灵芝多糖启动人类属兔细胞的机制

1 灵芝多糖 启动人类树突细胞的机制现在科学界对于灵芝多糖如何影响殊途细胞并不清楚 而我们的研究团队则首都证实，灵芝多糖能活化 人类树突细胞内部负责传达信息的蛋白分子 NF-K8和P38 MAPK，进而加速树突细 胞的成熟，提高树突细胞的工作 效率，加快后续免疫翻译进行 的脚步，并有道T细胞朝 第一型免疫反应（TH1） 发展，相对压制了 过敏反应（TH2） 的产生 2

芝在中国和其他亚洲国家的使用非常普遍，其已被证实具有免疫调节和抑制肿瘤生长功能，对于慢性肝病,高血压和糖尿病 也有不错的资料效果。研究指出，灵芝能透过火星免疫反应来提升动物或人体的抗癌能力，其中主要的作用惩罚是具有（1→6）-β葡萄糖基分支结构的多糖体（PS-G），即所谓的[活性多糖]，它不仅能提高自然杀手细胞的毒杀能力，还能促进巨噬细胞和其他免疫细胞分泌TNF-α（肿瘤坏死因子α）和IFN-γ（干扰素γ）。灵芝活性多糖甚至能活化细胞内Akt蛋白分子的信息传播路径，进而延长嗜中性白血球（neutrophils）的寿命，是免疫系统因有较多数量的嗜中性白血球守卫而维持高度警戒。 (注：嗜中性白血球有类似巨噬细胞的作用机制，能吞噬入侵人体的细菌，病毒与癌细胞) 免疫系统里还有一群很重要的防卫不对叫做[树突细胞]（dendritic cell），它和巨噬细胞一样，站在人类免疫系统里的最前线。当任何病原体进入体内时，树突细胞便以最快的速度赶到事故现场，把病原吞入并切成碎片，再将这些碎片挂在细胞表面呈现给T细胞看，好让这位免疫兵团的总司令确切知道要对付的是什么样的敌人，并拟定作战计划，排除合适的兵力迎战。与此同时，树突细胞还会视捕捉到的病原体释放不同的细胞激素，左右T细胞的作战计划。所以，树突细胞可说是T细胞免疫反应类型与强烈程度的重要关键。 当树突细胞完成呈现抗原的任务时（即所谓的[成熟]了，细胞表面的CD40，CD80,CD86等分子标志和第二型MVH（major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体）的表达会升高。有报告指出，树突细胞的成熟，与其细胞内的NF-KAPPAB（NF-KB）分子密切相关。还有研究指出，肿瘤坏死因子α和脂多糖（LPS,又称内毒素，是细菌细胞壁的主要成分）能透过活化树突细胞内P38 MAPK,ERK和JNK等蛋白分子的信息传播路径，促使树突细胞发展成熟。 现今科学界对灵芝多糖如何影响树突细胞并不清楚，而我们的研究团队则首度证实，灵芝多糖能活化人类树突细胞内部负责传播信息的蛋白分子NF-KB和P38 MAPK,进而加速树突细胞的成熟（即提高树突细胞的工作效率，加快后续免疫反应进行的脚步），并诱导T细胞朝第一型免疫发展（）这类型免疫反应有利于扫荡病毒，细菌和癌细胞，相对抑制过敏反应的产生） 3

实验结果 2. PS-G能促使树突细胞分泌IL-12 p70、IL-12 p40和IL-10 在含有树突细胞的上清液里加入PS-G，结果发现，不论计量高低（1~200μg/ml）PS-G均能促进树突细胞分泌IL-12 p70、IL-12 p40和IL-10，自不过PS-G的计量越高效果越好，再以PS-G（10μg/ml）与树突细胞一起培养3~48小时，结果发现，PS-G须与树突细胞培 养一段时间（至少18小时）才能发挥作用（图2A、2B）。 以RT-PCR检测与PS-G（10μg/ml）培养3~24小时的树突细胞，结果在6小时和18小时时，IL-12 p35、IL-12 p40和IL-10 mRNA的表达显著增加，尤其是IL-12 p40 mRNA（图2C）；未经PS-G处理的树突细胞则测不到IL-12 p35、IL-12 p40和IL-10 mRNA。

灵芝多糖与树突细胞的来源 本实验使用的灵芝多糖PS-G来自灵芝（Ganodermalucldum）子实体，先以热水萃取，再加入酒精使多糖沉淀析出，为[95%多糖+5%蛋白质]的化合物。以LAL（Limulus amebocyte lysate）检测方法确定PS-G未受脂多糖污染 实验所用的树突细胞这是自人类周边血单核细胞（prelpheral blood mononuclear cells，PBMC）分离出CD14+的monocyte，再

以GM-CSF（granulocyteMacrophage- colony stimulating factor）和IL-4（白介素4）培养而得

1. PS-G能诱导树突细胞成熟 科学已证实，脂多糖能活化树突细胞并促使其成熟。因此我们以脂多糖（100mg/ml）引起的树突细胞反应作为指标，观察PS-G是否 也有相同的功效。实验得到的结果是肯定的，树突细胞在加入10μg/ml的PS-G之后的24小时，其表面的CD80、CD86、CD83、CD40、CD54等分子标志和第二型MCH表达升高，吃变化正是树突细胞活化和成熟的表现（图1）

（图1）不同条件下，树突细胞表面分子标志的变化：控制组（静置24小时候的树突细胞）、LPS组（限100μg/ml PS-G一起培养24小时的树突细胞） 4

3.PS-G能调降树突细胞的吞噬活性加速树突细胞成熟 当任何病原体进入体内时，活化的树突细胞会吞噬病原，并将其切割成碎片：一旦树突细胞停止吞噬和切割病原时，就表示它已经成熟并完成[呈现抗原]的任务——把切割的病原碎片挂在细胞表面，呈现给T细胞看。我们以会发出荧光的FITC-dextran作为检测的标的物，记过证实，树突细胞迈向成熟的过程中，PS-G会抑制树突细胞的吞噬作用（图3） 图3.将培养至第六条的未成熟树突细胞各别与脂多糖（100mg/ml）、PS-G（10ug/ml）一起培养24小时，然后再加入FITC-dextran培养一小时，虚线是在4℃环境下的结果，这个实验重复了三次，所得到的结果都相同（X轴Fluorescence intensity“发光强度；Y轴“树突细胞的数目”）

4.经PS-G处理的树突细胞能促进T细胞活化 先前的实验已经证实，PS-G能提高树突细胞表面分子标记的表达、促进树突细胞分泌IL-12,以及活化其细胞内的NF-kappab分子，这些记过都说明了PS-G能促使树突细胞在较短的时间内发展成熟，不过在PS-G鞭策下进入成熟状态的树突细胞，是否真能启动T细胞的免疫反应 我们把PS-G处理过的树突细胞与T细胞一起培养，结果就如（图4A）和（图4B）所示，PS-G不仅促使T细胞增殖，还诱导活化的T细胞分泌IFN-γ，而且PS-G的效果远胜与脂多糖的作用。 实验还发现，PS-G处理过的树突细胞能诱使T细胞分泌IL-10（图4C），而脂多糖则无此作用，此外，各组均未测得IL-4

（图2A）在含有树突细胞的上清液加入不等计量的PS-G观察树突细胞分泌IL-12 p35、IL-10的量

（图2B）在含有树突细胞的上清液里加入10ug/ml的PS-G一起培养3~48小时，观察树突细胞分泌IL-12 p35、IL-12 p40和IL-10的量。（p<0.05，图表中的“ND”=not ） 5 图4A 以脂多糖（100ug/ml）和PS-G各别与未成熟的树突细胞一起培养24小时，之后树突细胞再与T细胞一起培养，于五天后测量T细胞增殖的结果 图4B 图4C 脂多糖（100ug/ml）和PS-G（10ug/ml）各别与未成熟的树突细胞一起培养24小时，之后树突细胞再与T细胞一起培养，于二天后测量T细胞分泌FN-γ（图4B）与的IL-10（图4C）的浓度

5.TLR4受体是PS-G启动树突细胞的关键 为了了解PS-G是触动了树突细胞表面的那种受体而活化了树突细胞，我们各别把会与TLR-2或TLR-4受体结合的抗体加到树突细胞里，一小时后再加入不等浓度的PS-G（100ng/ml、1μg/ml、10μgμg/ml）一起培养15小时，结果发现，TLR-4受体先辈遮盖再以PS-G处理的树突细胞，所分泌的IL-12 p40 各别降低了70%、31%。47%（依前述PS-G浓 度排列）且IL-10也减少了55%、39%和20%；至于TLR-2受体先被遮盖再以PS-G处理的树突细胞，IL-12 p40和IL-10的分泌量则不受影响（原文富有图表，未图5，在此译文中省略）。 显然TLR-4受体是PS-G启动树突细胞的关键，换句话说，TLR-4受体就像是树突细胞某个大门的门铃，被PS-G这么一按，[叮咚~]使得原本在里面瞌睡的伙计们以为老板来了，赶快上紧发条进入备战状态

6.PS-G能活化IKK分子，进而引起IKBα的磷酸化 不过上述实验只做到灵芝多糖PS-G能触动树突细胞表面的TLR-4受体，接下来树突细胞内部会出现什么样忙碌的景象？这是后续实验所要了解的。 一个细胞的行为举止是由细胞内许多蛋白分子一起控制的，这些蛋白分子间的关系就像骨牌一样环环相扣，前面那个没动后面的也动不了 NK-KB分子在树突细胞内的地位就像总管一样，负责指挥调度细胞核内参与免疫反应的基因，不过他平常并不在细胞核内，而是位于细胞质，与另一个蛋白分子LKBα绑在一起形成NF-KB-LKBα复合物，要启动树突细胞的免疫反应，就要让NF-kb进到细胞核里；要让NF-KB进到细胞核里，就得先松绑NF-kb与lkBα。 负责处理这件事的是LKK家族蛋白。被活化的LKK分子能引起LKBα磷酸化进而降解，使得NF-KB得以从NF-KB-LKBα复合物被释放出来