免疫组化、HE染色步骤

骨组织石蜡切片制作

步骤：

1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓

冲液内固定12—24h。

2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.

3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2 次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。

4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。

5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I 1小时，石蜡II 1小时。

6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。

7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。

免疫组化检测

步骤：

1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min 二甲苯

1（10min）二甲苯2（10min）。

2.水化：100%酒精1（2min） 100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min) 。

3.PBS冲洗3次，每次5min.。

4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸

15min ,自然冷却至室温。

5.PBS冲洗3次，每次5min。

6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活

性。

7.PBS冲洗3次，每次5min。

8.滴加1抗（GFP 1：100稀释, 4℃过夜）

9.PBS冲洗3次，每次5min。

10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min, PBS

冲洗3次，每次5min。

11. 滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min, PBS

冲洗3次，每次5min。

12.DAB显色5min。

13.自来水冲洗10min。

14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。

15.自来水冲洗10min。

16.常规脱水，透明，封片，镜检。

组织切片HE染色

步骤

1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各10min。

2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2 min，PBS冲洗2次，每次5min。

3、苏木素染色3 min, 自来水冲洗3 min, 1 %盐酸酒精分色2 s，自来水冲洗2 min, 依次浸入50 %、70 %、80 %的酒精中各2 min,伊红浸泡5 s，自来水冲洗3min。

4、再将组织切片依次侵入95 %酒精、无水乙醇I、无水乙醇II中各3min，最后再依次侵入二甲苯I,二甲苯II各5min。

5.中性树胶封片，镜检。