大鼠皮层神经元细胞原代培养
大鼠视网膜神经细胞的原代培养(译文)
大鼠视网膜神经细胞的原代培养摘要目的:在前人建立的方法上优化SD 大鼠视网膜神经细胞体外培养的技术和方法，为后续研究提供实验基础。
方法:使用胰酶消化法分离新生1 ～ 3d SD 大鼠视网膜神经细胞，以DMEM/F12 为培养基体外培养，免疫组织化学染色的方法进行鉴定。
结果:观察光镜下培养的细胞贴壁生长，部分细胞伸出突起，且有些突起相互连接。
免疫细胞化学染色显示，培养的细胞大多数抗神经元特异性烯醇化酶(NSE) 抗体反应阳性。
结论:视网膜神经细胞体外培养成功为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。
关键词:细胞培养; 视网膜神经元; 胰蛋白酶消化法; 神经元特异性烯醇化酶引言一个世纪前，从青蛙身上剥离的神经管片段仍能在生理液中维持几天的活性，使得越来越多的神经纤维得到的实时观测以来，体外培养技术已经广泛的应用于生物技术领域。
【1】在没有了完整动物的复杂性，体外培养的方法可以大大提高对视网膜的基本属性和环境的适应性的了解。
在体外系统中，这个界定的实验条件可以很容易设定和维持。
这提供了一个稳定的辅助药理学和分子操纵的平衡，同时保持了完整的组织复杂表型特征。
在这里我们根据一些成功方法报告探讨一下大鼠视网膜神经细胞的原代培养技术。
【2-3】材料与方法动物：实验中使用的所有SD大鼠幼崽均是从青岛实验动物中心根据眼科和视觉研究中动物的ARVO声明，同时保留了出生后1-3SD大鼠的相对温度和湿度条件下获得的SD大鼠幼崽材料：DMEM/F12培养液和胎牛血清购自Gibco公司（美国），兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体，兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体，羊抗兔IgG 和HRP-链霉亲和素购自中山Goldbridge生物技术有限公司（北京，中国）。
所有其他试剂均为Sigma公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。
方法：预涂层的聚-D-赖氨酸组织培养皿为了使视网膜神经细胞，紧贴组织培养皿，聚-D-赖氨酸添加到被预先放置盖玻片的24孔板的孔中。
大鼠脊髓神经元的原代无血清培养及鉴定
但 由于血清成分复杂 ， 在许 多未知 因素 ， 存 有时会干扰 实验 结
果， 掩盖培养细胞潜在 的生 理功能 。无血 清培养 的细胞活 性 及生理 特性保持 良好 ， 具有较 大 的优 越性 。本课题 组为 了研 究药物对脊髓 损 伤的保 护作 用 ， 无血 清培 养方 法 ， 用 建立 了 Ｗｉａ 大 鼠胎 鼠的脊髓神 经元体 外分散培 养模型 ， ｓｒ ｔ 并对其 进 行 了形 态学 观察 ， 为今后的相关研 究奠定了基础 。
长 良好 ， ７天神经元纯度达 ９ ％ 以上 。结论 第 ５ 机械 分离无 血清培养神经元的方法具 有简便 可行 ， 结果稳定的优点 ， 可作
ｍ ｎ 吸除消化 液 ， ｉ， 用含血清的培养基终止 消化 ， 加完全培养基
反复吹打制成单 细胞悬液 。２０ 目不锈 钢筛 网过滤 ， 细胞 ０ 使 充分分离 。取 １ ｌ ０ 细胞悬 液与 等量 ４ ％台盼蓝 ｝ 匀后 计数 昆 活细胞数 ， 调整 细胞密度至 ４×１ ・ ～， ０ Ｌ 接种于涂 有多聚赖 氨 酸的 ２ ４孔培养板 ， 每孔加 ５ ｌ ０ 细胞悬液 ， 再分别加 ４ ０ ５ ｌ 完全培养基 ， 细胞接 种密 度为 ４×１ ・Ｌ 使 ０ ～。培养板 置恒 温培养箱 中 ３ ℃ ，％ Ｃ ： 饱和 湿度 条 件下 进行 开 放培 养。 ７ ５ Ｏ， ２ 后 ， ４ｈ 全量换 １ Ｔ ％ＩＳ的无血清培养液 。以后每隔 ２— ３ｄ进 行 １２量换液。选取不同时间点神经元在相差显微镜下观察 ／ 其形态 变化并进行显微摄影 。 １ ４ 免疫组化 染色 ． 培养至第 ７天的细胞 ， 进行神经元 特异
圆形 ， 体积小 ， 透亮 ， 无突起。在培养 １ ２～２ ４ｈ后观察可 见大
部分细胞贴 壁 ， 形态变得扁平 ， 胞体呈椭 圆形 ， 围出现光晕 ， 周
神经元细胞培养
神经元细胞培养1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。
2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。
3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。
4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。
重复上述步骤2～3 次。
5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。
6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。
7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。
(1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。
（+0.5mmol/L谷氨酰胺）鉴定1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常明显。
2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。
这就更能支持2的阳性表达了。
4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！错误之处还请赐教！TUJ1。
原代培养
原代细胞培养步骤(1)、取新生SD大鼠3只，入75%酒精消毒2分钟，断颈取脑。
(2)、将新生鼠脑放入盛有冷的D’Hanks平衡盐溶液的玻璃培养皿内，置冰盘上，于解剖显微镜下仔细剥除脑膜(3)、将分离的海马组织放入另一个盛有冷的D’Hanks溶液的玻璃培养皿内，用眼科剪剪成小碎片，并移入15(4)、向离心管中加入37℃ 0.25%胰酶溶液，每6个海马组织加1ml胰酶消化液，放入37℃培养箱中孵育10-1即可。
900rpm离心2min。
(5)、吸除胰酶消化液，加入等量的37℃种植液以终止消化，置室温10min。
、加入2ml种植液，以抛光的滴管吹打约15次，分散细胞，静置10min（如仍有组织块，应用200目筛网(7)、调整细胞密度，以90-320/mm2的密度种于六孔板内。
置37℃ 5%CO2培养箱中培养。
、24h后全部吸除种植液，更换成Neurobasal + 2% B27培养液培养。
此后每周以此液半量换液2次。
培养8-10天进行下一步实验。
投票1收藏1实验已经开始了，遇到了其他一些新的问题，但在此我想说说我取新生大鼠海马的体会：象有战友说的那样，我刚开始也是成年大鼠上练习的，一切都还比较顺利，但是要取新生1天的大鼠海马是否要困难的多，主要是由于脑组织太嫩了，稍不注意就化成泥了。
1.冻僵老鼠后，用酒精浸泡消毒，然后用PBS液清洗一下，剪下鼠脑。
2.游离脑部皮肤，用眼科剪经枕骨大孔沿矢状缝剪开颅骨，轻轻游离颅骨和脑组织后，在顶骨和顶间骨之间向左右剪开，然后剪掉颅骨，尽可能往两侧剪，使脑组织充分暴露，以便下一步剥离脑皮质和游离海马。
3.用眼科剪分别两侧在大脑皮质中间横向剪开，深约1mm，然后将整个脑置于装有PBS液的培养皿中，要使液体没过脑组织。
用刮针（用缝衣服的针插在一次性筷子里自制的，用针鼻儿那头）沿着刚才的切口轻轻的向后刮除皮质，切忌过深，完全显露出海马后，从两侧游离，使其漂浮于液体中，然后用牙刮匙从连接处将整个海马从脑中分离出来。
原代神经元培养培训课件
精品文档神经细胞原代培养的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在从动物（大鼠或小鼠等）培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等℃烘干，各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，60用酒精棉球擦拭后晾干，或经以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－小时以上消毒。
80％酒精浸泡1 器皿：1) 2) 3)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
5)培养瓶、盖玻片次，盐酸浸泡可用0.2N10分钟，用蒸馏水洗2培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，分钟，10分钟，再用双蒸水洗2次，每次1010每次分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
6)7)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
8)。
孔）、、、塑料培养板（35mm9)塑料培养皿（）62496精品文档．精品文档辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制多7-1400001) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为0.1mg/ml，浓度为。
聚赖氨酸（Poly-L-lysineNaCl主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于2) 平衡盐溶液：的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培3)无血清培养液。
养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27℃564) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需。
灭活30分钟）胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补5) 冻℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml水至2.5%浓度，振荡摇匀，4。
无血清培养条件下神经元前体细胞的增殖
摘要 目的 ： 建立新生 大鼠大脑皮层细胞原代培养 体系并进行神经元前体细胞 的增殖研 究 。方 法： 原代混合 培养新生 大 鼠 大脑皮层细胞 ； 混合培养体 系用血清培养基培养 ６ ｄ后换用无 血清培养基 培养 ， 免疫细胞 化学显色 鉴定此培 养过程 中不 同 时间点 的细胞类 型 ， 并存不 同时间段 加入 Ｂ ｄ 用 于分 析神经元 前体 细胞 的增 殖状况 。结果 ： ｒＵ， 换用无 血清培 养基 培养后 ， ｍ现明显的细胞 分层现象 ； 神经元及 其前体细胞 的比例逐渐 上升 ， 而神经 干细胞 和星形 胶质 细胞 的比例缓慢 下降 ； 增殖 细
６ｄｙ．Ｉ ａ ｓ ｍｍｕ ｏ ｌ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｓａ ｎ ｎ ｓｕ ｅ ｏ ｃ ａ ａ ｔ ｒｚ ｈ ｘ ｄ ｃ ｌｕ ｅ ｔｄ ｆｅ ｅ ｔｔ ｏｎ ｓ ｎ ｆ ｒ ｓ ｅ ｃ ｔ ｉｉ ｇ ｗａ ｓ ｄ ｔ ｈ ｒ ｃ ｅ ｉｅ ｔ ｅ ｍｉ ｅ ｕ ｔ ｒ ｓａ ｉ ｒ ｎ ｉ ｐ ｉ ｔ ；Ｂｒ Ｕ ｓ ｕ ｅ ｏ ｕ ｆ ｍｅ ｄ ｗａ ｓ ｄ ｔ
ｔｘ ｏ ｅ ｏ ｎＳ ｒｔ ；Ｐｒ ｒｔ ｅｎ ｕｔ ｒｄ ｉ ｅｕ ｆｅ ｄｕ ，ｔ ｅｍｉｅ ｅｌ ｗｅｅｍａｎ ａｎ ｄｉ ｅ ｕ ｍｅ ｉｍ ｏ ｅ ｆｎ ｗｂ ｒ Ｄ ａｓ ｉ ｏｂ ｉｇｃ ｌ ｅ ｎｓ ｒ ｍ－ｒ ｅｍｅ ｉｍ ｏ ｕ ｈ ｘ ｄｃ ｌ ｒ ｉｔｉｅ ｓｒ ｍ ｄｕ ｆ ｒ ｓ ｎ
Ｐｒ ｌｆ ｒ ｔｏ ｆ ｎ ｕ ｏ ｌｐ ｅ ｕ ｓ ｒ ｃ ｌｓ ｉ ｅ ｕ ｆ ｅ ｕ ｔ ｒ ｏ ｉｅ ａ ｉ ｎ ｏ ｅ ｒ ｎａ ｒ ｃ ｒ ｏ ｅｌ ｎ ｓ ｒ ｍ－ ｒ ｅ ｃ ｌｕ ｅ
Ｚ ｏ ｕ ｓ ｎ ，Ｄｏ ｇ Ｙｕ ｈ ｉ ｏ ｇ Ｘｕ ｈ ｉ ｎＬｉｎ，Ｚ ａ ｇ Ｈｕ ｎ ｉｎ Ａ ｈ ｕＪ ｎ ｏ ｇ ｎ ｎ ａ，Ｓ ｎ ｅ ｕ ，Ｘｉ ａ ｈ ｎ ａ ｘａ ｇ
莫诺苷对大鼠原代皮层神经元氧糖剥夺模型线粒体质量控制体系的影响
网络出版时间：２０２０－９－８１５：１２ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２００９０８．１４０８．０１６．ｈｔｍｌ莫诺苷对大鼠原代皮层神经元氧糖剥夺模型线粒体质量控制体系的影响王明洋，牛红妹，张 丽，李雅莉，李 林，张 兰（首都医科大学宣武医院药学部；北京市神经药物工程技术研究中心；北京脑重大疾病研究院；神经变性病教育部重点实验室，北京 １０００５３）收稿日期：２０２０－０４－１５，修回日期：２０２０－０６－１０基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１６７３４０６，８１８７４３５１）；国家重大新药创制专项（Ｎｏ２０１５ＺＸ０９１０１ ０１６）；北京市博士后科研基金资助项目（Ｎｏ２０１８ ＺＺ １１２）；北京市医院管理中心登峰人才计划（ＮｏＤＦＬ２０１９０８０３）作者简介：王明洋（１９９０－），女，博士，研究方向：神经精神药理学，Ｅ ｍａｉｌ：ｗａｎｇｍｉｎｇｙａｎｇ０２０６＠１６３．ｃｏｍ；李 林（１９５３－），女，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药神经药理，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｌｉｎｌｉｘｗ＠１２６．ｃｏｍ；张 兰（１９７２－），女，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药神经药理、临床药学，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｌａｎｉｚｈｇ＠１２６．ｃｏｍｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２０．０９．００８文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２０）０９－１２２１－０７中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８４．１；Ｒ３２２，８１；Ｒ３２９．２４；Ｒ７４３．３１；Ｒ８５２．１５摘要：目的 观察莫诺苷对氧糖剥夺（ｏｘｙｇｅｎ ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａ ｔｉｏｎ，ＯＧＤ）刺激后大鼠原代皮层神经元损伤的保护作用，基于线粒体质量控制体系（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌ，ＭＱＣ）理论探讨莫诺苷抵抗ＯＧＤ损伤的作用机制。
神经元原代培养
神经元原代培养一、准备1. 试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。
选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。
对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。
将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。
灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。
2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红：0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。
3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200µl或400µl/tube分装, -20度储存。
母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。
配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。
用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。
4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50µl/tube，-20℃保存。
使用时需将终浓度调整为25µM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。
配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。
例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。
5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。
6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。
原代神经元细胞培养技巧
原代神经元细胞培养技巧
以下是 9 条关于原代神经元细胞培养技巧：
1. 哎呀呀，培养原代神经元细胞，那选对材料可太重要啦！就好比你要做一道美味佳肴，那食材得新鲜优质对吧？比如你得挑健康的胚胎组织，可别随便拿些不靠谱的材料来凑数呀！
2. 嘿，解离细胞这一步可得小心谨慎哦！这就像拆一件精密的玩具，不能太粗鲁，不然全给弄坏啦！要温柔地进行操作呢。
3. 哇塞，接种细胞时可得仔细着点儿！就像给小宝贝们找个舒服的家，密度要合适，位置要恰当，不能马马虎虎哟！
4. 知道吗，培养基那可是细胞的营养大餐呀！怎能随随便便选呢？一定要找最适合它们的，不然它们怎么茁壮成长呢？就像给孩子选奶粉一样重要呐！
5. 天呐，培养环境那简直就是细胞的小天地！温度、湿度、气体都得严格把控，这可不是闹着玩的呢，你说是不是？
6. 哇哦，换液的时候可得注意啦！你想呀，如果给它们换了不好的液体，那不就像给人喝了不健康的水一样嘛，能行么？
7. 诶，观察细胞可不能马虎呀！那可是随时了解它们状态的关键呀，这就好比你时刻关注着自己宝贝的一举一动，有没有问题一下子就知道啦！
8. 哎呀，防止污染那可是重中之重啊！稍微不注意让细菌病毒钻了空子，那不就全完啦？这可不比家里打扫卫生，得超级认真呀！
9. 总之呢，培养原代神经元细胞真的需要特别细心和耐心！每一个环节都不能掉以轻心，都要像对待艺术品一样精心呵护，这样才能培养出健康优秀的细胞呀！。
原代海马及皮质神经元培养方法
原代海马及皮质神经元培养方法海马和皮质神经元是神经系统的重要组成部分，在研究神经生物学和药物疗效等方面具有重要价值。
为了研究这些神经元的生理特性和功能，我们常常需要从动物体内分离和培养这些神经元。
以下是针对原代海马和皮质神经元的培养方法。
1.实验动物准备：首先，需要准备实验所需的动物。
一般情况下，小鼠是最常用的实验动物。
在实验进行前，需要确保动物符合实验伦理和动物保护要求，并获得相应的实验动物使用许可。
2.动物脑组织的获取：在实验动物处死后，需要尽快取出脑组织。
使用无菌技术将大脑取出，并将其放入生理盐水或培养基中。
3.脑组织的分离和消化：将脑组织放入含有0.02％的溴酚红的磷酸缓冲生理盐水中，用无菌剪刀和镊子将其剪碎成小块。
然后，将组织块放入含有0.25％胰酶的溶液中，在37℃的恒温培养箱中消化2至5分钟。
然后，将溶液过滤并离心，以去除细胞碎片和大块组织。
4.细胞的分离和培养：将离心沉淀涂布在含有25％培养基和10％胎牛血清的培养皿中，然后放入37℃的恒温培养箱中。
培养基的成分可以根据具体需要进行调整。
细胞会附着在培养皿上，并开始生长和繁殖。
在细胞培养过程中，需要定期更换培养基，以提供细胞所需的营养物质。
5.细胞的处理和分选：在培养4至7天后，细胞会形成较为密集的神经元网络。
在这个时候，可以通过处理和分选细胞来提高神经元的纯度。
例如，使用抗体标记法可以针对神经元选择性地杀死胶质细胞。
此外，还可以使用细胞遗传方法，如转染特定基因或使用荧光探针标记细胞。
6.测试和分析：经过特定时间的培养后，可以对原代海马和皮质神经元进行测试和分析。
这些测试和分析可以包括细胞生存率、纯度、形态特征、电生理活性、细胞内信号和细胞功能等方面的内容。
这些测试和分析的方法可以通过显微镜观察、电生理仪器、蛋白质和基因分析等手段进行。
7.特殊处理：有时对于特定的研究需要，还可以对原代海马和皮质神经元进行特殊处理。
例如，可以通过给予特定药物、激素或其他刺激条件，来模拟不同的疾病模型或研究特定功能。