免疫组化染色操作步骤
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免疫组织化学染色原理和操作步骤
一、免疫组织化学原理
免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学,是根据抗原—抗体特异性结合的原理,应用带有可见标记的特异性抗体作为探针,检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法:直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分;间接法则先后加入一抗和二抗,形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的,该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶(PAP)法、亲和素—生物素—过氧化物酶(ABC)法和链霉亲和素—过氧化物酶(SP)法。
PAP法一抗和二抗均不标记,避免了标记过程对抗体活性的影响,但需要制备过氧化物酶的抗体,与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物(含3个酶分子和2个抗体分子),染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本,最后用H2O2和二氨基联苯(DAB)为底物显示过氧化物酶,即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸,可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合,从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白,与生物素有很高的亲合力,1分子亲合素可结合4分子生物素,ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似,一抗不标记,二抗用生物素标记,染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合,制成ABC复合物,并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后,再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAB 进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图(引自八年制《组织学与胚胎学》)
SP法与ABC法相似,其不同于ABC法之处在于用
生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后,加入链亲和素标记的过氧
化物酶使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAB进行
显色。与亲和素相比,链酶亲和素的结合力与亲和素相
似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作步骤,
同时也减少了非特异性背景,是目前应用最为广泛的免
疫绥化染色技术。
图2. SP法原理示意图
二、实验准备:
1. 标本准备
①石蜡包埋组织切片:由病理室常规处理
②冰冻组织切片:由病理室常规处理
③细胞爬片:将无菌盖玻片置于六孔板中,接种细胞,待细胞生长达到
60%以上后取出玻片,4%多聚甲醛固定2 h。
2.试剂准备
①抗体选择
单克隆抗体针对单一表位,具有较高的特异性,但在该表位破坏后
将得不到阳性结果;多克隆抗体表位针对多个表位,可避免单克隆抗体
的缺点,但是可能出现非特异性杂交。因此,不论选择单克隆还是多克隆抗体,最好同时购买两个货号的抗体,购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体,抗体说明书上必须有IHC测试结果。如果该分子文献报道较多,可选择文献上常用的经典抗体。
②二抗试剂盒
目前本实验室所用二抗试剂盒为Life Technologies Histostain-Plus Kit (HRP, Broad Spectrum),货号85-9043,一抗反应性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。
③DAB试剂盒
目前本实验室所用为加强型DAB显色试剂盒,货号DAB-2032。
④其他试剂
二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES胶3.抗体特异性验证
所有免疫组化抗体均须Western blot验证抗体特异性,并需免疫荧光实验验证抗原定位。
4. 耗材准备
免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片
5. 溶液配制
①磷酸盐缓冲液(PBS)
10×PBS母液配制
NaCl 72 g
Na2HPO4·12H2O g
KH2PO4
加蒸馏水至1000 ml,充分混匀贮存。
使用时用蒸馏水10倍稀释,调整pH值至—。
②柠檬酸抗原修复液
抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,配方如下:
称取柠檬酸g,溶于500 ml蒸馏水;称取Na2HPO4·12H2O ,溶于800 ml蒸馏水。分别量取358 ml柠檬酸溶液和642 ml Na2HPO4溶液,
充分混匀后调整pH值至,即得2×母液,贮存备用。
③1%盐酸酒精
浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合,充分混匀。
三、免疫组化操作步骤
1. 组织片脱蜡水化
①将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡,每缸15 min。
②依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸,每缸5 min。
③依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸,每缸5 min。
④依次放入90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇的玻璃缸,每缸2 min,取出。
⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗,重复3次。
2. 抗原修复
将切片浸入1×柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中,高压煮沸后继续加热2 min,然后停止加热让切片自然冷却。
注意:抗原修复过度或不足,均会影响最终染色结果。切片骤冷可致脱片,必须自然冷却!
3.封闭内源性过氧化氢酶
①放入3% H2O2溶液的玻璃缸中,浸泡15 min。
②放入蒸馏水的玻璃缸中清洗,重复3次。
③放入PBS缓冲液的玻璃缸中,浸泡5 min。
4. 抗体杂交
①甩去PBS余液,将组织片平辅在湿盒中,加正常山羊血清1滴
20 μl(试剂盒中的A液,根据组织大小调整用量),28℃放置20 min,甩干。
②加稀释好的一抗1滴(20~50 μl,根据组织块大小进行调整),置于湿盒4℃过夜。
③置PBS缓冲液的玻璃缸中,缓慢振荡清洗5 min,更换PBS缓冲