蛋白质组学研究方法
蛋白质组学研究方法与实验方案
蛋白质组学研究方法与实验方案1. 什么是蛋白质组学？好吧，咱们先聊聊什么是蛋白质组学。
想象一下，咱们的身体就像一个精密的机器，每个部件都有它的角色，而这些部件就是蛋白质。
蛋白质组学，简单来说，就是研究这些蛋白质的科学。
通过它，我们能够了解它们的结构、功能，以及它们在身体里是如何相互作用的。
就像侦探破案一样，蛋白质组学帮我们解开生命的奥秘。
真是既神秘又有趣，尤其是当你发现一些小细节时，那种“啊哈！”的感觉，简直让人兴奋得想跳起来！2. 蛋白质组学的研究方法2.1 样本准备首先，样本准备可是一门艺术。
你不能随便拿个东西就往实验室一扔，这样可不行哦！一般来说，样本可能是血液、细胞或者组织。
准备这些样本时，注意卫生和安全，搞得像开派对一样，干净利索才行。
样本收集后，我们需要把它们冷藏，保持它们的新鲜度，毕竟没人想要一份过期的蛋白质套餐，对吧？2.2 蛋白质提取接下来，我们进入蛋白质提取的阶段。
想象一下，像是在厨房里做大餐，首先要把食材准备好。
提取蛋白质就像把牛肉从牛排里切下来，一刀切下去，油油的鲜香就出来了。
我们用各种化学试剂，像是盐酸、乙醇这些，来分离出蛋白质，得小心别让它们变成一团糟。
处理得当，才能确保后面的分析顺利进行。
3. 蛋白质分析3.1 质谱分析然后就是蛋白质分析环节。
这时候，质谱仪就像一位高级侦探，能够识别出蛋白质的身份。
你可以把质谱想象成一个超级厉害的放大镜，它能让我们看到蛋白质的分子量和结构。
分析结果能告诉我们这些蛋白质的种类、数量，甚至还可以了解它们的相互作用。
哇哦，真的是一门高科技的艺术呢！3.2 数据解读最后，我们得对数据进行解读。
就像读一本悬疑小说，刚开始可能没看懂，但越往后看越有趣。
这个过程需要耐心和细心，数据可能会让你感到困惑，但一旦你理解了其中的奥妙，简直就像解开了一个千古之谜。
通过这些数据，我们能够找到疾病的潜在标志物，或者探索新药物的目标，真是让人感到自豪的工作！4. 实验方案小贴士当然啦，在整个实验过程中，有几个小贴士可以帮助你事半功倍。
小鼠红细胞蛋白质组学
小鼠红细胞蛋白质组学在生物科学研究领域，蛋白质组学作为一种重要的研究手段，正逐渐揭示生物体内蛋白质水平的整体构成、功能及其相互作用。
小鼠红细胞蛋白质组学，作为红细胞研究领域的一个重要分支，旨在研究小鼠红细胞中的蛋白质组成和功能，为解析血液生理现象和疾病发生机制提供重要线索。
一、小鼠红细胞蛋白质组学研究方法1.蛋白质提取与分离：从小鼠血液中提取红细胞，采用高效液相色谱法（HPLC）或其他蛋白质分离技术，对红细胞蛋白质进行分离，得到具有特定功能的蛋白质组分。
2.质谱分析：将分离得到的蛋白质样品进行质谱分析，获得蛋白质的分子量、氨基酸序列等信息，为后续功能研究奠定基础。
3.生物信息学分析：通过对比已知数据库，对质谱分析所得的蛋白质进行鉴定和功能预测，揭示小鼠红细胞蛋白质组的组成和功能关系。
4.蛋白质相互作用研究：利用酵母双杂交、共免疫沉淀等方法，研究红细胞蛋白质之间的相互作用，揭示蛋白质网络及其调控机制。
二、小鼠红细胞蛋白质组学的重要研究领域1.血红蛋白研究：血红蛋白是红细胞中最主要的蛋白质，负责运输氧气和二氧化碳。
对血红蛋白的研究有助于了解小鼠的生理功能和病理生理过程。
2.免疫球蛋白研究：免疫球蛋白是机体免疫系统的重要组成部分，存在于红细胞表面。
研究免疫球蛋白有助于揭示小鼠免疫调节机制和红细胞在免疫应答中的作用。
3.酶学研究：红细胞中含有多种酶，参与生物体内的代谢和信号传导。
对酶蛋白的研究有助于了解红细胞在生理和病理过程中的作用及调控机制。
4.黏附蛋白研究：红细胞黏附蛋白参与红细胞在血管内的定向滚动，影响血液循环。
研究黏附蛋白有助于揭示小鼠血液循环的调控机制和病理状态下红细胞功能的变化。
三、小鼠红细胞蛋白质组学在疾病研究中的应用1.贫血病研究：贫血是一种常见的血液疾病，研究小鼠红细胞蛋白质组学有助于揭示贫血发生的发展机制，为贫血病的诊断和治疗提供新思路。
2.心血管疾病研究：心血管疾病是全球死亡率最高的疾病之一。
蛋白质组学 自上而下 自下而上
蛋白质组学自上而下自下而上蛋白质组学是研究生物体内蛋白质的种类、结构和功能，并通过大规模和高通量的技术手段进行分析和研究的学科。
蛋白质是生物体内最重要的功能分子，它们可以参与细胞的结构、运输、代谢、信号传导等多种生命活动，因此对蛋白质的研究对于理解生命活动、疾病机制以及药物研发具有重要意义。
蛋白质组学的研究可以从两个方向进行：自上而下和自下而上。
自上而下的研究方法是先对整个生物体的蛋白质进行分离和纯化，然后通过质谱等技术手段进行鉴定和定量分析。
自下而上的研究方法则是从蛋白质的序列出发，通过基因组、转录组等信息来推断蛋白质的结构和功能。
下文将详细介绍这两种研究方法及其在蛋白质组学中的应用。
自上而下的蛋白质组学研究方法主要包括蛋白质分离、纯化和质谱分析。
蛋白质分离常用的方法包括凝胶电泳、液相色谱和等电聚焦等，通过这些方法可以将生物体内的蛋白质按照大小、电荷、极性等物理性质进行分离。
分离后的蛋白质需要进行纯化，以去除杂质和提高样品的纯度。
质谱分析是自上而下蛋白质组学的核心技术，它可以通过质谱仪测定蛋白质的质量和荷电量，并进一步通过质谱图谱鉴定和定量目标蛋白质。
自上而下的蛋白质组学方法在蛋白质组学研究中得到了广泛应用，特别是在疾病蛋白标志物的发现和定量、药物作用机制研究以及蛋白质修饰等方面取得了重要进展。
例如，通过质谱分析可以发现一些具有特异性的疾病标志物，从而实现早期诊断和个体化治疗。
此外，质谱分析还可以用于研究蛋白质的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等，从而揭示蛋白质的功能调控机制。
自下而上的蛋白质组学研究方法则是从蛋白质的基因组和转录组出发，通过生物信息学方法来预测蛋白质的结构和功能。
常用的自下而上的方法包括同源建模、蛋白质结构预测和功能预测等。
同源建模是利用已知蛋白质结构的模板来预测目标蛋白质的结构，通过结合同源序列比对和蛋白质结构预测软件可以获得目标蛋白质的三维结构模型。
蛋白质功能预测则是通过比对蛋白质序列与数据库中已知功能蛋白质的序列，从而推测目标蛋白质的功能。
蛋白质组学研究的主要内容和方法
蛋白质组学研究的主要内容和方法蛋白质组学，听起来好像个高深的学问，实际上呢，它就是研究蛋白质这个“小家伙”的一门学问。
咱们都知道，蛋白质是构成生命的基本单位，没了它，咱们可就没法运转了。
想象一下，蛋白质就像是咱们身体里的小工人，负责着各种各样的任务，比如说修复受损的细胞、推动新陈代谢、甚至调节咱们的情绪。
是的，情绪！那可不是开玩笑的，很多时候，咱们的心情波动跟体内的蛋白质水平有着千丝万缕的关系。
说到蛋白质组学，首先得提到它的主要内容。
它就是要搞清楚各种蛋白质在不同的环境、不同的细胞里是怎么工作的，怎么互相配合的。
想想一场大合唱，歌手们得配合得天衣无缝，才能唱出美妙的旋律。
而在身体里，这些蛋白质就像是合唱团里的每一个成员，各自有各自的角色。
如果有哪个成员跑偏了，整个合唱就得打折扣。
所以，蛋白质组学研究的目的，简单说，就是要弄清楚这些小工人们的工作状态，看看谁在忙活，谁又在偷懒。
再说方法，蛋白质组学的工具可真是五花八门。
有的像个大魔法师，能把成千上万种蛋白质一锅端；有的则像个细心的小侦探，能分析出每个蛋白质的结构和功能。
提到的就是质谱分析，这玩意儿就像是一台超级放大镜，能把蛋白质拆得干干净净，然后告诉你它们的分子量。
你想啊，这就好比是你去市场买菜，摊贩告诉你每种菜的价格，哪个贵哪个便宜，心里就有数了。
还有一种常用的方法叫做二维电泳。
说白了，就是把蛋白质分成两部分，一部分按照电荷，另一部分按照分子量。
就像是把水果按颜色和大小分类，最后你就能清楚地看到每种蛋白质的“长相”，多有趣啊！还有西方印迹法，也就是我们俗称的“WB”，这玩意儿就像是在给蛋白质做个身份登记，看看它们是不是干净，是否有被污染的可能。
再说说蛋白质组学的应用，真是多得让人眼花缭乱。
咱们可以通过研究某种疾病的蛋白质变化，找到新的治疗方案。
这就像侦探破案，蛋白质的变化就好比是罪犯留下的线索。
比如说，研究癌症的蛋白质组学，科学家们就能从肿瘤细胞中找到异常蛋白，进而开发出靶向治疗药物，真是了不起！想想看，这不仅能拯救无数生命，还能让患者重拾希望，太神奇了。
比较蛋白质组学研究常用方法
比较蛋白质组学研究常用方法蛋白质组学研究是一门关于生物体内所有蛋白质的研究，它在生物科学领域具有重要意义。
蛋白质组学研究的常用方法包括质谱法、二维电泳法和蛋白质芯片技术等。
下面将对这些方法进行详细比较。
质谱法是蛋白质组学研究中最常用的技术之一、它可以对生物样本中的蛋白质进行分离、鉴定和定量。
质谱法有两种主要类型：质谱-质谱联用（MS-MS）和质谱成像（MSI）。
质谱-质谱联用技术结合了质谱和质谱技术，可以对复杂的样本进行更深入的分析，同时还能确定蛋白质的化学结构和功能。
质谱成像技术则可以在样本表面上实时进行蛋白质定量和定位。
与质谱法相比，二维电泳法是另一种经典的蛋白质组学技术。
二维电泳法通过两个连续的电泳步骤将蛋白质在空间和pH梯度上进行分离。
第一次电泳通常使用等电聚焦电泳技术，根据蛋白质的等电点将其分离出来。
然后，使用SDS-电泳技术将蛋白质按照分子量进行分离。
二维电泳法具有高分辨率和高灵敏度的优点，但是它在分析大量样品时存在一定的局限性。
蛋白质芯片技术是一种新兴的蛋白质组学方法。
它通过将蛋白质分子固定在芯片表面上，使用流式细胞仪等设备对蛋白质进行高通量的鉴定和定量。
蛋白质芯片技术具有高灵敏度、高通量和高自动化性的特点，可以同时分析多个样本，因此在蛋白质组学研究中非常受欢迎。
除了上述常用方法外，还有一些其他的蛋白质组学研究方法。
例如，蛋白质亲和纯化技术可以通过结合靶蛋白质与其他蛋白质或配体来寻找特定蛋白质，并从中分离出目标蛋白质。
蛋白质相互作用研究方法，如酵母双杂交技术和亲和纯化-质谱法，可以用于检测和分析蛋白质之间的相互作用和信号传递网络。
综上所述，蛋白质组学研究涉及多种常用方法，每种方法都有其优点和局限性。
研究人员可以根据研究目的、样本特性和实验需求选择合适的方法。
此外，随着技术的不断发展和改进，蛋白质组学研究方法将越来越多样化和多样性，为研究人员提供更好的工具来揭示蛋白质的结构、功能和相互作用。
蛋白质组学方法比较
蛋白质组学方法比较蛋白质组学是研究蛋白质在细胞、组织或生物体水平上的表达、修饰和功能的科学领域。
下面是蛋白质组学中常用的方法的比较：1. 质谱法（Mass Spectrometry, MS）：质谱法是蛋白质组学中最常用的方法之一。
根据质量-电荷比（m/z）分析蛋白质的分子量和结构，可用于鉴定蛋白质序列、翻译后修饰和互作蛋白等。
- 优点：高灵敏度、高分辨率、可定量、可鉴定多种翻译后修饰。
- 缺点：不适用于大规模分析、需要高度精确的质谱仪器。
2. 二维凝胶电泳（Two-Dimensional Gel Electrophoresis,2DGE）：2DGE 是将蛋白质通过等电聚焦电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合，根据蛋白质的等电点和分子量进行分离。
- 优点：分离效果好、可获得蛋白质的相对丰度、可鉴定翻译后修饰。
- 缺点：不适用于低丰度蛋白质、定量不准确、有偏性。
3. 差异凝胶电泳（Difference Gel Electrophoresis, DIGE）：DIGE 是在2DGE的基础上引入荧光标记，同时分析多个样品的差异。
- 优点：高通量、高灵敏度、定量准确、可鉴定多种翻译后修饰。
- 缺点：需要昂贵的设备和试剂、荧光标记可能影响蛋白质性质。
4. 蛋白质微阵列（Protein Microarrays）：将蛋白质固定在固相载体上，通过与样品中的蛋白质相互作用来鉴定和分析蛋白质。
- 优点：高通量、高灵敏度、可进行蛋白质互作研究。
- 缺点：需要提前知道蛋白质的种类和性质、鉴定结果受固相载体和信号放大的影响。
5. 蛋白质组测序（Protein Sequencing）：通过将蛋白质的氨基酸序列解析出来来鉴定蛋白质。
- 优点：可以获得蛋白质的全序列。
- 缺点：需要大量的蛋白质样品、操作复杂、需要特殊设备。
蛋白质组学的研究方法和进展
蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质是细胞中最重要的一类生物大分子，不仅构成生物体的大部分物质，而且参与多种生物过程。
在生物学的研究中，蛋白质组学就是广泛用于研究蛋白质及其解析结构、功能和相互作用的一种技术。
蛋白质组学技术的不断发展，为科学家们提供了更广阔的研究领域和更深入的认识和理解。
一、蛋白质分离技术蛋白质在细胞中有着多种不同的类型和数量，分离这些蛋白质对于进一步的研究至关重要。
凝胶电泳是一种最早应用于蛋白质分离的技术，在这一技术中，蛋白质被分离到一条凝胶条中，并且能够根据其分子量进行鉴定。
近年来，液相色谱技术得到快速发展，以逆相高效液相色谱（RP-HPLC）为主的技术广泛应用于蛋白质的分离、富集和纯化中。
二、蛋白质鉴定技术现代蛋白质组学技术的特点是高通量、高分辨率、高灵敏度和准确率。
鉴定样品中的所有蛋白质非常复杂，多组学技术的整合在蛋白质组学的研究中显得尤为重要。
代表性的鉴定技术是质谱法，可将蛋白质析出后离线或在线进行鉴定。
其中，MALDI-TOF 质谱技术是蛋白质鉴定中的重要方法之一，该技术使用激光脱附离子化（MALDI）策略以减少化学修饰和分离过程对蛋白质结构的影响。
三、蛋白质表达技术从DNA转录到蛋白质翻译的过程，是生物体逐步实现功能的一个重要环节。
蛋白质表达技术是在外部体系中重现这一过程的有效方法，在研究中应用极为广泛。
常见的蛋白质表达系统有大肠杆菌、酵母、哺乳动物等，其中，大肠杆菌是最常用的单细胞表达体系。
近年来，蛋白质表达与修饰的转化药学已经成为一个热门领域，各种新型表达体系也层出不穷。
四、蛋白质数据分析鉴定蛋白质，只是蛋白质组学研究的第一步，有关数据分析和解释的关键环节，对于进一步的研究显得尤为重要。
目前，由于蛋白质比较庞大并且互相之间联系复杂，因此数据分析技术的不断发展就格外重要了。
从最初的数据搜索和标识，到后来的蛋白质序列分析、结构预测、功能预测和网络分析等，蛋白质数据分析技术已经成为蛋白质组学研究的重要环节。
蛋白质组学研究方法与实验方案
蛋白质组学研究方法与实验方案1. 蛋白质组学的神奇世界大家好，今天我们要聊聊蛋白质组学。
这是什么呢？简单来说，就是研究蛋白质这个小家伙的学问。
想象一下，蛋白质就像是一群勤奋的工人在身体里干活儿，它们负责各种任务，比如修复受伤的细胞、传递信息等。
了解这些“工人”的工作方式、合作模式，可以帮助我们更好地理解健康和疾病。
这就像揭开了一本厚重的百科全书的封面，里面充满了惊喜和知识的宝藏。
接下来，我们就来看看，怎么才能深入了解这些小家伙们呢？1.1 蛋白质组学的基本概念首先，我们得知道蛋白质组学是什么。
它是一门研究蛋白质全貌的学问。
也就是，不仅仅看单个蛋白质，而是把所有蛋白质都放在一个“大杂烩”里研究。
想象一下，你在一家大餐厅里，看到了一整桌丰盛的菜肴，这就是蛋白质组学的“全景图”。
我们不仅要知道每道菜是什么，还得了解这些菜肴如何搭配，如何一起让你胃口大开。
通过蛋白质组学，我们可以发现哪些蛋白质在特定的疾病中“捣乱”，哪些在健康状态下“勤勤恳恳”。
这就好比你在看一部精彩的电视剧，不只是盯着主角，而是要了解所有配角、剧情的每个细节。
1.2 蛋白质组学的研究方法那么，如何进行这些研究呢？首先，科学家们会用一种叫做“质谱分析”的技术。
这就像是给蛋白质做个超级详细的X光检查，能够精确地知道每个蛋白质的“身份信息”。
其次，还有一种叫做“二向色谱”的技术，它能帮忙把混乱的蛋白质样本整理成条理清晰的“小档案”。
这些技术就像是给你提供了一本超级强大的工具书，让你能一目了然地看到每个蛋白质的真实面貌。
2. 实验方案的细节了解了基本概念和方法，我们再来说说实验方案。
做蛋白质组学实验，就像是调制一道复杂的美食，需要准备许多食材，还要按照步骤来操作。
首先，你得从样本中提取蛋白质。
这一步就像是把食材从冰箱里拿出来，准备好各种配料。
接着，把这些蛋白质进行分离和鉴定。
这时，实验室里就变成了一个“厨房”，各种仪器和试剂就像是厨具和调料，为你制作出最精美的“蛋白质大餐”。
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• 使不同凝胶之间的点的分析和定量 更加精确
• 使不同凝胶之间的匹配更加可信
• 使实验间的误差与样品之间的差异 区分开来
分析说明： 1)在没有内标的情况下，我们通过AB两块胶的分析， 会得出结论： 图中红色圆环所标记的蛋白质点在处理 组(样品3和样品4)表达量增高； 2)通过内标的校正，我们可以证明，这实际上是由凝 胶之间的误差造成的，并不是样品之间的真实差异。
质谱仪的主要构成
3. 质谱分析鉴定
蛋白质组学中常用的质谱仪
• • • • ESI-三重四级杆 MS LC-ESI-MS/MS MADLI-TOF (/TOF) MS：价格便宜，应用最广泛 Orbitrap MS：新技术，更高的质量分辨率和质量精度
3. 质谱分析鉴定
质量指纹图谱
• 肽质量指纹图谱（PMF）：蛋白质被具有特异性切割位点的蛋白酶降解后产 生的多肽的质量通过MS进行测定得到MS图谱。由于每个蛋白质所含氨基酸序 列不同，因此其PMF也是独一无二的。 • MS/MS(串联质谱) 蛋白鉴定：在PMF基础上选择部分片段进行破碎并获得碎 片质量图谱与理论图谱进行比较实现蛋白匹配鉴定。
2. 蛋白质的分离
多维液相色谱
起始材料
• 亲和色谱（AC） • 离子交换色谱（IEC） • 反相高效液相色谱（RP-HPLC）
顺序使用基于不同物理化学分离原理的 多种色谱技术能够为复杂蛋白质或多肽混合
蛋白质的溶解 酶解消化 肽段混合物 亲和色谱富集（AC） 第一维：IEC 第二维：RP-HPLC ESI-MS ESI-MS/MS 收集 组分
2. 蛋白质的分离
感兴趣蛋白点的切取
• 灭菌的0.2 ml枪头前端剪去2cm 左右，用此枪头垂直戳向凝胶 上的蛋白点，旋转枪头直至将
胶点取下。注意避免污染。
2. 蛋白质的分离
双向凝胶电泳（2-DE）优缺点
优点：
• 分离能力高，技术比较成熟
• 可同时提供等电点和分子量信息
缺点：
• 不易获得低丰富度或者特殊（过酸、 过碱、难溶膜蛋白等）的蛋白
Tip：蛋白质组学是研究领域和方向 ，也是研究工具和策略
1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究思路
• 表达蛋白质组
• 功能蛋白质组
• 蛋白质与蛋白质的相互作用
• 结构蛋白质组
• 蛋白质组与基因组、转录组、糖组、代谢组间的相互关系
1. 蛋白质组学简介
蛋白质调控及功能实现的复杂性
DNA tRNA Ribosome mRNA Polypeptide
3. 质谱分析鉴定
数据库检索
• 检索工具软件： Mascot，Profound ，PeptIdent， PepSra等 • 数据库：NCBI、 SWISS-PROT、 UniProt、Integr 8 等
3. 质谱分析鉴定
数据获得
Thanks for your attention！
2. 蛋白质的分离
宽pH、窄pH 范围胶条
• 宽pH梯度胶条应用： 整个蛋白图谱 • 窄pH梯度胶条应用： 提高分辨率 增加样品上样量 检测分析更多蛋白
2. 蛋白质的分离
SDS-PAGE (SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
• 根据蛋白质的分子 量进行蛋白分离。 • 同普通SDS-PAGE 类似，只是一般在 垂直电泳系统中无 需浓缩胶。
渗透作用，因而可进行稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。
固相凝胶
丙烯酰胺缓冲液: CH2=CH-CO-NH-R, R ：羧基或叔胺基
2. 蛋白质的分离
不同pH和长度的IPG胶（以BIO-RAD的ReadyStrip™ IPG 胶条为例）
相对聚焦功率表示在使用不同长度或 pH 范围的 IPG 胶条时，在第一维中预期获得的增强的分辨率。 为 7 cm pH 3–10 IPG 胶条任意分配基线聚焦功率 1.0 以便计算其他胶条的相对聚焦功率
氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）反应实现连接。
• 最多可标记八种不同样品，蛋白覆盖率高，定量准确，可信度高，数据丰富。
2. 蛋白质的分离
iTRAQ标记试剂
2. 蛋白质的分离
iTRAQ标记定量原理
2. 蛋白质的分离
iTRAQ操作流程
2. 蛋白质的分离
iTRAQ技术特点
• 通量高：可一次实现最多8次样品的分离分析 • 重复性好且定量准确：所有样品的分离鉴定条件完全一致，保证了实验重
• 操作繁琐，难以实现自动化
2. 蛋白质的分离
荧光差异双向电泳(2D-DIGE)
• 在传统2-DE基础上引入三种荧光标记
(Cy2、Cy3和Cy5)分别对内标（各样品 的等量混合）和样品进行标记，实现不 同蛋白样品的同时分离、单独成像、提 高了重复性及结果的可靠性。
2. 蛋白质的分离
2D-DIGE中内标的重要性
物的分析提供足够分辨率，并能够直接同质
谱仪连用，实现样品制备分离到质谱鉴定的 自动化。或者色谱技术与2-DE结合使用。
2. 蛋白质的分离
iTRAQ标记定量技术
• iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation,同位素标记相对与
绝对定量技术）技术是由ABI公司于2004年开发，其标签试剂可与氨基（包括
Protein
1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究特点
1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究内容
1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究常用技术
2. 蛋白质的分离
蛋白质的分离策略
2. 蛋白质的分离
总蛋白质的提取（植物）
• • • • • • • • • 三氯乙酸（TCA）-丙酮法 苯酚法 裂解液法 尿素/硫脲法 KCl-醋酸铵甲醇法 改良丙酮沉降法 硫酸铵沉降法 直接提取法等 ……
蛋白质组学研究方法
XXXX 2015-11-27
概 要 1. 蛋白质组学简介 2. 蛋白质的分离 3. 质谱分析鉴定
1. 蛋白质组学简介
组学时代（Age of omics）
1. 蛋白质组学简介
从基因是蛋白质组（学）？
• 蛋白质组(proteome = protein + genome)：一种细胞、组织或生物体所表 达的全套蛋白质，具整体性和动态性。 • 蛋白质组学(proteomics) ：研究细胞组织或生物体蛋白质组成及其变化 规律的科学。
3. 质谱分析鉴定
基于质量指纹图谱鉴定蛋白质
• 通过将实验测得的质量图谱在蛋白质数据库中检索，寻找具有相似 肽谱的蛋白质。
3. 质谱分析鉴定
数据库检索
• 检索工具软件： Mascot，Profound ，PeptIdent， PepSra等 • 数据库：NCBI、 SWISS-PROT、 UniProt、Integr 8 等
• 荧光染色：SYPRO染料，与银染相比灵敏度相当，操作简便；但价格昂贵。
2. 蛋白质的分离
电泳图谱分析
典型流程
• • • • • • • 凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立
常用软件
• PDQuest • ImageMaster 2D Elite (MelanieTM)
2. 蛋白质的分离
2-DE实验操作
2. 蛋白质的分离
蛋白质检测
适用于质谱的染色方法
• 考马斯亮兰染色 ：灵敏度为10-30 ng，所需试剂少，操作简便，无毒性，染
色后背景及对比度好，与下游质谱兼容，线性程度好。
• 银染：灵敏度为200pg，但其线性很差。普通银染过程中因醛类的特异反应，
而与下游质谱不兼容。
2. 蛋白质的分离
等电聚焦（Isoelectric focusing, IEF）
• 原理：根据蛋白质的等电点进行蛋白分离
2. 蛋白质的分离
固相pH梯度(Immobilized pH gradiet, IPG)胶
• 在IPG胶中，丙烯酰胺缓冲液通过乙烯键共价聚合至固体凝胶聚丙
烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电
复性，同时增强定量的准确性
• 分辨率高：可与最高分辨率的LC-MSMS技术结合，实现对低丰度蛋白的定
量定性
• 数据丰富：可以获得检测到的所有蛋白的定性和定量信息 • 自动化程度高：以高分辨率液质联用为基础，自动化操作，分析速度快
3. 质谱分析鉴定
质谱（MS）鉴定
• 质谱仪：能够测量真空中离子的质荷比（m/z）的仪器 • 根据m/z可以准确确定待测样品的分子质量，从而确定其分子组成