小球藻固定化培养的初步研究
固定化藻球的强化研究
２１ ０ １年 ６月
湖 北 农 业 科 学
Ｈｕｂ ｉ ｅ Ａｇ ｃ ｌｕｒｌ ｃｅ ｅ ｉ ｒ ｕ ｔ ａ Ｓ ｉｎｃ ｓ
Ｖｏ ． ＯＮｏ １ １５ ．１
Ｊ ｎ ，０ １ ｕ ．２ １
固定化藻球的强化研究
严 清 ． 国 忠 冯
（ 庆 师 范大 学 生命 科 学 学 院 ， 庆 重 重 ４ ０４ ） ０ ０ ７
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固定化与游离态小球藻脱氮除磷对比研究
固定 化与游离 态小球藻脱氮 除磷对 范 大学 大 学城 建 设指 挥部 ， 庆 ４ ０ ４ ； 重 ０ ０ ７ ２ 中 山大 学环境科 学与 工程 学院 ， 东广 州 ５ Ｏ ７ ） ． 广 ｌ ２５
摘 要 ：对 固定化 与 游 离态小球 藻脱氮 、除磷 进行 对 比研 究 ，结果 表 明 固定化 藻在 ２ ｄ内对 Ｎ 一 Ｈ Ｎ和 Ｐ ４ 一 Ｏ３ Ｐ的净化 效率 比悬浮 态藻分别 高 ２ ．４ 一 ３ １％和 ３ ．９ 固定化后初 期会 对 ５ １％。 藻细胞 的 生长产 生影响 ， 得 固定化 藻的数量 增长慢 于悬浮 态藻 的生长 ， 使 但在 较短 时间 （４ ２ｈ 左右 ）内细胞 的活性 即可恢 复 ， 并保持持 续生 长 ， 这说 明 固定化 没有 对细胞 产生 不可恢复 的 损伤 。 固定化 藻技 术 不仅保 留 了悬 浮态藻的优 点 ， 而且使 得 藻对 氮、 的去 除率有较 大提 高 ， 磷 对藻细胞起 到 了保护作 用 ， 长藻细胞 的生长期 ， 延 有利 于细胞 更 多地吸 收 氮、 。 磷 关 键词 ： 固定化 藻 ； 离态藻 ； 游 普通 小球 藻 ； 氮 除磷 脱
Ａｂ ｔａ ｔ Ｒｅｅｒｈ ｏ ｍｍｏ ｉｚｄ ａ ｄ ｆｅ ｅ ｕｔｒｓ ｈ ｘ ｅ ｍｅ ｔｌｒｓ ｌ ｈ ｗ ｄ ｔａ ｓｒ ｃ ： ｓａｃ ｎ ｉ ｂｌ ｅ ｎ ｒｅ ｃ ｌ ｃ ｌ ｅ ．Ｔ ｅ ｅｐ ｒ ｎａ ｅｕｔ ｓｏ ｅ ｈ ｔ ｉ ｌ ｕ ｉ ｓ
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海藻酸钠固定化预实验
植物细胞固定化预实验实验目的：熟悉海藻酸钠做固定剂下植物细胞固定化培养试验操作。
实验材料：悬浮培养的植物细胞种子、250ml三角瓶5个、培养皿、移液枪、电子称、电磁搅拌器、滴管或注射器、烧杯、纱布、漏斗、铁架台。
实验步骤1.实验准备：配制植物细胞液体培养基分装到4个250ml三角瓶中，每瓶70ml；溶液；配制40g/L的海藻酸钠溶液100ml并称量配制好配制一定量20g/LCaCl2。
的海藻酸钠溶液质量w12.灭菌3.制备凝胶球3.1取种子液用两层无菌纱布过滤，收集滤液。
3.2静置滤液，用移液枪移去上层培养液至于事先准备好的无菌三角瓶中备用。
获得植物细胞。
3.3取鲜重20g的细胞于配置好的无菌还在酸钠溶液中边加入边用电磁搅拌器搅拌。
溶液中形成直径3.4用滴管或注射器吸取海藻酸钠--细胞混合液滴入无菌CaCl2溶液，用无菌水充分洗涤凝胶珠。
3--5mm的凝胶球，放置30--60min后倒出CaCl2）/20g加入到含70ml新鲜培养基+10ml原培养基3.5称量胶球质量w=8*（20+w1的三角瓶中，制作两瓶。
称量植物细胞鲜重8g加入到含70ml新鲜培养基+10ml 原培养基中做对照。
4.在一定条件下进行摇瓶振荡培养，每5天取发酵液测定培养基组分消耗情况、代谢产物的生成速率等并观察记录胶球完整情况。
植物细胞固定化培养原理及海藻酸钠浓度单因素试验方案科学研究发现，密集而有一定程度分化的、生长缓慢的细胞培养物，较分散而无结构的、生长迅速的细胞培养物累积更多的次生代谢物。
其原因为:前者细胞所处的理化环境与其在整体植物中所处的环境类似，细胞因而能够发挥正常的代谢功能；而对后者而言，细胞在培养液中所处的环境既无极性，也无理化梯度。
故而设想把细胞固定在一定的支持物上，使它们之间密切接触，并形成一定的理化梯度。
如此，既可以保障细胞的营养需要，又可避免由于代谢产物的累积而对细胞代谢造成反馈抑制。
物质生产大多利用处于稳定增殖期的细胞，由于固定化抑制生长发育，因此应考虑尽可能模拟稳定期等等。
小球藻的培养
小球藻的培养一、小球藻小球藻是单细胞植物，种类较多，多数生活在淡水中，少数生活在海洋里。
按植物学分类，小球藻属于小球藻纲绿藻目原球藻科生物，其体型小，直径一般为3～5μm，在显微镜下，需要放大400～600倍才能看到，我们肉眼看到的只不过是含有小球藻的绿色的水。
小球藻所含的营养成分很高，其蛋白质含量达到50%～60%（相当于花生米的2倍、鸡蛋的5倍），含脂肪10%～30%，还含有多种维生素。
小球藻的生物活性物质糖蛋白和多糖体的含量也相当高，这些生物活性物质具有增强人体免疫力、抗癌、降血压、抑制血糖上升、排除体内毒素和迅速恢复机体损伤等功能。
因此，小球藻的培养前景广阔。
作为培养原料的小球藻，可以到较清洁的池塘、水坑中采集绿色的水，在显微镜下鉴定，然后再用。
也可以向培养它的人索取。
1 容器的准备小规模的培养可用瓶、缸等，大规模的培养可用水泥池。
首先，要对所使用的容器进行消毒，一般用100mg/L的漂白粉水溶液浸泡，再用水冲刷数次。
(100mg/L的漂白粉水溶液的配制：①天平称量5g2%漂白粉澄清液；②定量转移至容量瓶中；③加水至1L；④混匀。
2％漂白粉上清液的配制法：取漂白粉2克，加少量水搅匀，再加水至100毫升，充分调匀后，待澄清后取上清液使用。
）2 培养液的准备（1）BG11液体培养基配方：Stock1 定容100mL 柠檬酸0.3g 柠檬酸铁胺0.3g EDTANa2 0.05gStock2 定容1000mL NaNO3 30g K2HPO4 0.78g MgSO4·7H2O 1.5gStock3 定容100mL CaCl2·2H2O 1.9g Stock4 定容100mL Na2CO3 2gStock5 定容1000mL H3BO3 2.86g MnCl2·4H2O 1.81g ZnSO4·7H2O 0.222gNa2MnO4·2H2O 0.391g CuSO4·5H2O 0.079g Co(NO3)2·6H2O 0.049gStock1 取用2mL Stock2 取用20mL Stock3 取用2mL Stock4 取用1mL Stock5 取用1mL 总定容1000mL（2）购买2000元/套，九种原液各200ml（稀释1000倍），10瓶。
小球藻的培养技术及培养流程
小球藻的培养技术及培养流程小球藻可在自养条件下利用光能和二氧化碳进行正常的自养生长, 也可在异养培养条件下利用有机碳源进行生长和繁殖。
目前其培养方式主要包括开放式培养和封闭式培养。
开放式培养在敞开容器中进行, 一般用水泥池,CO2 可以采用人工供给或依靠与空气的自然交换, 并通过人工搅拌使空气中的CO2 溶解的方法来补充。
但开放式培养存在一些不易克服的缺陷: 首先是不可避免地受到自然条件(如阳光、温度等)的影响和限制, 产量、质量难以维持稳定; 其次是易受到异种生物的污染甚至取食,引起培养藻液的退化甚至培养失败。
封闭式培养主要有密闭发酵罐和玻璃管道光合生物反应器培养, 离心式水泵搅拌或气升式搅拌, 补加无机营养液或有机营养液及CO2, 产量约为开放式培养的10倍。
用管道光合反应器大规模培养小球藻的工艺流程如图所示。
虽然封闭式培养设备成本高, 但便于控制, 能抗污染, 可提高产率,生物系统的稳定性好, 质量和产量也较稳定。
小球藻培养既可利用自然光, 也可人工光照, 最适光强为2000～5000lux, 温度25～30℃, pH615～715, 主要使用无机营养液进行培养, 也可在培养基中加入果糖、乙酸、甘油、半乳糖、葡萄糖等物质, 使其变成异养生长。
营养液配方根据产品的目的不同而不同, 作为人类健康食品和医药制品为目的的产品, 无机营养液要求用分析纯的化学试剂配制; 作为饲料添加剂为目的的产品, 可以使用化学肥料, 补充微量元素。
小球藻同其他微生物相比, 藻产物较稀, 因此收获中需采取有效的脱水步骤。
过去小球藻细胞的收获常采用凝结法、絮凝法、沉淀法、过滤法等等, 但这些方法严重影响产品的质量, 目前主要采用离心法收获小球藻, 滤液有时还可以循环使用。
该方法很有效, 但需要较高的投资和耗能。
小球藻培养的三个流程及比例
小球藻培养的三个流程及比例下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 配方：小球藻培养基的配方可以根据不同的需求进行调整，以下是一种常用的配方：硝酸钠（NaNO3），1.5g/L.磷酸二氢钾（KH2PO4），0.04g/L.硫酸镁（MgSO4·7H2O），0.075g/L.氯化钙（CaCl2·2H2O），0.025g/L.碳酸钠（Na2CO3），0.02g/L.柠檬酸铁铵（FeC6H5O7·NH4OH），0.005g/L.微量元素溶液，1ml/L.2. 微量元素溶液配方：硼酸（H3BO3），2.86g/L.氯化锰（MnCl2·4H2O），1.81g/L.硫酸锌（ZnSO4·7H2O），0.22g/L.硫酸铜（CuSO4·5H2O），0.08g/L.钼酸钠（Na2MoO4·2H2O），0.02g/L.3. 制备方法：将硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠、柠檬酸铁铵等试剂分别溶解在适量的蒸馏水中，搅拌均匀。
微藻固定化技术及底栖硅藻固定化培养研究现状
２２
生命科学仪器 ２００７ 第５卷／ ５ 月刊
研究报告
擦洗大型海藻表面或粉碎大型海藻后过滤等方法获得 底栖硅藻藻种，在育苗之前使用育苗的波纹板捆绑或 聚乙烯薄膜装框后作为固定化载体，在育苗池用氢氧 化钠或漂白液消毒后进行敞开式培养，海水经沉淀后 沙滤，泼洒接种，施用硝酸钠，磷酸二氢钾，硅 酸钠，柠檬酸铁后连续充气培养。这种培养方式存在 很多弊端：藻种不纯，施肥后带有的蓝藻、绿藻等杂 藻往往经过一段时间的培养后成为优势种群，与底栖 硅藻争夺生长资源，使底栖硅藻生长缓慢、密度低，甚 至导致底栖硅藻的培养失败。这种培养方式还容易污 染原生动物和其他危害性动物，如在四月份桡足类盛 行的时候，在一两天之内就可以将培养的底栖硅藻啃 噬成光板，若使用污染有桡足类动物的饵料底栖硅藻 投喂海参稚参会造成稚参被桡足类残食，在几天之内 整池的稚参可被残食完毕，导致育苗失败。养殖时间 长，一般为 １．５￣２ 个月，藻种易老化，生长密度低， 一般为 ３０００￣６０００／ｍｍ２［１１］。
１ 微藻固定化载体
固定化载体一般具有如下特点：固定化过程温 和，对细胞无损伤或损伤小；固定化载体是惰性的，对 细胞不产生毒害；载体具有一定的强度，在所使用的 物化条件下不会被破坏；固定化载体具有良好的通透 性，有利于气体、营养、代谢产物的自由扩散。固定 化方法有载体法、吸附法、包埋法、共价结合法、交 联法等。藻类固定化多用被动包埋和主动侵入吸附两 种不同的方法，常用包埋剂有聚丙烯酰胺、聚氨基甲 酸乙酯和聚乙烯醇等人工合成的包埋剂和褐藻酸盐、 琼脂、角叉菜胶和壳聚糖等天然高分子包埋剂［１］。其 中，褐藻酸盐是包埋法固定化技术中人们最普遍采用
小球藻
产品信息
用途
产品
小球藻培养基1）营养添加剂--提供高含量的蛋白质、叶绿素、维生素、矿物质、核酸。 2）功能：A：增强人体免疫功能 B：抗病毒感染和增殖 C：抑制癌细胞增殖 D：迅速修复机体损伤 E： 排除体内毒素 F：抑制血压血糖上升 G：降低血清胆固醇含量 3）作为食用色素提取物 4）饲料-鱼虾开口饵料 5）化妆品原料
据研究小球藻还具有抗辐射、防治胃溃疡和溃疡性大肠炎等各种炎症、缓解心理压力和纤维肌痛等生理活性。
药用信息
原形态 生境分布
栽培 化学成份
⒈蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）球形单细胞有机体。胞体圆形，直径3-5μm。胞壁透明。胞内 的原生质体中具有1枚细胞核，和具有1个造粉核的杯形叶绿体或称色素体。繁殖时，由细胞内的物质分成数小块， 小块变成圆形，直径0.3-0.7μm，母体胞壁破裂后，幼体散出。
结果：1．大鼠食用缺铁食饵，即出现贫血，血红蛋白及红细胞减少。
2．贫血鼠食用一定铁量的3、4、5组食饵迅即恢复，食用第2组含铁量少的食饵，则恢复延迟。
3．体重增长发现，1、2组较第5组明显迟缓（P<0.01=，第3组同样受制。1、2组较第5组红细胞数量为少 （P<0.01=。
感谢观看
目前世界上已知的小球藻约 10种，加上其变种可达数百种之多。小球藻广泛分布于自然界，以淡水水域种 类最多；易于培养，不仅能利用光能自养，还能在异养条件下利用有机碳源进行生长、繁殖；并且生长繁殖速度 快，是地球上动植物中唯一能在 20h增长 4倍的生物，所以其应用价值很高。我国常见的种类有蛋白核小球藻、 椭圆小球藻、普通小球藻等，其中蛋白核小球藻蛋白质含量高，营养价值最高。
养殖技术在初春设置500-1000L的浅水槽，用最小目的过滤海水3份、淡水1份放满水槽，每1000kg水加入硫 铵300g，过磷酸钙50g，配成培养液，放入小球藻藻种，1个月后小球藻即可繁殖生长。
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一
４ ８ １ ２ １ ６
２ ０ ２ ４
培养天数
不 同接 种 量对 固定化 ， ｊ 、 球 藻 细胞 生长 的影 响
养殖技 术顾问 ２ ０ １ ３ ． ９
吁 研 究 与 综 述
胶珠收到一定程度 ，但在实验 ∞ ６ ∞ ５ ４ ∞ ３ ∞ ２ ∞ ｌ ∞ Ｏ ∞ ３ ∞ ２ ∞ ２ ｌ 如 １ ∞ ∞ Ｏ 的影 响所阻碍 的缘故 周期 内， 一直处于不断的生长阶段 ， 表明固定化小球 藻具有较长的生长周期 ， 有利于进行种质保存 。
入２ ０ ０个胶 珠 时 细胞 生长量 大 。与 游 离的 小球 藻相 比 ， 固定化 小球 藻 生长慢 ， 但 生 长周期 长 。 关 键词 ： 小球 藻 、 固定化 、 生长
固定化作为构建生物反应器 的一项重要 的生物 工程技术 ， 最初用于酶 的固定化 ， 随后用 于细苗、 酵 母等微生物活细胞的固定化培养。在大量 的基 础研 究 和生产实践 中，已经取得 了十分显著 的经济效益 和社会效益 。然而对藻类细胞的固定化研究 ，在 ２ ０
２ ． ２ 接 种 量 对 固 定化 细胞 生 长 的影 响
从图 ２ 可以看 出， 随着接种量的增加 ， 固定化小 球藻 的生长量随之增长 ， 但从图 ３中可以看出 ， 固定
化小球藻的生长率 随着初 始接种量 的增加而降低 ， 又考 虑到在一般培养条件下细胞密度可达到 ｌ Ｏ ｓ 细 胞数 ， 毫升 ， 为 了省去浓缩藻液的过程 ， 因此一般选 择１ ０ ５ 细胞数 ， 毫升的接种密度 即可。
凄
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遍后 ，按各试验的要求培养于 １ ０ ０ 毫升 的三角烧瓶 （ ５ ０ 毫升 培养液 ） 中。
・
２ 结果 与讨 论
２ ． １胶球 直径对 固定化 细胞 生长的影响
作者简 介 ： 陈书秀 （ １ ９ ８ ３ ～） ， 女， 工程师 ， 硕士 ， 主要从事微藻 生理生化研究 。
瓣
Ｐ ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． Ｐ ． ． ． ． ． ． ． ． 。 ． ． 。 ． 。 ． ． ， ． ． ． － ． ． ． ． ． 。 ． ． ． － 。 ． ． ． ． ． ． ． ． ． ｋ ． ． ． ， ．
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固定化后 ， 生长较缓慢 ， 可能是营养物质 和光线进入
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划
：： 一
，＿ 密度
图 ３不 同初 始接 种密度 对 固定化 小球 藻生 长率的 影响
从 总 的生 长趋 势来 看 （ 见图 １ ） ， 针头 越 小 ， 胶珠
直径越小 ， 细胞 的生长量越大 。胶珠直径越大 ， 所产 生 的扩散传质阻力越大 ， 胶珠 内细胞所需营养不足 ， 积累的代谢产物增多 ， 细胞生长环境恶化 ， 同时胶珠
世纪 ８ Ｏ 年代才开始进行探索性的工作 。初步的研究 结果表 明， 微藻 固定化在有用物质及能振生产 、 生物 传感器 、 污水处理 、 种质保存及模拟生物反应器等领
域具有广阔的应用前景【 ｌ － ２ 】 。 海洋徽藻的固定化以能进行放 氧型光合作 用的 海洋生物为研究对象 ，从而使 固定化技术在海洋生 物技术领域中开辟 了新的研究和应用方 向。因此 ， 其
内部 的光照不足 ，所 以这些不利条件使得大直径的 固定化小球藻生长受阻 ， 又因胶珠越小 ， 制备速度越
研 究 与 综 述
小 球 藻 固 定 化 培 养 的 初 步 研 究
陈书 秀 （ 山东东方海洋科技股份有限公司 山东烟 台 ２ ６ ４ ０ ０ ３ ）
摘要 ： 用褐藻酸钙对小球 藻进行 固定化培养 实验 ， 测定不同胶粒大小、 胶珠密度、 氯化钙浓度及不
同接种量对该藻的影响， 比较 了自由化生长与 固定化细胞的生长曲线。 小球藻在褐藻酸钙凝胶 中仍具 有呼吸和光合作用的能力。球径为 ３ ． ５毫米， 氯化钙浓度为 ３ ％时， 细胞 生长快 ， 每５ ０ 毫升培养液 中加
培养 天数
图 １胶珠大小对固定化 小球藻生长的影响
工作还相当薄弱。本研究 以海藻酸钙为固定化载体 ， 以具有全面均衡营养价值及多种应用前景的小球藻囫 为固定化对象 ，初步探讨 固定化条件对其生长 的影
响 ，以期为 固定化培养海洋徽藻技术 的应用 和发展 提供必要 的实验依据和理论基础。
州
２ ． ３ 氯化 钙 浓 度 对 固定 化 细胞 生 长 的 影 响
考虑成球 和小球藻的生长情况 ，固定化时氯化 钙的浓度为 ３ ％较好。见图 ４ 。
培养天数
图 ６小球 藻 自由生长 与 固定化 细胞 的生 长 曲线
，一 、
１ 材料与方法
小球藻 （ ， Ｃ ｈ ｌ ｏ ｒ ｅ ｌ ｌ ａ ｓ ｐ ． ）藻种 由中国海洋大学提 供， 本实验室保存。培养液为 培养基 ， 光照强度为 ２ ０ ０ ０ ３ ０ ０ ０勒克斯 ， 温度为 ２ ０ ｃ Ｉ ＝ 。 配制 ３ ％（ ｗ， 、 ， ） 的 海藻酸钠凝胶溶液 ，将一定密度 的藻液与凝胶溶液 按一定 的体积比混合 ，充分搅匀后制成胶 一 藻混悬 液， 用注射器吸取混悬液 ， 滴入氯化钙溶液 中， 约３ ０ 分钟后形成 固化的海藻酸钙胶珠。 用消毒海水洗涤 ３
慢， 一般选用 ６ 号针头。
３ ０ ｏ ２ ５０ ２ ｏｏ
喾 １ ５ ０
Ｘ １ ０ ０
咖 ５ ０
０
０ ４ ｌ ２ ｌ ６ ２ Ｏ ２ ４ ２８
研究成果不仅为海洋生物资源的研究 、开发和利用 提供更广阔的应用前景 ，而且也将丰富现有 的固定 化理论和技术。然而 ， 海洋徽藻固定化 的基础性研究