酶的分离纯化
酶的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
酶的分离纯化
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五、抗体酶
五、抗体酶 （abzyme） ） 抗体酶本质上是免疫球蛋白， 抗体酶本质上是免疫球蛋白，但在易变区被赋予了 免疫球蛋白 酶的属性，所以又称“催化性抗体” 酶的属性，所以又称“催化性抗体”（catalytic antibody）。 ）。 抗原： 抗原：
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二、调节酶
• 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 • 调节酶分子中有活性区和调节区，其催化活力 调节酶分子中有活性区 调节区， 活性区和
可因与调节剂的结合而改变， 可因与调节剂的结合而改变，有调节代谢反应 的功能。 的功能。
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三、酶的纯度鉴定
酶产品质量评价中常使用比活力， 酶产品质量评价中常使用比活力， 比活力越高，纯度越高。 比活力越高，纯度越高。
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第七节 一些酶的名称及概念介绍
寡聚酶( ) 一 寡聚酶(oligoenzyme)
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 非催化部位 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 进而改变酶的活性状态， 进而改变酶的活性状态，这种现象称为别 构调节作用。 构调节作用。
别构激活作用 别构抑制作用
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三、同工酶
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酶的分离纯化讲解
第二节分离纯化步骤及方法
一、步骤
发酵产品
1、酶的提取
固液分离，破碎，抽 提，浓缩
2、初分离
3、 纯化
精制品
4结晶
保藏
酶分离纯化总体步骤
1、酶液的提取
（1）发酵液的固液分离 （2）细胞破碎
（1）发酵液的固液分离
❖ 常用的分离方法有离心和过滤。 ➢ 离心分离速度快，效率高，操作时卫生条件
转筒真空过滤器
II
1 2
4 III
6 7
5
3
a.转动盘
b.固定盘
I
1－转筒；2－滤饼；3－割刀；4－分配头；5－吸走滤液的真空凹槽； 6－吸走洗水的真空凹槽；7－通入压缩空气的凹槽I－过滤区； II－洗涤脱水区；III－卸渣区
（2）细胞破碎
❖ 按微生物细胞酶的分布分为三类 ❖ 细胞破碎是指通过物理、化学或生物的方法，
❖ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打 碎，然后再用10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织 的细胞打碎。
物理破碎
通过各种物理因素 的作用，使组织、 细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
冻结-融化法 压榨法 渗透压法 超声波破碎法
纯度要求 极高纯度（>99%）
高纯度（95%-99%）
一般纯度（<95%）
用途 医疗用途
理化性质研究
生产抗原
2、明确目标蛋白与主要杂质的性质
❖ 检测目标酶蛋白稳定条件，至少检测pH 值和离子强度两个条件。
❖ 了解目标酶和杂质的性质：分子大小、 等电点、溶解度等。
酶的分离纯化及活性测定
第五节酶的分离、纯化及活性测定1一、酶的分离、纯化•:一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用胞外酶生然后分到行作的酶，这类酶大多都是水解酶类。
•胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用的，这类酶数量较多。
的多2一般原则：般原则：防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中避免剧烈搅拌 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈的烈”的手段。
3酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。
在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一第，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)。
4基本操作程序微生物、动物、选材植物加入提取液抽提胞内酶先破碎抽提先净化处理再沉淀法分离离子交析分离纯化换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等5（一）酶的抽提（）酶的抽提1、破碎细胞对于细胞外酶可用水缓冲液浸泡过对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得粗抽提液。
对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎，通常用匀浆器捣碎机，制成较易破碎，通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提液。
细菌细胞壁较厚，需用超声波、溶胞壁较声溶菌酶等抽提。
酶等提62、酶的抽提酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。
抽提条件：提出来抽提条件⑴抽提溶的pH选择应该在酶的pH稳定，并离范围之内，并且最好远离等电点。
低温下抽提⑵低温下抽提（0～40C）7（二）酶的纯化（）酶的纯化抽提液中除含有所需有酶外，还含有其它大抽提液中除含有所需有酶外还含有其它大分子物质。
常用分离纯化的方法：①溶解度②电荷性质③大小或质量④亲和部位。
分离纯化一种酶的方法
分离纯化一种酶的方法分离纯化一种酶是生物工程领域的一个重要研究课题，有多种方法可以用来实现这一目标。
下面将介绍几种常用的分离纯化酶的方法。
1.固定相吸附色谱法固定相吸附色谱法是最常用的酶纯化方法之一。
在这种方法中，通过对酶进行吸附，然后使用缓冲溶液洗脱的方式分离纯化酶。
为了实现这一目标，可以选择一种适合酶吸附的固定相，例如亲和树脂、离子交换树脂或凝胶等。
通过在不同的条件下洗脱，可以逐步去除非目标蛋白质，最终得到纯化的酶。
2.亲和层析法亲和层析法是常用的可以选择性地与酶相互作用的方法。
在亲和层析法中，可以通过与酶相互作用的特定亲和剂将酶从复杂混合物中分离出来。
例如，可以根据酶与金属离子的亲和性，使用金属离子柱进行层析。
亲和层析法通常需要先对亲和剂进行固定，然后通过加载样品和适当的洗脱剂来纯化酶。
3.凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于酶的大小差异来分离纯化的方法。
这是一种较为简单的方法，适用于分离不同分子量的酶。
在凝胶过滤法中，通过将混合物通过一系列的凝胶分离层来分离不同大小的分子。
酶分子会在凝胶中被阻止，而较小的分子可以通过凝胶透析孔隙。
通过控制凝胶的孔隙大小，可以选择性地纯化酶。
4.电泳法电泳法是一种常用的酶分离纯化方法，尤其适用于具有不同电荷的酶。
在电泳法中，通过在电场中施加电压，根据不同酶的迁移速度将酶分离出来。
根据酶的等电点和电荷性质，可以选择凝胶电泳或者等电聚焦电泳来分离纯化酶。
电泳法的一个重要应用是SDS-PAGE，它从凝胶中获得酶的纯化和分析。
5.超滤法超滤法是一种可以根据酶的分子量选择性地分离纯化酶的方法。
在超滤法中，通过将混合物通过一系列合适孔径的滤膜，可以将酶与其他较小分子分离开来。
较大分子（包括酶）会被限制在滤膜上方，而较小分子则可以通过滤膜，从而实现分离纯化酶的目的。
综上所述，分离纯化酶的方法有很多种。
选择适用的方法取决于酶的性质、目标和需求。
常用的方法包括固定相吸附色谱法、亲和层析法、凝胶过滤法、电泳法和超滤法。
酶的分离纯化
超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法
亲和层析、亲和电泳
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
(25℃)
当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素
（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。
（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。
酶分离纯化的步骤主要原理
酶分离纯化的步骤主要原理
酶的纯化和分离是通过一系列步骤实现的，其主要原理包括以下几点：
1. 细胞破碎：首先需要将含有酶的细胞破碎，以释放酶分子。
这可以通过物理方法（如超声波或搅拌）或化学方法（如溶解细胞膜）实现。
2. 酶的特异性沉淀：根据酶的特性和条件，选择适当的方法使酶与其他杂质分子分离。
常用的方法包括沉淀、沉降和离心。
例如，可以通过加入特定的沉淀剂或改变pH值来使酶沉淀，从而将其与其他溶液中的物质分离。
3. 过滤和超滤：利用不同孔径的滤膜，可以通过过滤和超滤方法去除较大分子，如蛋白质碎片和细胞残渣。
4. 离子交换层析：离子交换层析是利用酶与离子交换树脂之间的相互作用进行分离的方法。
树脂上的离子可吸附酶，而其他杂质则被洗脱。
5. 亲和层析：亲和层析是通过酶与特定配体之间的亲和力实现分离的方法。
配体可以是酶的底物、抗体或其他具有与酶特异性结合的小分子。
酶与配体结合后，可以用洗脱剂将酶从亲和层析柱上洗脱。
6. 凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是根据酶的分子大小和形状实现分离的方法。
通过选择合适孔径的凝胶、调节操作条件，可以将酶与其他分子分开。
7. 高效液相层析：高效液相层析（HPLC）是一种高效的液相分离技术。
通过调节流动相和固定相的性质，利用酶与固定相之间的相互作用进行分离。
8. 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法，通过电泳平台上的电场作用下，根据酶的电荷、形状和大小进行分离。
以上步骤和原理可以根据酶的特性和所需纯度的要求进行组合和调整，以实现酶的有效纯化和分离。
第4章 酶的分离与纯化
equilibrium centrifugation）。
根据颗粒的密度不同而进行分离。
离心时，在离心介质的密度梯度范围内，
不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂
浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成
区带。
常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。
特点：
•介质的密度梯度范围包括所有待分离 物质的密度。 •适于分离沉降系数相近，但密度不同 的物质。
细胞粉碎机
匀浆机
（三）细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的细胞数：
破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；
破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。
2.测定导电率：
利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量， 估算破碎率。
三、酶的提取(extraction)
物理破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。 化学试剂可以改变细胞壁 或细胞膜的通透性，而使 细胞内物质有选择性的渗 透出来 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
化学破碎
酶促破碎
高 压 细 胞 破 碎 机
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质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出。
• 浓缩作用
• 纯化作用
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：
⑴中性盐沉淀（盐析法）
⑵有机溶剂沉淀
⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）
⑷等电点沉淀
⑸有机聚合物沉淀
（一）盐析沉淀法（改变离子强度）
1. 基本原理（盐溶和盐析）
向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可
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2 建立一个可靠和快速的测活方法 方法专一、灵敏、精确、简便、经济 3. 酶原料的选择 选择目的酶含量丰富的原料，且考虑原料 的来源、取材方便、经济等因素。 4. 酶的提取
5. 酶的提纯
产率=(目的酶的总活力/粗抽提液中目的酶总活 力)*100% 反映提纯过程酶活力的损失情况
提纯倍数=目的酶的比活力/粗抽提液中目的酶比 活力 提纯方法的效率
选择性热变性 选择性酸碱变性 选择性表面变性
5）特殊基团差异: 亲和层析
有的方法是建立在上述二个功能同时起作用。
第三节
方法 盐析 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 复合沉淀
沉淀分离
改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出
原理 不同蛋白质在不同盐浓度溶液中溶解度不同 两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性 电解质有不同的等电点 酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀 下来
葡聚糖凝胶
聚丙烯酰胺凝胶
五、离子交换层析
重要而广泛应用的层析方法。离子交换剂为固定 相，液体为流动相的系统 基本原理：
离子交换剂在水中呈不溶解状态，能释放出反离子，同时 与溶液中的其它离子或离子化合物相互结合，结合后本身 理化性质保持不变
1.基本原理
纤维素－O－CH2－COO- ---Na+
1. 动、植物材料
绞肉机切碎，高速组织捣碎机，加砂研磨
2. 微生物材料
霉菌材料比较容易，可通过机械剪切、研磨或加细胞壁溶 解酶解决。 细菌，少量材料常用超声波破碎器和溶菌酶等处理；大量 材料通常采用丙酮干粉法，或采用自溶法。 酵母细胞壁厚较难对付，过去多用自溶法，现在可采用的 办法有： (1)细胞壁溶解酶处理法； (2)盐振荡法； (3)冷热破壁法。
1.3 基本原理
1.4 分类
按流动相分类，有液相层析和气相层析； 按固定相的形式分类，有柱层析、薄层层析等 按分离过程物理化学原理：分配、吸附。
层析分离方法
层析方法 分离依据
吸附层析
分配层析 离子交换层 析
吸附剂对不同物质的吸附力不同
各组分在两相中的分配系数不同 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团） 对各种离子的结合力不同
凝胶层析
亲和层析 层析聚焦
利用流动相中各种组分的相对分子质量不同
利用生物分子与配基之间的专一而又可逆的亲 和力不同 两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性 结合在一起
二、吸附层析
利用吸附剂对不同物质的吸 附力不同，是应用最早的层 析技术。
三、分配层析：各组分在两相中的分配系数不同 分配系数：溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到 平衡时，该溶质在两种溶剂中的浓度的比值。 纸上层析 分配薄层层析 分配气相层析
物理破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 自溶法 外加酶制剂法
化学破碎
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
需要考虑的因素
1.
pH 不应超出酶的稳定范围； 远离待抽提酶的等电点。 兼顾到有利于切断酶和细胞内其它成分间 可能的联系，从这点考虑以选用pH4—6 为佳。
2. 盐 大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解 度，所以抽提液一般采用等渗盐溶液。 最普通的加0.020—0.050M的磷酸缓冲液、 0.15MNaCl等。 少数情况用水抽提效果亦佳. 3. 其它 在破细胞后，某些亚细胞结构也往往受到损伤， 这样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。为 此，有时还需要在抽提液中加入某些物质。
总体积 蛋白浓 蛋白总 (ml ) 度 量 (mg/ml) (mg) 粗无细胞 1000 抽提液 硫酸铵分 级 凝胶层析 离子交换 层析 250 25 5 12 12000
酶浓 比活力 度 (u/mg蛋 (u/ml) 白) 5 0.416
产率 总活 力 (%) (u) 5000 100
提纯 倍数
将这类配基偶联固定于样品中，能迅速而有选择性地将相 应的酶分子从溶液中分离出来。
常用的亲和介质及专一性配体
根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：
共价亲和层析 疏水层析
一、生物 材料的 破碎
细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
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细胞粉碎机
高 压 细 胞 破 碎 机
1）机械破碎 2）物理破碎
细 胞 破 碎 珠
3）化学破碎
4）酶解破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
细胞破碎方法及其原理
机械破碎 通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。 捣碎法 研磨法 匀浆法
二、抽提
细胞破碎后，可采用两种方式进行抽提：
抽提条件的选择：
普遍抽提和先后用不同溶剂进行选择性抽提。
一般用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。
酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 使用的溶剂或溶液 0.02～0.5mol/L的盐溶 液 提取对象 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶
酸溶液提取
就阳离子来说，一价盐通常比二价盐有效； 阴离子则相反，二价盐比一价盐好。 符合这种条件的盐有硫酸铵、硫酸钠等。 硫酸铵最常用。
硫酸铵沉淀优点
溶解度大，溶解的温度系数小(0℃，706克 ／升；25℃，767克／升) ；
稳定性好，高浓度低温对蛋白构象有稳定 作用； 低格低廉，可大量使用。
饱和度调整
二、酶纯化过程的三个ຫໍສະໝຸດ 段 粗蛋白(crude protein)
采样 破细胞 提取全部蛋白，多用盐析沉淀法。
部分纯化(partially purified) 初步的纯化，使用
各种柱层析法。
均质纯化(homogeneous) 目的酶的进一步精制，
可用制备式电泳或HPLC。
第二节 破碎与提取
常用的有：纤维素离子交换剂、交联葡聚糖离子交换剂、 琼脂糖离子交换剂。
离子交换剂的选择依据
首先是待分离酶(或蛋白)的稳定性 酶在低于其 pI 的 pH 条件下稳定，可选....... 在相同的条件下，pI>pH 时，pI 越高，越容易 被......
运用
酶在低于其pI的pH条件下稳定，可选....... 在相同的条件下，pI>pH时，pI越高，越容 易被...... 试设计利用离子交换剂分离一种含等电点 分别为 4.0、6.0、7.5 和 9.0 的蛋白质混合液 的方案，并简述理由。
选择性变性沉淀 选择一定条件使某些杂质变性沉淀，而不影响所需酶
1.盐析法
是古老的、也是目前仍广泛采用的方法。
根据酶和杂蛋白在高的盐浓度溶液中溶解度的差 别而建立的一种纯化方法。
1) 盐析法的原理：
2) 产生盐析作用的原因
等电点与环境 pH 的关系
提高盐浓度增加蛋白质的溶解度----盐溶
对酶容易引起变性失活，对温度要求严格
其它沉淀方法
3 4 5
共沉淀法 等电点沉淀法 选择性沉淀法
第四节 层析分离
一、概述
1.1 定义
混合物中各组分的物理化学性质不同，当流动相流经 固定相时，各组分的移动速度不同，从而使不同的组 分分离纯化
1.2 发展
纸层析 薄层层析
柱层析 样品容量不断增大
有机溶剂沉淀法应考虑的因素
(1)温度
操作控制在 0℃ 以下，有机溶剂预先冷却到 -15—-20℃。
(2)pH
尽可能靠近待纯化酶的等电点 pH
(3)离子强度
添加适量的中性盐，如5—10％的硫酸铵，有助于提高分离效果
(4)有机溶剂
丙酮的分离效果最好，乙醇和甲醇等也常用。
优缺点
分辨率高于盐析法，不用脱盐
碱溶液提取
PH2～6的水溶液
PH8～12的水溶液
用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且稳定性较好的酶
用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶 用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶
有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂
大多数蛋白类酶都溶于水，而 且在低浓度的盐存在的条件下， 酶的溶解度随盐浓度的升高而 增加，这称为盐溶现象。
1.0
3 9 7
750
11 83 364
3.67
2730
55
8.83
6.酶的纯度检验
当把酶提纯到一恒定的比活时，即可认为 酶已纯化，仍需电泳、层析、离心等方法 对纯化的酶进行纯度检验。
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存 离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
4. 抽提液的用量： 通常采用原料量的l—5倍，有时为了抽提效 果好些，要反复抽提，液量可能大些。 5. 固体成份除去： 抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成份多 可用离心法或压滤法除去。
纯化方法的选择
1. 为了获得理想的分离效果应注意：
工作前应对所要纯化的酶的理化性质(溶解度、分 子大小和解离特性)以及酶的稳定性等有一个较全 面的了解。 判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力 测定为准则。 要严格控制操作条件，防止变性。
第三章 酶的分离纯化