实验室增菌方法
实验室平菇栽培法实验报告
实验报告实验名称实验室平菇栽培法班组姓名学号日期成绩教师签名一、实验目的1.掌握平菇基本栽培方法及其原理。
2.掌握平菇栽培中器械和培养基的灭菌方法及原理，如高压蒸汽灭菌法、干热灭菌、灼烧灭菌和紫外灯灭菌法等。
3.了解食用菌母种扩大繁殖生产的基本原理,掌握斜面母种的接种和培养方法。
4.掌握平菇栽培中原种、栽培种培养基的制备方法。
5.培养学生自行设计出菇的方案。
二、基本原理1.平菇是木质腐生菌，生长发育所需各种营养物质均从木屑、棉籽壳、稻草等培养料中获得。
平菇生长周期短，从播种到第一批采收一般为30天到40天，栽培方法简便，成功率高。
本实验在实验室条件下，用袋装方法出菇。
2.食用菌生产中，培养基、器皿及接种工具的消毒灭菌，是防止杂菌污染，提高食用菌产量的关键措施，灭菌和消毒法主要有物理方法（高温灭菌和紫外线灭菌）、化学灭菌法。
干热灭菌是在保持恒温的电烘箱中进行的,适用于各种耐热的玻璃器皿、棉塞、滤纸、以及不能与蒸汽充分接触的液体的灭菌.一般在160摄氏度持续1.5—2小时,就可达到灭菌的目的.灼烧灭菌可直接在酒精灯外火焰灼烧灭菌,酒精灯所用的酒精浓度要在百分之95以上.紫外灯灭菌是接种室(箱)最常用的方法之一,每次在使用前开灯20—30分钟.紫外线可导致细胞内核酸和酶发生变化而使细胞死亡,还可使空气中氧气产生臭氧,臭氧也具有杀菌作用.因其透射力差只适用于空气及物体表面的灭菌,有效距离为1.5—2米,以1.2米内为最好.3.食用菌母种培养基和分离菌种时用斜面培养基，适用于一般食用菌的母种分离与培养用的培养基是马铃薯葡萄糖琼脂培养基（即PDA培养基），配成后用加压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。
4.食用菌菌种生产一般按母种——原种——栽培种进行。
母种数量少，要进行试管移接扩大培养才能进行生产。
5.原种由母种繁殖而成，由原种扩大培养成栽培种。
原种和栽培种生产一般包括配料——装瓶（袋）——灭菌——接种——培养等流程。
ISO标准(参考译文)单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法
5.1常规原则
对于目前实验室操作，见ISO7218
注意2：因为培养基和试剂的数量较多，其经过了更可取的考虑。出于文章简洁的目的，在附录B中给出其组分和制备。
5.2 初级选择性富集培养基含降低浓度选择性试剂的Fraser培养液（半Fraser培养液）
见条款B.1
5.3含全浓度选择性试剂的选择性次级富集培养液（Fraser培养液）
见条款B.2
5.4选择性固体接种培养基
5.4.1第一个培养基：Oxford琼脂
见条款B.3
5.4.2第二个培养基：PALCAM琼脂
见条款B.4
5.5固体培养基：胰蛋白胨大豆酵母提取物琼脂（TSYEA）
见条款B.5
5.6液体培养基：胰蛋白胨大豆酵母提取物增菌液（TSYEB）
见条款B.6
5.7绵羊血琼脂
4.1应用含降低浓度选择性试剂的选择性富集培养液（半Fraser培养液）进行初级富集
对选择性初级富集培养液（包含1体积氯化锂和半体积吖啶黄以及萘啶酸—半Fraser培养液，也用作检验过程的稀释液）恒温培养，30℃24h；
4.2应用含全浓度选择性试剂的选择性富集培养液（Fraser培养液）进行次级富集
3.2单核增生李斯特氏菌的检验依据本部分ISO11290实施检验，在给定产品的质量和体积的条件下，检验这些微生物的存在或不存在。
4.原理
在本部分ISO11290范围内，单核增生李斯特氏菌检验需要四个连续的阶段（见附录A检验流程图）
注意1：李斯特氏菌可能存在量少并与大量的其它种类细菌混杂，因此需要选择性富集。同时也必须检测受破坏的李斯特氏菌，初级选择性富集培养基，含有降低的抑制剂浓度，可以至少部分达到此目的。
8. 检样制备
无菌体液细菌培养的新方法探讨
无菌体液细菌培养的新方法探讨【摘要】目的：探讨无菌体液培养的最佳方法。
方法：对278份无菌体液标本用双相液体培养基法和直接接种法培养分离细菌。
结果：双相液体培养基检测278份标本，40份培养出细菌，阳性率为％，直接接种法培养19份标本培养出细菌，阳性率为％，经SPSS 软件处理，χ2检验，,差异有非常显着性。
结论：用双相液体培养基法培养无菌体液标本，可明显提高细菌检出率，是较好的方法。
【关键词】无菌体液；细菌培养；双相液体培养基无菌体液(胸腹水、关节液、胆汁、脓液等)标本细菌培养是诊断各种细菌感染的一种重要方法。
直接接种法(传统方法)细菌培养阳性率低,往往易造成误诊,为改变上述现状,作者经过两年的研究,终于发现一种新的细菌培养方法，即能做到床边接种又能增菌分离，现报告如下。
1 材料和方法材料标本来源278份标本为我院住院患者标本，其中胸腔积液52份，腹水51份，脑脊液49份，腹透液53份，胆汁37份，脓液36份。
培养基双相液体培养基(上海奥普生物医药有限公司提供)。
方法标本采集双相液体培养基接种法临床医生床边采样(立即接种)，无菌操作采集无菌体液标本≥3 ml,注入双相液体培养瓶内, 充分混匀,并覆盖整个固相培养基,立即送实验室，置35℃孵育箱培养。
直接接种法用接种环直接接种血平板、巧克力平板和麦康凯平板，置35℃孵育箱培养。
结果判断次日将培养瓶取出,观察液体是否混浊,固相是否有菌落和菌苔生长,若无菌生长或混浊,继续培养。
如有菌生长,立即涂片染色镜检、鉴定和药敏实验，48 h无菌生长,报告未见细菌生长。
鉴定涂片、染色分属后，采用珠海黑马生物鉴定板进行鉴定、药敏［1，2］。
2 结果两种方法检测分离出的细菌标本数用双相液体培养基检测278份标本，40份培养出细菌，阳性率为％。
胸腔积液标本阳性8份，阳性率%,腹水标本阳性8份，阳性率%,脑脊液标本阳性5份，阳性率%,腹透液标本阳性8份，阳性率%，胆汁标本阳性6份，阳性率%,脓液标本阳性5份，阳性率%；而用直接法培养，仅有19份标本培养出细菌，阳性率为％。
金黄色葡萄球菌的测定方法验证报告
方法验证报告公共场所卫生检验方法第4部分：公共用品用具微生物GB/T18204.4-2013(5)胰酪胨（或胰蛋白胨17g 植物蛋白胨（或大豆蛋白胨） 3g 氯化钠 100g 磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖 2.5g蒸馏水1000m L制法：将上述成分混合后，加热溶解，调pH 为7.2~7.3，分装，121C 、20min高压灭菌。
2.1.2氯化钠肉汤(75g/L)成分： 蛋白胨 10g 牛肉膏 10g 氯化钠 75g 蒸馏水1000mL制法：将上述成分加热溶解，调pH 为7.4,分装，121°C 、20min 高压灭菌。
2.1.3BairdParker 平板成胰蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 酵母浸膏1g 丙酮酸钠 10g甘氨酸 12g1. 目的验证平皿鉴定法测定公共用品用具微生物中的金黄色葡萄球菌，来判断在本实验室此方法的适用性。
2.培养基和试剂2.1培养基和试剂2.1.1胰酪胨大豆肉汤成分：氯化锂（LiCl.6H2O）琼脂5g 20g蒸馏水950mL增菌剂的配制：卵黄盐水（30%,体积分数）50mL与除菌过滤的亚碲酸钾溶液（质量浓度=1%）10mL混合，保存于冰箱内。
制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25°C校正pH至7.0±0.2。
分每瓶95mL,121C高压灭菌15min,临用时加热熔化琼脂，每95mL加入预热至50C的卵黄亚碲酸钾增菌5mL,摇匀后倾注平板。
培养基应是致密不透明的。
使用前在冰箱储存，不得超过48h。
2.1.4血琼脂培养基成分：营养琼脂100mL脱纤维羊血（或兔血）10mL制法：将营养琼脂加热溶化,待冷至50C左右以无菌方法加人脱纤维羊血摇匀，制成平板，置冰箱内备用。
2.1.5革兰氏染色液2.1.5.1结晶紫染色液成分：结晶紫1g乙醇（95%,体积分数）20mL草酸铵水溶液（质量浓度=1%）80mL制法：将结晶紫溶于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合2.1.5.2革兰氏碘液成分：碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL制法：将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。
神奇的微生态制剂饲料添加剂——丁酸梭菌,规模化发酵生产工艺的优化
摘要 / Abstract[目的]研究丁酸梭菌的营养条件并优化发酵工艺，为与丁酸梭菌培养发酵相关的实验室研究及规模化生产工艺优化提供依据。
[方法]通过单因素试验，比较8 种常见廉价碳氮源对丁酸梭菌增菌的影响，对高密度发酵培养基和培养条件进行优化。
[结果]丁酸梭菌MY-Z 发酵最佳营养组分为：葡萄糖30.0g/L、酵母粉5.0g/L、鱼粉30.0g/L 或肽粉30.0g/L、K2HPO4 1.05g/L、MgSO4·7H2O 1.21g/L、NaCl 0.3g/L、CaCO3 1.5g/L、MnSO4·H2O 0.012 g/L、促生长因子 0.2 g/L；最佳发酵工艺为：37 ℃恒温培养30～36 h，发酵过程中恒定pH 为6.5，并在发酵10 h 左右进行总量为5%的连续变量补料。
丁酸梭菌MY-Z 在此发酵工艺下，发酵32 h 左右，芽孢数可达2.28×109CFU/mL。
[结论]通过优化发酵工艺可有效提高发酵液菌数，从而降低生产成本，对丁酸梭菌的产业化推广与应用具有重要意义。
研究背景丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridium butyricum），又名丁酸菌、宫入菌、酪酸菌，在自然界中多分布在肠道、酒窖、奶酪中。
1933 年，由日本千叶医科大学宫入近治博士首次发现。
丁酸梭菌属于严格厌氧的革兰氏阳性内生芽孢杆菌，细胞直径（0.6～1.2）μm×（3.0～7.0）μm；在梭菌增菌培养基（RCM）平板上和高层琼脂柱内菌落呈奶白色，边缘不整齐；显微视野中菌体呈杆状或梭状，多数单个，少数呈短链，部分菌株在对数生长初期菌体会呈现长丝状。
近几年来，丁酸梭菌作为微生态制剂被广泛应用于食品、医药、饲料与养殖等领域。
2009 年7月，原农业部批准了丁酸梭菌为新饲料添加剂。
丁酸梭菌作为微生态制剂饲料添加剂，具有较强的抗生素耐受性，对氨苄西林、强力霉素、甲硝唑等抗生素均不敏感，相对于乳酸菌、枯草芽孢杆菌等常规菌剂，与抗生素联用时受限度较小。
真菌培养及鉴定方法有哪些
真菌培养及鉴定方法有哪些真菌培养及鉴定方法有哪些真菌的营养要求不向。
在一般细菌培养基上均能生长。
真菌培养及鉴定有哪些的呢?本文是店铺整理真菌培养及鉴定的资料，仅供参考。
真菌培养及鉴定1.采集标本体表真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。
深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴-道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本应注意无菌操作。
2.培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。
标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(Sabouraud agar)上，置室温或37℃培养1～3周。
必要时可行小培养协助鉴定。
菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断。
对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。
真菌培养的方法与直接镜检法相比较而言，更能对大部分真菌感染的灰指甲作出准确的鉴定，也是诊断灰指甲的一个很重要的手段。
下面我们就从培养基的选择、培养时间、菌种鉴定三方面来了解一下灰指甲的真菌培养法。
1.培养基的选择通常培养真菌会同时选用两种培养基，如果单用一种培养基，则容易忽略其它种类的真菌诊断。
常见的两种培养基，一种为沙氏葡萄糖琼脂培养基中加抗菌剂，常为氯霉素和放线菌酮;另一种是沙氏葡萄糖琼脂培养基中仅加氯霉素，不加放线菌酮。
2.培养时间各种真菌的生长速度不同，所以报告的时间也不同。
一般皮肤癣菌生长较缓慢，在26℃-28℃的环境下需要培养2-4周才能发报告，但是，皮肤癣菌含盖的菌种较多也需要区别对待;酵母菌生长较快，通常2-3就可以发报告，如果为阴性则需要观察1周;霉菌生长也比较快，一般2-4天就可以发报告。
3.菌种鉴定(1)丝状真菌：包括皮肤癣菌和霉菌，根据菌落形成所需要的时间，在不同条件下生长的情况，菌落表面及背面的形态、色素，培养基中有无色素，培养物用乳酚棉蓝染色后镜检找特征性标志结构。
(2)酵母菌：分为形态学鉴定及生化试验。
变形杆菌检测方法
三糖铁结果：K/A 产H2S 尿素分解阳性
5、生化试验
• 经初步鉴定符合变形杆菌特征菌株， 按表3-8-1、3-8-2、3-8-3、3-8-4中项目进 行生化鉴定试验，并判定种属或种群。
• 也可用API20E和全自动微生物分析系统进 行生化鉴定。
奇异变形杆菌 API20E 结果
API 20E报告单 奇异变形杆菌
二、生物学特性
（一）形态 1.菌体形态 • 变形杆菌为革兰阴性小杆菌，两端钝圆。 大小0.4～0.6μm×1～3μm，有明显多形性。 无荚膜。 • 有周身鞭毛，运动活泼。有菌毛，可粘附 至植物和真菌细胞表面，但不能与动物或 人类细胞粘附。
奇异变形杆菌悬浮标本的细胞形态，金属镀膜 ×24000 小杆菌，两端钝圆
奇异变形杆菌api20e结果api20e报告单奇异变形杆菌6变形杆菌菌数的测定在变形杆菌食物中毒诊断检验时需要对可疑食物进行变形杆菌活菌计数常采用近似计数将检样在研钵中研磨制成悬液后用生理盐水对原样品进行102103104105等稀释度的稀释分别移取各稀释度的悬液01ml接种于琼脂斜面底部的凝结水内但勿接触培养基斜面表面
EMB培养基上为无色透明菌落
SS培养基上形成单个菌落，菌落中心呈黑色， 有粘性，打开平皿时有臭味
血平板上形成无色透明菌落 迁徙现象明显，不溶血
4、初步鉴定
将三糖铁培养基上乳糖反应阴性、硫化 氢阳性或阴性的菌株接种尿素和苯丙氨酸 鉴定培养基，37℃培养24h，变形杆菌二者 均为阳性。 变形杆菌易与沙门氏菌混淆，但变形杆 菌能够水解尿素。
7、血清学实验
在食物中毒诊断和判定中，需要对来自可 疑食物与患者的菌株进行血清型别鉴定，以判 定其同源性，如果没有分型因子血清，可做患 者血清效价和交互吸收试验。如果这两个实验 不能做，至少应该将待试菌株分别点种在普通 营养琼脂平板的两端，待两侧的菌株蔓延生长 到平板中间，菌苔完全融合，说明两株细菌没 有拮抗现象。
2.1微生物的实验室培养
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个 椭圆形的休眠体，叫做芽孢。 特点：对恶劣的环境，如干旱、高温等，有很强 的抵抗力。 在生物体的一定部位产 生一种特殊的生殖细胞叫孢 子。孢子的特点是能直接长 成新个体。
无菌技术： 分类 定义 方法
灭菌法
物理法：热力、辐射、微波、 杀灭一切微生物 等离子体 化学法：醛类、烷化剂
无机盐功能 构成微生物细胞的组成成分 调解微生物细胞的渗透压， PH值和氧化还原电 位 有些无机盐如S、Fe还可做为自养微生物的能源 构成酶活性基的组成成分，维持酶活性。Mg、 Ca、K是多种酶的激活剂
（4）特殊营养：
微生物生长不可缺少的微量有机物质，维生素、碱基等 （生长因子）。（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）
病毒: 微生物
一般指肉眼看 不见的生物
无细胞结构 原核细胞
原核生物: 细菌、蓝藻 原生生物：单细胞的动植物
如草履虫、单细胞藻类等
真菌: 如酵母菌
真核细胞
一、培养基
微生物生存的环境和营养物质 在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要 1、培养基的种类 的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。 液体培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种 例如，在培养基中加入青霉素，以抑制细菌、 指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种 半固体培养基 据物理性质分 放线菌的生长，从而分离到酵母菌和霉菌。又 类的微生物。例如，在培养基中加入伊红和美 如，在培养基中加入高浓度的食盐可以抑制多 固体培养基 常用于工业生产 蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在 种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生 大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产 长。 常用于观察微生物的 天然培养基 物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并 运动、鉴定菌种 据化学成分分 用于微生物的分离、计数 带有金属光泽。 合成培养基 常用于工业生产 选择培养基 据用途分 鉴别培养基常用于分类、鉴定
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微生物学实验室保存和增菌培养基
培养基, 海博生物
一、菌种保存培养基[配法] 蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠3g，磷酸氢二钠2g，琼脂粉4.5g，蒸馏水1L 。
将上述的成分混合于水中，加热溶解，调pH至7.4~7.6，分装试管2/3左右高度，121℃高压灭菌15min，成为半固体培养基，备用。
[质量控制] 培养基呈淡黄色半固体状。
大肠埃希菌(ATCC 25922)生长良好,动力阳性；福氏志贺菌(ATCC 12022)生长良好,动力阴性；金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)生长良好,动力阴性。
二、增菌培养基1.葡萄糖肉汤[用途] 用于血液增菌。
[配法] 蛋白胨(或月示胨)10g，氯化钠5g，肉浸液（或心浸液）1L，葡萄糖3g，枸橼酸钠3g，5g/L对氨基苯甲酸水溶液10ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml，青霉素酶1000 U。
将蛋白胨、氯化钠混合于肉浸液中加热溶解，再加入葡萄糖、枸橼酸钠、对氨苯甲酸及硫酸镁，继续煮沸5min，并补足失水，调整pH至7.8。
过滤分装，每瓶50ml，高压灭菌115℃20min后，每瓶加入青霉素酶50 U，经无菌试验合格后，冷却备用。
[用法] 将采取的血液标本，以无菌手续注入培养瓶中（血液1ml，培养液10ml），置35℃培养箱内，每天1次取出观察结果。
如有细菌生长，可出现数种不同的表现，应随时作分离培养，可选用血琼脂、伊红美蓝琼脂及巧克力琼脂平板等。
无细菌生长表现的培养瓶，需连续观察7d，仍无细菌生长方可弃去。
在观察的过程中，至少应作两次分离培养。
注: ⑴枸橼酸钠为抗凝剂，可使血液加入培养基中不凝固。
⑵对氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺类药物的抑菌作用。
⑶硫酸镁主要抑制血液中存在的四环素、金霉素、新霉素、多粘菌素及链霉素的抑菌作用。
⑷本培养基近年来有许多改良配方，如加入0.3%～0.5%酵母浸膏以增加营养；加0.2%核酸刺激细菌生长；加0.1%粘液素能被覆于细菌的表面，保护细菌免受抗体破坏；加入聚茴香脑磺酸钠（SPS）能中和补体的抗药作用从而提高检出率。
2.血液增菌培养基[用途] 血液和骨髓液病原菌的增菌培养。
[配法] 蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，酵母膏粉3g，枸橼酸钠3g，磷酸氢二钾2g，5g/L对氨基苯甲酸溶液5ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml，4g/L酚红溶液6ml，青霉素酶50 U，聚茴香脑磺酸钠(SPS) 0.3g，蒸馏水1L。
将上述成分（除酚红指
示剂、青霉素酶外）混合加热溶解，校正pH至7.4，再加酚红，过滤分装每瓶30～50ml，经121℃灭菌15min和35℃24h无菌试验备用。
临用时每瓶加入1.5～2.5 U 青霉素酶。
[质量控制] 伤寒沙门菌ATCC 50096、白色念珠菌ATCC 10231、化脓性链球菌ATCC 19615、肺炎链球菌ATCC 6305、金黄色葡萄菌ATCC 25923、铜绿假单胞菌ATCC 27853均生长良好。
3.亚硒酸盐增菌培养基[用途] 沙门菌增菌培养。
[配法] 蛋白胨5g，乳糖4g，磷酸氢二钠4.5g，磷酸二氢钠5.5g，亚硒酸氢钠4g，蒸馏水1L。
先将亚硒酸盐加到200ml蒸馏水中，充分摇匀溶解。
其它成分称量混合，加入蒸馏水800ml，加热溶解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正pH 7.0~7.1(通过调整磷酸盐缓冲对的比例来校正pH值)。
最后分装于15×150mm 的试管内，每管10ml。
置水浴隔水煮沸10~15min，立即冷却，置4℃冰箱保存备用。
[用法] 取新鲜标本1g或棉拭子采样直接种于该培养管内。
摇动后置35℃培养过夜。
如发现均匀混浊，管底有红色沉淀物，表示细菌生长。
然后取培养物分离在选择性培养基上，如SS琼脂、麦康凯琼脂平板等，进行培养。
[质量控制] 培养基应呈淡黄色或无色，透明无沉淀物。
增菌灵敏度：伤寒沙门菌1×10-5，鼠伤寒及副伤寒沙门菌1×10-7。
[保存] 4℃保存，1周内用完。
注：⑴亚硒酸盐，包括亚硒酸钠、亚硒酸氢钠均可使用，但以亚硒酸氢钠效果为好。
⑵磷酸盐缓冲对中，两者的用量比例与亚硒酸盐及蛋白胨的品种有关。
制备前应进行调试，其总量为
10g/L。
⑶在制备过程中，亚硒酸盐不能直接加热。
隔水煮沸时间亦不能超过规定时间，否则亚硒酸盐会变质，生成红色沉淀物。
青岛海博生物技术有限公司，主要从事生物、医学及相关领域的产品技术研究、开发和销售，涉及分子生物学、生物化学、医用诊断试剂以及各种微生物、检验用培养基等诸多方面。
海博生物技术有限公司现有产品：干燥培养基、显色培养基、常规检验培养基、药典培养基、植物组织培养基、运送培养基、临床检验培养基、动物疫苗培养基、一次性平板等
干燥培养基：有600多个品种,采用法国进口原料制作, 质量稳定、特异性好,并在不断开发新产品。
支原体培养基：由于质量稳定、特异性好，广泛用于全国各大医院和皮肤病专科医院，得到用户的一致好评。
显色培养基：生产金黄葡萄球菌显色培养基、大肠杆菌显色培养基、大肠菌群显色培养基、大肠杆菌和大肠菌群二合一显色、李斯特氏菌显色培养基、0157菌显色培养基、弧菌显色培养基、坂崎杆菌显色培养基等。