荧光显微镜检测细胞凋亡

实验报告五（2015.5.27）

荧光显微镜检测细胞凋亡（Hoechst 33258 染色）

姓名：王亚斌班级：生物技术12（1）学号：2012332860026

实验五：荧光显微镜检测细胞凋亡（Hoechst 33258 染色)

一实验目的：

1 了解荧光显微镜的构造并且学会使用荧光显微镜；

2 通过荧光显微镜学会分析数据图片。

二实验原理：

Hoechst 33258，分子式为C25H24N6O·3HCl，分子量为533.88, 水溶解度可达10mg/ml。Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。Hoechst 33258为特异性DNA染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经70%冷乙醇固定的细胞可立即染色。而活细胞的着色是渐进性的，在10min内可达饱和。在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。

三实验器材：

1ml移液枪及枪头，荧光显微镜，培养贴壁细胞，PBS缓冲液，Hoechst 33258 染色液六孔板，培养箱

四实验步骤和方法：

1：加入适当量Hoechst 33258 染色液，注意必须充分覆盖住待染色样品。通常六孔板加1ml/孔，96孔板加100μl/孔。

2：放入37°C培养箱中培养30min。

3：小心吸去染色液，用1ml PBS洗涤2-3次。

4 ：置于荧光显微镜下，选用340nm的激发光观察：在荧光显微镜下，活细胞呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞。

五实验结果

防己诺林碱浓度为0uM 防己诺林碱浓度为2uM

防己诺林碱浓度为2uM防己诺林碱浓度为4uM

防己诺林碱浓度为6uM

防己诺林碱浓度为8uM

防己诺林碱浓度为10uM

在上图可以看出，在防己诺林碱浓度为2um/ml的时候出现了染致密的颗粒块状荧光，也就是说在这个浓度下，细胞开始放生了凋亡，而且，在不断提高防己诺林碱浓度的情况下，视野里的凋亡细胞开始变多了，而且凋亡细胞数目要多于活细胞数目。

六．分析与讨论

在荧光显微镜下，用340nm的激发光观察活细胞呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞，图中，随着防己诺林碱浓度的升高，凋亡细胞数目逐渐增多，当浓度在10um/ml 的时候，视野中几乎看不到有活细胞的存在，可以说，在这个浓度下，抑制细胞数目增殖的作用是最强的。