细胞活性检测方法

细胞凋亡的免疫学检测方法有哪几种（注意是免疫学的方法）
悬赏分：30 - 提问时间2008-11-13 23:22
形态学的方法（比如说电子显微镜和荧光显微镜）算不算免疫学的方法

提问者： 匿名其他回答 共 3 条
一、概述

细胞凋亡（apoptosis,Apo）是细胞增殖的反面，探讨的是细胞死亡的方式与机制。凋亡一词来源于希腊语。原指花瓣、叶片的脱落。自1972年Kerr首次提出细胞凋亡的概念以来，随着细胞生物学、免疫学和肿瘤学的研究发展，最近几年人们对细胞凋亡的重大理论意义和实际意义有了更深的理解。细胞凋亡是指在一定的生理和病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。不同类型的细胞，在发生凋亡时的动力学过程也不一致，存在着一定的形态学和生物化学的差异，但若干基本变化是大同小异的。其特征为：整个胞体呈浓缩状，有特异性胞浆大泡，胞质、核质深染，核碎裂后被细胞膜包裹而形成凋亡小体（apoptosis body）。它有别于细胞死亡（necrosis,Nec）。在琼脂糖凝胶电泳上显示出特殊的DNA梯状图谱。它的出现主要是由于一种钙-镁依赖性核酸内切酶激活后，裂解染色质核小体（nucleosome）之间的连接DNA，将核小体切割成180bp～200bp或其倍数的片段所致。Apo是不可逆的过程，散在分布于组织中，形成的凋亡小体，除核裂解外，外有膜包绕，内有完整的细胞器，凋亡小体在组织中很快被邻近组织细胞吞噬，并在溶酶体中被降解。因此，Apo不引起周围组织炎症及损伤。Apo是机体自己启动，由细胞本身主动控制，由基因指导的细胞自我消亡过程。因此，又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）。
光镜下，Apo的典型形态学特征是核染色质广泛凝聚，细胞体积缩小，胞质浓缩，有凋亡小体存在，细胞表面特化结构如微绒毛等丢失及细胞表面明显的迂曲。体内细胞凋亡过程发展非常迅速，细胞常在数小时内完成Apo并降解，凋亡细胞仅出现数分钟就消失，故不适宜应用形态学方法（普通光学显微镜检测法、荧光显微镜检测法、凋亡小体的电镜观察及凋亡指数和细胞活力的定量测定）来检测。在生物化学方面，利用电泳技术证明核体断片的“DNA梯状图谱”作为检测群体细胞发生凋亡的一个指标。经过人们多年的研究发现，应用原位末端转移酶标记技术（TDT assay or TUNEL reaction）来检测细胞凋亡，其灵敏度高，特异性强，能早期显示未发生典型变化的凋亡细胞。它是检测单个细胞早期出现凋亡现象的好方法。近几年，人们又发现了能更快、更敏感、检测细胞数量更多的并能从更多方面证明凋亡和坏死的流

式细胞分析术（flow cytometry，FCM 包括亚“G1”峰检测法和末端转移酶标记技术）等。本章仅介绍免疫学检测方法。

二、ELISA法

（一） 原理
细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA,产生180bp～200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。
（二）材料与试剂
1．采用Boehringer Mannheim公司试剂盒，生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗
体。
2．过氧化物酶（-POD）标记的小鼠抗DNA单克隆抗体
3．链霉亲合素包被的微孔板
4．DNA－组蛋白复合物，作为阴性对照。
5．ABTS底物
6．溶解缓冲液
7．温育缓冲液
8．底物缓冲液
（三）样品
1．培养细胞或离体细胞的裂解物 细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200μl溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min。
2．培养细胞的上清液
3．血浆（血清）

（四）操作方法

1．取样品离心后（1 000r/min,10min）,吸取20μl上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中。
2．另加入80μl免疫反应试剂 含抗－DNA－POD、抗组蛋白－生物素及温育缓冲液（按1∶1∶18混合），室温下孵育2h（置摇床上，250r/min）。
3．取上清，用300μl温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液。
4．加入100μl底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合（置摇床上）。
5．尽快作比色分析（10min～20min内），用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长492nm进行检测。

（五）结果判定

按下列公式计算细胞释放的单/低聚核小体片段的特别聚集值：

注：mU=吸收值（10-3）=双孔吸收值的平均OD值－底物OD值，若样品的吸
收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。

三、原位末端转移酶标记技术

（一）原理
凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将DNA切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点（缺口），暴露出大量3-羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记的dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标记法。
（二）荧光标记法
1．材料与试剂 采用德国Boehringer-Mannheim公司In Situ Cell Death Detection 试剂盒，或美国Oncor公司ApopTagTM试剂盒，包括：
⑴生物素标记的-Dutp(Biotin-dUTP)或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP)1nmol/μl
⑵ TdT酶（25U/μl）
⑶ 反应缓冲液
⑷ 洗涤缓冲液
⑸ 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲合素或链霉

亲合素（2.5μg/ml）或抗地高辛抗体（1∶30）
⑹ PI染液（含PI 5μg/ml及无DNA酶活性的RNA酶0.1%）
⑺ PBS缓冲液
⑻ 塑料盖玻片
2.样品
⑴ 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片
⑵ 贴壁生长的培养细胞
⑶ 冰冻切片
⑷ 常规石蜡切片
3.操作方法
（1）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。
（2）洗涤：玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min,三次。
（3）反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μl/㎝2滴加反应液（每50μl反应液含TdT酶0.5μl,标记的-dUTP 1μl）,使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上,盖上塑料盖玻片,置湿盒中,37℃孵育1h。

（4）终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5min。
（5）FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μl/㎝2滴加FITC反应液（含FITC 2.5μg/ml），室温下避光孵育10min。
（6）洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。
（7）PI复染：将玻片置于盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30min。
（8）封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。
4.结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光（波长488nm），所有的细
胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。
(三)酶标记法
1.材料与试剂 采用美国Oncor公司ApopTagTM-Peroxidase试剂盒，包括：
⑴ 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体
⑵ 反应缓冲液
⑶ TdT酶
⑷ 反应终止/洗涤液
⑸ 平衡缓冲液
⑹ 蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS。
⑺ 30% H2O2
⑻ DAB显色液：0.05%的diaminobenzidine(DAB)溶于PBS，用前过滤并加入
0.02% H2O2。
⑼ 甲基绿染液：0.5%甲基绿溶于0.1Mol/L枸橼酸钠，pH调整到4.0。
⑽ 塑料盖玻片及玻璃盖玻片
2．样品 同荧光标记法。
3．操作方法
⑴ 固定：同荧光标记法。
⑵ 内源性过氧化物封闭 玻片置于盛有0.5% H2O2缓冲溶液的染色缸内，室温下作用20min后，同荧光标记法洗涤。
⑶ 消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸，室温下消化15min，洗涤
同上。
⑷ 平衡处理：将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干，滴加平衡缓冲液（按70μl／cm2）覆盖细胞或组织表面，盖上塑料盖玻片，室温下作用5min～10min。
⑸ 反应：移去盖玻片，倾去平衡液，用吸水纸吸干周围液体，滴加反应液（按50μl/㎝2，18μl TdT酶+36μl反应缓冲液），均匀

覆盖在细胞或组织上，盖上塑料盖玻片，置于湿盒中，37℃温育1h。
⑹ 终止反应：移去盖玻片，将玻片置于盛有终止/洗涤液的染色缸内，37℃下洗涤30min（置摇床上振摇）。然后将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。
⑺ 地高辛抗体反应：用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加70μl过氧化物酶标记的地高辛抗体，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下置于湿盒中，孵育30min。
⑻ 洗涤：置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。
⑼ 用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加新鲜配制的DAB显色液，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下作用3min～6min。
⑽ 洗涤：置于蒸馏水中洗涤3次，每次3min～6min。
⑾ 套染：将玻片置于盛有甲基绿染液的染色缸中，室温染色10min。
⑿ 洗涤：蒸馏水洗涤3次（置于摇床上），每次2min。
⒀ 脱水、封片：100%正丁醇，3次，每次2min。二甲苯，3次，每次2min。
明胶甘油封片。
4．结果判定 光学显微镜下观察，所有的细胞核均着绿色，凋亡的细胞核染
色质显示出特异性的棕黄色。



Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒

产品说明：
凋亡是一种程序性的细胞死亡，与细胞的坏死有生化和形态等方面的不同。磷酯酰 丝氨酸(phosphatidylserine, PS)是细胞膜的一种组成成分，在正常细胞主要分布在细胞膜内侧；细胞发生凋亡的早期，PS会外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。Annexin V 对PS有高度的亲和力，可以选择性结合和标记PS 。本试剂盒采用重组人Annexin V-EGFP融合蛋白，来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的PS，标识出凋亡细胞。由于坏死细胞和凋亡晚期细胞，其膜内侧的PS也可以被Annexin V结合，通常用另一种活细胞非透过性荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)进行双重染色，以区别凋亡早期细胞与坏死细胞和凋亡晚期的细胞。用Annexin V-EGFP和PI染色后，正常的活细胞不被Annexin V-EGFP和PI着色；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-EGFP着色，PI 染色呈阴性；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-EGFP和PI着色。用流式细胞仪或荧光显微镜直接观察PS外翻这一细胞凋亡的重要特征，是一种快速简便的细胞凋亡经典检方法。


操作方法：

染色液的配制：

1) 取适量4x Annexin V结合液，用双蒸水稀释至1xAnnexin V结合液。后续工作均使用1x Annexin V结合液。
2) 将20 μl Annexin V-EGFP加入1 ml Annexin V结合缓冲液中，即配成10次测试的 Annexin V染色液。
3) 将5 μl PI加入5 ml Annexin V结合缓冲液中，即配成10次测试的PI染色液。

荧光显微照相操作方法：

1) 培养细胞用所需方法处理以

诱导凋亡。应同时设置阴性对照。
2) 对贴壁生长细胞，离心收取培养液内的悬浮细胞，并用胰酶消化贴壁细胞，合并两部分细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用冰冷PBS洗涤细胞后， 1000g离心5 min，弃上清，加入100 μl Annexin V染色液轻轻重悬细胞。室温(20-25℃)放置，孵育10~15 min。再加入PI染色液0.5 ml混匀。室温孵育5 min
3) 完成孵育后，1000g离心5 min，弃上清，轻轻重悬细胞于50~100μl Annexin V结合缓冲液中；取25-50μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
4) 荧光显微镜下，用蓝光激发，观察和拍摄细胞红色发射图像。结合Annexin V-EGFP 的凋亡细胞的质膜将显示绿色光圈；膜结构不完整的坏死细胞和晚期凋亡细胞在整个核区被PI染成红色而质膜为Annexin V-EGFP阳性呈现为绿色光圈。
5) 培养于48孔板或96孔板内的贴壁细胞，也可进行原位染色。在凋亡诱导结束后，用冰冷PBS轻轻洗涤细胞，完全去除PBS，加入100 μl Annexin V染色液，室温孵育 10~15 min；吸除染色液，加入PI染色液0.5 ml混匀。室温孵育5 min。立即在倒置荧光显微镜下观察。

流式细胞分析操作方法：
1) 培养细胞用所需方法处理以诱导凋亡。应同时设置阴性对照。
2) 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用冰冷PBS洗涤细胞后，取5~10万重悬的细胞，1000g离心5 min，弃上清，加入100 μl Annexin V染色液轻轻重悬细胞。室温(20-25℃)放置，孵育10~15 min。
3) 再加入PI染色液0.5 ml混匀。室温孵育5 min。
4) 完成孵育后，立即进行流式细胞分析。采用488 nm双波长激发，测定~510 nm和>575 nm的发射，细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色。

注意事项：
1) 该试剂盒只能检测活细胞，而不能用于切片、擦刮、固定或浸润细胞样品的检 测。如需对活细胞固定进行其它检测，可在本试剂盒标记完成后，用Annexin V结合缓冲液清洗细胞，再固定进行后续操作。
2) 细胞凋亡是一种持续变化的动态过程，选择合适的诱导时间对观察凋亡比较重要。
3) Annexin V和PI染色的活细胞应尽快检测。
4) 微生物污染的细胞样品或试剂可导致错误的观察结果。


方法很多，下面简单介绍几种
1.形态观察，用DAPI染色，具体自己看书
2.TUNNEL法。因为凋亡细胞DNA会被切断，所以会出现3’末端，这种方法就是标记3’末端。具体自己翻阅资料
3.彗星电泳法，用单个细胞破

碎然后电泳，其DNA条带呈彗星状。
4.DNA电泳梯度条带法就不用说了吧，这个最经典
5.流式细胞仪法。因为能够检测DNA含量。
具体想了解的话还是自己去看书吧。



一、细胞凋亡的形态学检测

细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。

根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜
（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割
成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
3 透射电子显微镜观察
结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。