木糖发酵乙醇菌种的研究进展

③ 副产物对木糖代谢的影响。比如糠醛、乙酸、 乳酸等。这些副产物的过多积累会导致发酵液中 的H+浓度增加，增加了能量的消耗，而细胞没有 足够的能量补充，抑制了细菌酒精的发酵。这需 要引入阻断乙酸、乳酸的合成酶的途径，消除乙 酸和乳酸的产生以及减少有机酸对细胞生长、木 糖利用的抑制作用。
四、大肠杆菌（E.coli）

Z. mobilis属革兰氏阴性细菌，微好氧生长。 它是唯一一种通过ED代谢途径将葡萄糖和 果糖转化为乙醇的细菌。因其丙酮酸脱羧 酶和乙醇脱氢酶基因能够高效表达，乙醇 发酵能力非常突出。同时Z. mobilis生长的 营养需求相对简单。这些优点使得Z.mobilis 在工业化生产领域具有广阔的应用前景。

大肠杆菌是目前研究最彻底的工程菌，它相比酿 酒酵母和运动发酵单胞菌的优势在于E.coli能够利 用的底物很广泛，它能够分解己碳糖（葡萄糖、 果糖等）戊碳糖（木糖、阿拉伯糖等），而且所 需的培养条件简单。
但E.coli主要缺陷是：pH值范围狭窄而中性（6.08.0）；适应性比酵母还差，具有潜在危险性；在 乙醇发酵途径中缺少丙酮酸脱氢酶（PDC）和以 及乙醇脱氢酶Ⅱ（ADH Ⅱ ）的水平低。
木糖发酵乙醇菌种的研究进展
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一、研究背景 二、酿酒酵母的改造 三、运动发酵单胞菌的改造 四、大肠杆菌的改造 五、其他菌种的改造 六、总结与展望
一、研究背景

随着人类不断的对能源的需求和无止境的开采， 石油等天然能源已逐渐枯竭，而近些年来，更不 断的有国家为了争抢能源而爆发战争等。伴随着 石油危机，环境问题也逐渐明显，因此，人们迫 切需要寻找新的可持续能源来解决现在的问题。


另外运用一些其他发酵方法也可以提高乙 醇产率，比如固定化酿酒酵母或固定化 Z.mobilis，通过两步发酵法，先用固定化细 胞水解混合糖溶液中的葡萄糖，然后拿出 固定化细胞再添加能分解木糖的菌种，最 终全部水解成乙醇。
随着现在的科学技术的不断发展，菌种的 遗传背景也会越来越清晰，相信通过技术 能够让菌种向着有利的方向进化，能够高 效分解葡萄糖和木糖，并最终实现工业化。

目前主要原料：谷物，糖类，油脂 近期发展目标：木薯，红薯，甜高粱 长期发展目标：植物纤维资源

我国虽是个农业大国，但人均占有资源少，粮食 资源也有危机，因此用粮食发酵产乙醇不切实际。 但我国拥有丰富的植物纤维资源。每年有大量的 农作物的秸秆被浪费，虽然一部分用于微生物降 解腐熟做成肥料，但大量的秸秆还是被拿去焚烧， 造成了环境污染和资源浪费。
六、总结与展望

目前木糖发酵乙醇的菌种都只是停留在实验室阶 段，这离以后的工业化还是有一定的距离。
现在的重组菌都面临的问题是通过基因工程技术 为重组菌引入了能直接分解木糖的代谢途径，从 而与各自本身的乙醇代谢途径相偶联。但实际中 这些基因片段不能高效的表达出来，它们因为代 谢途径的不完美或能量不平衡或底物副产物的抑 制作用等等而被限制了利用木糖能力。今后的重 组菌研究方向则需要解决以上的问题，并要提高 菌种的耐乙醇性、耐酸性以及发酵条件的简单性。


⑵木糖异构酶基因（XylA）
引入细菌的木糖异构酶的基因（XylA）可以不需 要任何辅助因子，是酿酒酵母直接利用木糖转化 为木酮糖，而不需要经过木糖醇这一步。但这种 方法最后的结果是XylA在重组酵母的表达能力很 低。有研究者将多种来源的XylA片段导入重组酵 母中，但木糖异构酶(XI)却无法表达。Walfridsson 等将嗜热细菌的XylA成功的在酿酒酵母中表达， 但活性很低。 原因有：①细菌和酵母的最适pH和最适反应温度 不同；②后期翻译模式不合适；③亲缘关系较远。


后来又有研究者将PDC和ADHⅡ的基因串联
起来置于T7启动子控制下，构成多顺贩子表达质 粒pQR-PRA并转入E.coli内。

这种方法的优势在于通过诱导调节降低目的蛋白 对宿主的毒性，进而降低质粒的不稳定性。同时， 一旦T7 RNA聚合酶被充分诱导，几乎所有细胞资 源均用于目的蛋白的合成，另外还防止了包涵体 的形成。




ED途径

因此，可以通过基因改造技术，为Z.mobilis 添加木糖代谢的途径，并与ED途径偶联， 最终使重组的Z.mobilis能够同时代谢木糖和 葡萄糖。
比如木糖异构酶基因和木酮糖酶基因负责 将木糖转化成磷酸戊糖途径的重要中间物 木酮糖-5-磷酸，转酮醇酶基因和转醛醇酶 基因负责将木酮糖-5-磷酸转化成ED途径的 中间物，从而使木糖被利用并生成乙醇。

这种重组菌目前也只是在理论上能够表达PDC和 ADHⅡ基因，但具体效果还需要在酶活测定和发 酵试验中进一步确定
五、其他菌种

在木糖发酵中也对其他菌种有所研究，比 如树干毕赤酵母、休哈塔假丝酵母的研究， 这些酵母能够直接水解木糖，但容易受底 物的抑制，在培养条件严格，比如需要控 制低浓度的供氧，这些条件都限制了其在 木糖发酵的工业化应用。

重组大肠杆菌

乙醇最后从丙酮酸转化过来就是靠丙酮酸脱氢酶 和乙醇脱氢酶Ⅱ的催化完成的。根据E.coli的这个 缺陷，研究者设计将Z.mobilis上的PDC和ADHⅡ 克隆在载体质粒中，然后在转化到E.coli上，使重 组菌具有了生成乙醇的能力，但实际结果是表达 性能并不是很好，而且乙醇产率很低。 这是因为重组的E.coli是以pet操纵子为基础，需要 IPTG诱导表达，葡萄糖对该操纵子有一定的抑制 作用，会抑制下游基因的表达。

谢谢

如果我们能把这些秸秆充分的利用上并用 于生物燃料乙醇的开发，不仅能够保护环 境，还能缓解当下的石油危机和粮食危机。
纤维素燃料乙醇的工艺

细菌和酵母菌利用木糖发酵乙醇的途径
XK 木酮糖激酶 XR 木糖还原酶 XDH 木酮糖脱 氢酶
XI 木糖异构酶

木糖发酵成酒精主要是先通过木糖异构酶 的作用将木糖转化为木酮糖, 然后在木酮糖 激酶的作用下转变成磷酸木酮糖, 继而进入 磷酸戊糖途径( PPP) 代谢成为乙醇，整个过 程都是厌氧发酵过程。目前对木糖的降解 研究主要集中在酿酒酵母，运动发酵单胞 菌，大肠杆菌等，另外对树干毕赤酵母和 休哈塔假丝酵母也有研究。
目前世界上就美国和巴西使用了生物燃料乙醇， 而巴西则是最大的生物燃料乙醇生产国和消费国， 也是唯一不使用汽油作为燃料的国家，巴西主要 用甘蔗为原料生产生物燃料乙醇，美国和巴西生 物燃料乙醇产量之和比全世界其他所有国家生产 生物燃料乙醇总量还要多 。

生物燃料乙醇是公认为的最清洁和最有前景 的可再生燃料之一。

重组运动发酵单胞菌

1995年zhang等学者通过PCR重叠延伸技术将木糖 异构酶基因（XylA）、木酮糖激酶基因（XylB）、 转酮醇酶基因（tktA）、转醛醇酶基因（talB）四 个木糖代谢重要的酶基因转化到Z.mobilis上，并 成功的等到表达。
但这种缺陷是只能在木糖唯一的培养基上能够生 成乙醇，而在木糖-葡萄糖混合培养基上却只能分 解葡萄糖，这说明分解葡萄糖的产物会抑制木糖 的分解
因此对酿酒酵母木糖酒精发酵途径的研究 可以从引入木糖代谢途径的开始，包括木 糖向木酮糖的转化以及强化代谢流向酒精 生成的方向


自然界中由木糖转化为木酮糖的代谢途径 有两条。
⑴在某些真菌中，在木糖还原酶（XR）和木糖醇 脱氢酶（XDH）的共同作用下完成，XR和XDH 分别需要NADPH和NAD+作为辅酶。 ⑵在某些细菌中，通过木糖异构酶（XI）直接转 化为木酮糖

与酿酒酵母相比，运动发酵单胞菌具有的优点： ①耐乙醇能力高，能达到16%vv； ②温度范围宽（30℃-39℃）； ③最适pH宽，最适pH 5.0-7.0±0.2； ④比生产速率和发酵速率快。
但相比之下，运动发酵单胞菌也有缺点： ①分解的底物有限，只能水解葡萄糖、果糖和蔗糖等六碳 糖； ②有副产物三梨醇、胞外果聚糖、乙酸等产生，抑制乙醇 的产生； ③在生产上细菌发酵比较容易染菌，并且对pH的控制上也 比酵母严格得多。


Mohagheghi等又将发酵木糖和阿拉伯糖所 需的7个基因整合到Z.mobilis上，赋予了新 菌株发酵木糖和阿拉伯糖 能力的同时，也 减少了副产物。

运动发酵单胞菌的研究现状：
①在木糖-葡萄糖混合培养基中，重组菌都优先利 用葡萄糖，而且到了一定的时间后则会停止利用 木糖。这是因为在葡萄糖和木糖代谢的时候会产 生NADPH，而Z.mobilis不具有完整的三羧酸循环， 限制了生物体通过呼吸作用产生ATP的能力，因 此体内的NADPH累积，对细胞产生负担，影响菌 体的生长及利用木糖的能力。


② 重组菌在混合培养基中木糖的利用率很 低，这是因为Z.mobilis缺少木糖转运蛋白， 木糖的转运是靠细胞膜上的葡萄糖促进扩 散因子运输的，而这个运输因子对葡萄糖 的亲和力高，导致优先转运和利用葡萄糖。 研究发现，在代谢过程中，木酮糖发生了 累积，因此在完善Z.mobilis三羧酸循环后还 需要提高木酮糖激酶基因在细胞中的表达 力。
二、酿酒酵母

酿酒酵母是传统的工业生产乙醇的菌株， 它的基因全序列基本都已测定，是目前人 们了解最多的生物之一 。但酿酒酵母不能 直接利用木糖发酵，因为酿酒酵母缺乏木 糖代谢途径最初将木糖转换为木酮糖的酶 而不能利用木糖。

酿酒酵母具有木酮糖代谢的完整酶系，木 酮糖在木酮糖激酶（XK）磷酸化生成5-磷 酸木酮糖，而进入磷酸戊糖途径（PPP）， 然后以中间产物6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘油 醛进入酵解途径（EMP），最终在厌氧条 件下生成酒精。

因此，研究重组酿酒酵母的瓶颈在于：
⑴对XR和XDH能否相偶联从而使氧化还原相平衡， 使得木糖醇等代谢产物的积累减少。 ⑵XI不需要任何辅助因子，但其来源于亲缘关系较 远的细菌，只有少数高温细菌的能够成功表达， 但其最适温度和pH都不一样，不能高效的表达。