2016现代组织化学技术-组织化学

(1) 保持组织和细胞的完整性 (2) 被检物质具有不溶性和（或）可视性 (3) 反应具有特异性 (4) 反应具有灵敏性
(5) 可重复性
二、标本的制备
1. 取材（draw material）
(1) 组织标本取材：
准备充分、麻醉或处死方法合适、操作迅速、刀应锐利、适当 清洗、离体即固定（或冷冻切片，或保存于-80℃冰箱）、大小 适中（约2.5cm×2.5cm×0.2cm，宁可面积大，不能厚）
冲洗液
固定液
动物
二、标本的制备 2. 固定
(5) 影响固定的因素：
① 组织块不宜过大： 组织块过大会影响固定剂的渗透 ② 固定液的量要合适：固定液的量要超过组织块大小的20倍-30倍，可 在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层滤纸，保证组织块各个方向都 有利于固定剂的渗入 ③ 选择合适的固定剂：根据不同的组织以及后续研究方法的特点选择 合适的固定剂，渗透性强，又不使组织过度收缩或者膨胀
微镜技术》中“超薄切片技术”，光镜水平的标本包埋常用
水性树脂-甲基丙烯酸-2-羟基乙基酯
① 包埋剂配制：分别配制浸透剂和催化剂
② 标本固定和脱水： 醛类固定剂常用，梯度酒精脱水，但
是脱水可不彻底
③ 包埋：先入浸透剂，后入浸透剂和催化剂混合液中进行聚
合包埋
二、标本的制备
4. 切片（section）
必须切成薄片才能染色 重点介绍石蜡切片、冰冻切片和振动切片
3. 包埋
(3) 石蜡包埋： ② 透明（clearing）：
脱水剂一般跟石蜡不互溶，用透明剂置换脱水剂，并使组织 呈现透明状态，便于浸蜡和包埋 常用透明剂为二甲苯、苯、甲苯、氯仿、正丁醇、香柏油等 二甲苯透明能力强，易使组织收缩变脆，因此时间不能太长。 可以经常观察透明进展。如果脱水不彻底，会出现“枣核”
优点：不用脱水透明高温包埋，处理时间大为缩短，抗原保存较好，可 用于未固定的标本切片 缺点：容易形成冰晶，切片较厚，10~40µ m，结构清晰度不如石蜡切片
防止冰晶形成的方法：
① 高渗蔗糖溶液处理：20%-30%蔗糖•PB溶液浸泡1~3天，组织块沉底 ② 速冻：放组织块入-80º C干冰或-196º C液氮中速冻，或者将组织块固
常用于较大组织和器官的包埋，如大小脑，以及容易塌陷的 器官，如眼球和胚胎器官等，对组织的收缩作用小，保持原 有结构的效果好，但火棉胶包埋所需时间长，包埋的组织块 不能做薄切片和连续切片
① 火棉胶溶液配制：
称取干燥的固态火棉胶，溶解于100ml的乙醚-无水乙醇（比例
是1:1）配制成2%、4%、8%、16%的火棉胶液备用。火棉胶
(2) 细胞标本取材：
① 涂片法：培养的悬浮细胞，人体液中的细胞等，细胞密度低
时可先沉淀或者离心； ② 爬片法：贴壁生长的培养细胞； ③ 印片法：活组织标本、尸检标本及子宫颈外口等脱落细胞
二、标本的制备
2. 固定（fixation）
(1) 固定的目的：
保持组织细胞原有的形态结构；使组织硬化；对组织化 学及细胞化学技术来说---保存酶活性和蛋白质的抗原性 非常重要
ห้องสมุดไป่ตู้ 二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
B. 凝固沉淀固定剂
丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使
组织细胞中的蛋白质、糖等物质凝固，优点是渗透力强，对抗原活性和酶活性保存
较好；缺点是固定快，易使组织细胞收缩，小分子物质不容易保存，膜结构会破坏，
因此对细胞结构保存不好。固定方法在4℃，30~60 min 为宜。
------ 介于细胞生物学、组织学、化学、生物化 学、免疫学及分子生物学之间的边缘科学 ------ 对组织与细胞的化学成分或者酶活性进行 定性、定位和定量的研究。常统称为“组织化 学” ------在保持组织或细胞基本不改变其生活状态时 的微细结构的条件下，利用某些特异性的反应， 采用显微镜技术观察某些化学成分或酶活性在组 织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律
③ 硬化：
继而放入干燥箱内放置24 h，开启盒盖，使乙醇和乙醚挥发，包埋块逐渐硬 化呈胶样，去掉包埋盒，包埋好的组织块放入70%乙醇或氯仿中24 h，最后 放入1:1的95%乙醇-甘油中保存备用
二、标本的制备
3. 包埋
(5) 树脂包埋：
以树脂作为包埋剂，包埋质地坚硬，易于制作很薄的切片。 电镜水平的标本包埋常用环氧树脂，其包埋方法见《电子显
不易溶解，将其置入棕色瓶子内，经常摇动
* 固体状态的火棉胶和配制成液体的火棉胶，均是易燃品，因此使
用过程中要避开明火
*火棉胶容易吸收水分而成乳白状，在贮存和使用过程中要注意防水
二、标本的制备
3. 包埋
(4) 火棉胶包埋： ② 包埋：
梯度酒精脱水，乙醚-无水乙醇浸泡24 h，（不需透明）在不同浓度的火棉 胶中分别浸泡24 h到1周，取出后放入含足量16%火棉胶的包埋盒中
(2) 固定的优、缺点：
优点：使组织细胞的形态结构得到保持
缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损
二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
A. 交联固定剂
甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨
基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白分子相互交联，保存抗原于原位。其特点是组织
(1) 石蜡切片：
优点：切片较薄，4~8µ m，组织结构保存好，抗原定位准确，连续切片 缺点：脱水透明及高温包埋，处理时间长，抗原活性容易受损，脂类物 质等易被溶解 过程：固定蜡块-调整切面-修块-调整切片厚度-切片-展片-贴片-烤片
二、标本的制备
4. 切片（section）
(2) 冰冻切片（恒冷箱切片机）：
形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧
甲基，使抗原决定簇的空间构象出现障碍，可能部分或完全遮盖抗原决定簇，在免 疫组织化学染色时产生假阴性结果。固定时缩短固定时间（824小时），降低固定 温度（4℃）、固定后充分水洗、在免疫组织化学染色之前通过抗原修复等可提高抗 原反应性。常用的有：10%福尔马林（即4%甲醛）、4%多聚甲醛（应用最为广泛）、 2.5%戊二醛等 戊二醛含两个醛基，对膜结构固定更好，但是形成更多的交联，对抗原活性有影响
现代组织化学技术
组织化学与细胞化学
学习要求
1．掌握组织化学技术的基本概念 2．熟悉组织化学和免疫组织化学标本的制备方 法及过程 3．掌握酶组织化学的基本原理
4．熟悉高碘酸Schiff（PAS）反应、过氧化物酶、
酸性磷酸酶铅法的基本原理
一、绪论
1. 什么是组织化学与细胞化学技术？
Histochemistry and cytochemistry
均匀，缺点是该固定液偏酸性，对抗原活性有影响
Carnoy固定液：冰乙酸、氯仿和无水乙醇组成，适于固定染 色体、DNA、RNA、糖原和尼氏体等，组织化学技术常用
Zamboni固定液：多聚甲醛、饱和苦味酸和Karasson-Schwilt
磷酸盐缓冲液组成，类似于Bouin固定液，对超微结构的保存 优于Bouin固定液
(2) 包埋剂的种类：
非水溶性：石蜡、树脂、火棉胶等，包埋前必须脱水和 透明 水溶性：明胶、OCT（聚乙二醇和聚乙烯醇的混合物） 等，包埋前不需要脱水和透明
二、标本的制备
3. 包埋
(3) 石蜡包埋：
石蜡与水不相溶，包埋前必须脱水和透明，然后用熔化的液 态石蜡对组织进行浸透，将浸透好的组织和石蜡放在室温条 件下让其凝固，方便切成极薄的切片
样的非透明区，必须返回到脱水剂中重新彻底脱水
二、标本的制备
3. 包埋
(3) 石蜡包埋： ③ 浸蜡（paraffin infiltration）：
使熔化的石蜡液浸入到已经透明的组织中，彻底置换掉透明 剂。浸蜡选择熔点为58~60º C的石蜡，制备免疫组织化学标本 应该选用更低熔点的石蜡，更换1~2次，每次0.5~1小时 * 浸蜡和包埋所用的石蜡必须经过熔化后用滤纸过滤除去杂质 * 将组织块从透明剂中移入到液态的石蜡中时，动作要迅速，
二、标本的制备
2. 固定
(4) 固定的方法
浸渍法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸
渍法和灌注法用的最多
浸润法：适用于临床取材的标本和小动物组织固定，做好
标记，直接将组织块修整为合适大小，投入到样品体积的40
倍左右的固定剂中，固定剂的种类和固定时间的长短根据情 况而定
二、标本的制备
2. 固定
一、绪论
3. 组织化学与细胞化学技术的主要类型
化学方法，类化学方法，物理学方法，显微烧灰方 法，免疫学方法，分子生物学方法等
常用分类： (1) 一般组织化学与细胞化学 (2) 免疫组织化学与细胞化学
(3) 原位杂交组织化学
* 每种均有光镜和电镜之分和定性与定量之分
一、绪论
4. 组织化学与细胞化学技术的基本要求
定在将温度已经下降到-50º C的冻头上速冻
* 速冻前组织块都经过高渗蔗糖浸泡过 过程：开机预冷-组织包埋（用OCT包埋组织于切片托上）-切片-贴片干燥-保存（如长期保存可存放于-20º C，如短期可室温放置，但防尘）
① 脱水（dehydration）：
用脱水剂置换组织中的水分，脱水会使组织收缩、变脆，因 此脱水剂的浓度由低到高，采用合适的脱水剂和脱水时间
（与组织块大小和结构性质相关），最常用的为乙醇，组织
比较致密可用正丁醇
* 柔软的组织可从更低的浓度
开始，脱水的容器密闭性要好， 防止吸收空气中的水分
二、标本的制备
否则液态的石蜡很容易凝固，影响到浸蜡的效果
二、标本的制备
3. 包埋
(3) 石蜡包埋： ④ 包埋（embedding）：