的产量和质量。
常用的发酵基质包括葡萄糖、麦芽糊精、玉米浆等，可以提供菌体所需的碳源和能量。
随着发酵的进行，红霉素会渐渐积累在发酵液中。
当红霉素产生到一定浓度时，需要进行分离和提取。
一般采用脂质萃取法。
即将发酵液与有机溶剂相接触，通过摇床或搅拌等方式，使红霉素从水相转移到有机相中。
得到红霉素的有机相后，需要经过一系列的分离和纯化步骤。
首先，将有机溶剂蒸发，得到红霉素的粗品。
然后，通过结晶、过滤、洗涤和干燥等过程，得到纯净的红霉素颗粒。
最后经过筛分和包装，即可成为成品红霉素。
红霉素的生产工艺的优化，可以通过改变发酵条件、配方和提取过程等来提高产量和纯度。
同时，红霉素的质量控制也是非常重要的，需要进行严格的检验和分析。
红霉素生产工艺需要严格的操作和控制，以确保生产过程的安全和高效。
同时，红霉素是一种抗生素，其使用也需要遵循医学和药学的相关规范和指导。
红霉素
第五章大环内酯类抗生素第一节概述大环内酯类抗生素是以一个大环内酯为母体，通过羟基，以苷键和1~3个分子的糖相随着结的一类抗生物质。
大环内酯类抗生素能抑制许多革兰阳性菌和某些革兰阴性菌，不同类型的大环内酯类抗生素呈现的生物活性差异较大，一般说碱性大环内酯抗生素的抗菌活性较强，十六元大环内酯抗生素抗菌活性最强。
许多大环内酯类抗生素对耐青霉素的葡萄球菌和支原体有效，某些大环内酯类抗生素对螺旋体、立克次体和巨大病毒有效，个别品种还有抗原早作用。
它们之间易产生交叉耐药性，毒性低。
红霉素最早被应用于临床，竹桃霉素、螺旋霉素、吉他霉素（柱晶白霉素）、麦迪霉素、交涉霉素等也相继广泛应用于临床。
根据大环酯结构的不同，这类抗生素又分为三类：多氧大环内酯（polyoxo mactolide）；金烯大环内酯（polyene macrolide）；蒽沙大环内酯（ansamacrolide）。
1、多氧大环内酯抗生素按大环内酯环的碳元素数，又分为12元环、14元环和16元环三类。
它们都是多功能团的分子，大部分都联结有二甲胺基糖，因而显示碱性。
有的不含二甲胺基糖，只含中性糖，因而显中性。
作为医疗使用的多数是碱性大环内酯抗生素，重要的有14元环的红霉素（erythromycin）、竹桃霉素（oleandomycin），16元环的吉他霉素（kitasamycin）、交沙霉素（josamycin）、螺旋霉素（spiramycin）等。
近年来还发现麦迪霉素（midecamycin）、针棘霉素（espinomycin）和马立霉素（maridomycin）等抗生素。
至于12元环抗生素，目前都没有用于临床。
自1950年至今已经确定化学结构的约有100多种，在大环内酯抗生素中，与大环内酯相连接的氨基糖和糖的结构都是自然界不常见的结构（图5-1）。
各种大环内酯类抗生素的化学结构式，见图5-2、图5-3和表5-1。
此类抗生素的作用机理是与核糖蛋白体50S亚基的特殊部位结合，选择性抑制原核细胞蛋白质合成。
红霉素的生产工艺
红霉素的生产工艺红霉素（Erythromycin，简称EM）是一种广谱抗生素，可广泛用于临床治疗感染性疾病。
红霉素的生产工艺主要包括菌种培养、发酵、提取纯化等步骤。
下面将详细介绍红霉素的生产工艺。
首先是菌种培养。
红霉素的生产常用菌株为Streptomyces erythreus（简称SE），通过悬浮培养进行菌株的扩大。
菌种保存通常采用冻干保存或低温保存。
其次是发酵过程。
将所选的菌株接种到培养基中，利用合适的发酵罐进行发酵。
发酵过程通常需要控制温度、酸碱度、通气等条件。
培养基的配方一般包括碳源、氮源、矿物质等成分。
碳源可以选择葡萄糖、麦芽糖等；氮源可以选择酵母浸出物、大豆蛋白等；矿物质可以选择磷酸、硫酸、钠氯化物等。
在发酵过程中，还可以添加一些辅料，如发酵活性调节剂、表面活性剂、抗泡剂等，以提高发酵效果。
发酵过程一般分为两个阶段：生长阶段和产物积累阶段。
在生长阶段，菌株快速繁殖并合成一些前体物质；在产物积累阶段，菌株进入稳定生长期，产生红霉素。
然后是红霉素的提取和纯化。
经发酵后的培养液中含有大量的菌体、杂质和一部分红霉素。
首先，通过离心等方法将菌体和培养液分离，得到菌体酱，其中含有红霉素。
接下来，采用有机溶剂提取法，如乙醇、丙酮等，将红霉素从菌体酱中提取出来。
然后，再通过一系列的分离、洗涤、结晶等工艺步骤，对红霉素进行纯化。
其中的分离步骤通常包括覆盖层法、溶剂萃取、蒸发结晶等。
最后，经过提取和纯化后得到纯度较高的红霉素。
为了达到不同的药物形式要求，还可以对红霉素进行进一步的加工。
如通过微胶囊化、包衣等工艺对红霉素进行包装，以便于制剂制备和使用。
制得的红霉素最终可以应用于药物制剂的生产，如口服片剂、胶囊、注射剂等。
总结起来，红霉素的生产工艺主要包括菌种培养、发酵、提取纯化等步骤。
通过对菌株的培养和发酵，得到发酵液，再通过提取和纯化步骤得到纯度较高的红霉素。
红霉素的生产工艺对于药物的质量和产量都具有重要影响，需要严格控制各个环节的条件和操作。
药用天然产物的生物合成--崔小清
酶包括多个模块。每个模块上分别携带有参与聚酮生物合成所必需的
各种具有不同催化功能的结构域。
PKS
酰基转移酶（AT） 酰基载体蛋白(ACP) β-酮基硫酯合成酶（KS） β-酮基还原酶（KR） 脱水酶(DH) 烯醇还原酶（ER） 硫酯酶(TE)
三、红霉素
红霉素：用于治疗革兰氏阳性细菌感染的广谱大环内酯类抗生素。
1、酰基转移酶 AT
替换1-6 AT 模块 甲基丙二酸 单酰CoA
丙二 酰CoA
AT特异性识别底物
AT特异 性识别 底物
C-12、C-10、 C-8、C-6、 C-4、C-2。
与红霉素结构类似物（缺少甲基）
丙酰CoA
二酸单酰辅酶A
许多 I 型 PKS 聚酮化合物如泰乐菌素(tylosin)、苦霉素(pikromycin) 、多杀菌素(spino- syn)等的起始模块AT-ACP的前端还含有KSQ（酮基硫酯 合成酶）功能域. 使起始模块 AT 首先识别的是二酸单酰辅酶A, 结合到ACP 后不是直接转移到延伸模块的 KS 结构域中, 而是由KSQ 催化脱羧, 再转移 KS1 上进行下一步的合成。
活性上的重要作用，因此糖基的改变也成为 红霉素组合生物合成研究的一个热点。
L-碳霉糖
五、聚酮化合物组合生物合成面临的困难
•
PKS全酶基因簇的异源表达还有比较大的难度，这是由于PKS的
异源表达对宿主提出许多要求：遗传背景清楚、有成熟的遗传操作方
法、有成熟的培养方法、宿主的生长不受PKS蛋白表达的影响、有能
6-脱氧红 霉内酯
分别对红霉素PKS延伸模块6中KR功能域和模块 4 中ER 功能域 失活, 可以得到相应的 C-3 酮基类似物 27 和 C-6－C-7 不饱和类似物 28。
次级代谢01
Streptomyces coelicolor colonies, c. 1 cm x 1 cm. The wild-type colonies are covered with grey aerial mycelium and spores; the reddish mutant colonies are not forming aerial mycelium. The red mycelium colour and the dark background is from the antibiotics produced by Streptomyces coelicolor (John Innes Centre, Photography Department).
次级代谢方面的差错对细胞的生长无关紧要， 改变后的代谢产物有些还保留生物活性。
微生物次级代谢
有人认为，次级代谢产物之所以种类 繁多，就是因为酶的底物特异性不 高所致。
他们把次级代谢过程又称为多向代谢 作用(pleometabolism)。
微生物次级代谢的特征
• 次级代谢产物一般不在产生菌的生长期产生， 而在随后的生产期形成。
表4-4 可作为次级代谢物的前体的一些中间体
由芳香中间体合成的抗生素和其它次级代谢物
次级代谢调节
抗生素的生源学(Biogenesis)
生源学又称为生物发生学，是指一些天 然物质，包括有生命的物质为什么会发 生，存在的学问，它对宿主，环境有何 作用？抗生素生源学研究一些微生物为 什么会产生这类对其它微生物，甚至对 其自身有害的物质, 其功能是什么？在这 方面的了解将有助于解释抗生素的形成 机制和控制其生产。
• 种类繁多，含有不寻常的化学键，如氨基糖、 苯醌、香豆素、环氧化合物、麦角生物碱、 吲哚衍生物、吩嗪、吡咯、喹啉、萜烯、四 环类抗生素等。
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红霉素合成基因簇
红霉素合成基因簇是指在革兰氏阳性细菌Streptomyces中存在的一组基因，这组基因可以编码出红霉素的合成酶和调控因子，完成了从原料合成到终产物合成的全过程。
这个基因簇一般由20-30个基因组成，其中分别包括了代表性的启动子、转录因子、蛋白质结构基因、修饰基因、转运基因等。
这些基因在生物体内协同作用，完成了红霉素的合成过程。
红霉素合成过程中，首先是原料的合成。
若在基因簇中含有代表胺基酸、糖分合成的基因，那么在此阶段完成。
之后，需要通过类似于脂肪酸合成途径的方式来完成红霉素的合成。
这时，基因簇中的多个酶开始发挥作用，将原料和中间体转化为最终产物。
最后，红霉素可以通过转运蛋白等途径到达目的地。
红霉素合成基因簇的研究不仅对于红霉素的生产具有重要意义，也对于了解细菌代谢途径、酶的催化机理等有着重要的意义。
同时，也为制造新型抗生素提供了思路和方法。
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