乳鼠心肌微血管内皮细胞体外原代培养与鉴定的实验研究

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乳鼠原代心肌细胞培养概要

乳鼠原代心肌细胞培养概要作者：何伟，张明雪，闫丽娟作者单位：何伟(辽宁中医药大学,辽宁省沈阳市,110032)，张明雪,闫丽娟(辽宁中医药大学附属医院)刊名：实用心脑肺血管病杂志英文刊名：PRACTICAL JOURNAL OF CARDIAC CEREBRAL PNEUMAL AND VASCULAR DISEASE年，卷(期)：2009，17(4)引用次数：0次1.郭军.鲍翠玉.林国生.杨波新生大鼠心肌细胞培养方法的改进[期刊论文]-心血管康复医学杂志 2006(6)2.邵华.金秀东.梁军.张际绯.刘瑞峰不同差速贴壁时间对心肌细胞培养的影响实验性研究[期刊论文]-牡丹江医学院学报 2008(1)3.王涛.余志斌.谢满江.车红磊新生大鼠心肌细胞培养技巧[期刊论文]-第四军医大学学报 2003(2)1.期刊论文谭玉珍.王海杰.TAN Yu-zhen.WANG Hai-jie生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征-解剖学报2009,40(4)目的观察生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征,建立理想的分离和纯化乳鼠心肌细胞技术. 方法采用胰蛋白酶消化和机械分离,结合两次差速贴壁法以及使用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),从生后1～7d乳鼠心脏分离和纯化心肌细胞.观察细胞的形态和自发性搏动,并用心肌特异性肌钙蛋白丁(cTnT)免疫细胞化学染色进行鉴定.利用原位透射电镜术观察细胞超微结构,并观察其对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应. 结果从乳鼠心脏分离的细胞95%以上为心肌细胞,存活率为95%以上.乳鼠心肌细胞包括短柱状或杆状细胞和不规则形细胞.生后1～3d鼠大部分杆状细胞呈现幼稚心肌细胞的超微结构特征.6～7d鼠的杆状细胞具有类似于成熟心肌细胞的超微结构特征,cTnT呈高表达,横纹明显.不规则形细胞含有少量肌丝束,排列不规则.少数体积较小的细胞呈现未分化细胞的超微结构特征.培养72h后80%以上的细胞出现自发性搏动.肾上腺素和异丙肾上腺素刺激后,搏动细胞数目增多,搏动增强.生后6～7d鼠杆状细胞的药物反应较强. 结论两类心肌细胞的超微结构特征、自发性搏动和对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应不同.生后6～7d鼠心肌细胞较适合于成熟心肌细胞的体外实验研究.本实验建立的方法是一种较理想的乳鼠心肌细胞培养方法 .2.学位论文张昱第一部分：硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用;第二部分：硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用2009研究一硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用背景：新型气体信号分子一硫化氢(H2S)在心血管系统主要具有舒张血管，开放心肌细胞ATP敏感钾通道、抑制L型钙通道而产生的负性心肌收缩力的效应。

乳鼠心肌细胞的培养

乳鼠心肌细胞的培养配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。

取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。

准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。

其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。

新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。

用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

物品：白大衣、饭盒小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]500ml烧杯1个，用作废液缸。

50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）离心管及帽（12-14个），两个试管吸管（5~8个）大镊子（两把，持物，例夹棉球等）台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml以上物品均用紫外线照30分钟。

另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+一把小锁、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。

新生大鼠心脏微血管内皮细胞原代培养

＿ｌＪ］．Ｌａｎｃｅｔ，１９９５，３４６（８９６８）：１９３１９４．Ｅ５］ＢｒｉｌｉａＣＧ，ＭａｔｓｕｂａｒａＬＳ，ＷｅｂｅｒＫＴ，ｅｔ“ ｆ．Ａｎｔｉ —ａｌｄｏｓｔｅｒ０ｎｅ
５６３—５７５．
然发生，即使在使用最大剂量的ＡＣＥＩ和联合ＡＣＥＩ与
ＡＲＢＦቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 。。・
Ｌ６ＪｕｎＫ．ＴｏｍｏｍｉＭ，ＨｉｔｏｍｉＳ，ｅｔａ１．Ｃａｒｄｉａｃａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００５，１１１：２１５７ —２１６４．
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乳鼠心肌细胞的培养ppt课件

乳鼠心肌细胞的培养
实验目的意义实验材料
实验方法
操作步骤及人员落实预期结果
目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中的无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法。意义：原代培养是指直接从机体取出细胞、组织和器官后立即置于培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。原代培养细胞离体时间短，细胞保持体内原有的基本性质，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞（如动物的胚胎、幼仔的脏器）等更容易进行原代培养。
•消化组织
•培养细胞
前期准备
1. 将备用物品（手术器械、培养皿、烧杯、离心管等）进行高压灭菌； 2. 用酒精擦拭层流台，将高压灭菌后的物品放入层流台，紫外线消毒30分钟。
用镊子夹住小鼠尾巴将小鼠在酒精中浸泡两次，约 2~3秒； 2. 用剪刀将小鼠头部剪去； 3. 将动物固取材器官范围的被毛，定在解剖板上并将胸部剪开暴露出心脏，用另一个剪刀将小鼠心脏剪下； 4. 放入装有预冷的Hanks液的培养皿中，将心脏剪开,剪碎组织至1mm³左右，清洗残留的血液。
1.
1. 将心肌组织转移至另一个装有预冷的Hanks液的培养皿中进一步剪碎心脏后，加入等体积的0.125％胰酶； 2. 将心肌组织转移至离心管中，用吸管反复吹打（使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来）10min, 静置2min后，弃上清； 3. 再次加入Hanks液和等体积的0.125％胰酶，常温下用吸管反复吹打10min，静置2min后将上层液转移至100ml容器中，加入含10%小牛血清的1640培养基终止消化； 4. 重复上一步骤至组织完全消化，适当控制消化时间。

仪器：培养箱（调整至37℃）、培养瓶、

乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养

１３实验仪器超净工作台（海浦东物理光学．上
仪器厂）Ｃ培养箱（国ＳＥＬＬＢ公司）普、Ｏ美ＨＬＡ、
通光学显微镜（日本Ｏｙｕ）离心机（大利ＡＣｌｍｐｓ、意Ｌ公司）。等
胎牛血清为接种培养液，加入１％新生牛血清为交０
换培养液。酶消化液：将胰蛋白酶溶于ＰＳ缓冲液Ｂ（Ｈ７２～．），ｐ．７４中配成０１．％胰蛋白酶消化液；将
Ｉ型胶原酶溶于ＰＳ缓冲液（Ｈ７２～７４中，Ｂｐ．．）配成００％的胶原酶消化液。０１胰蛋白酶及．８．％
１４方法．
维细胞培养常存在污染、消化不全和纯度不够等现象。为此，们参照Ｓｍｓｎ等的培养方法并作我ｉｐｏ
了改进，摸索出一种简便、可靠，且同时能培养出心肌细胞和心脏成纤维细胞的方法，心肌细胞和心为脏成纤维细胞的体外研究提供了更有效Байду номын сангаас的技术手段，作报道。现
００％Ｉ型胶原酶以２１．８：混合，配现用。现１２实验动物１～Ｆ龄Ｓ．３ｔＤ大鼠１２０～５只，由本院实验动物中心提供。
［收稿日期］２０－６３０９０－０［作者单位］１蚌埠医学院药理学教研室，．安徽蚌埠２３３２蚌３００；．埠医学院第一附属医院心血管内科，安徽蚌埠２３０３０４［作者简介］张乃菊（９１一）女，士研究生．１８，硕［通讯作者］祝晓光，研究生导师，教授．

原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法

原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。

2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。

3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。

4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。

5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。

封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。

第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。

之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。

放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。

这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。

（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。

5只鼠铺一个培养瓶。

4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。

心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。

注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。

NPC乳鼠Purkinje细胞原代培养及Ca2+动力学特征和小鼠小脑氨基酸测定

华中科技大学硕士学位论文NPC乳鼠Purkinje细胞原代培养及Ca2+动力学特征和小鼠小脑氨基酸测定姓名：余姗姗申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：卜碧涛2010-04华中科技大学硕士学位论文NPC乳鼠Purkinje细胞原代培养及Ca2+动力学特征和小鼠小脑氨基酸测定华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科硕士研究生：余姗姗导师：卜碧涛中文摘要第一部分NPC乳鼠Purkinje细胞原代培养及细胞Ca2+电流和Ca2+动力学特征目的建立简单有效的NPC乳鼠Purkinje细胞原代培养方法，初步研究其细胞电生理特性，并将培养细胞用荧光染料Fluo-3/AM标记后在共聚焦显微镜下测定细胞内Ca2+浓度,比较NPC-/-乳鼠及野生型乳鼠培养细胞各观察指标之间的差异。

方法钝性分离生后24h内的乳鼠小脑，采用低浓度胰蛋白酶加机械吹打法获得单细胞悬液，然后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养，24h后更换为1%N2+1%T3+1%谷氨酰胺的DMEM/F12维持培养，3-5d后进行细胞免疫荧光染色，5-7d后在共聚焦显微镜下测定Purkinje 细胞内基础荧光强度值以及加入KCL溶液（60umol/l）以及NBQX(AMPA受体阻滞剂)后荧光强度值的变化，利用相应软件处理后得出细胞内Ca2+浓度测定结果，7-9d后用全细胞膜片钳单通道法记录钙电流。

结果该方法培养的神经元形态典型，细胞学鉴定阳性率高(>70%)，并记录到钙通道电流，且NPC-/-乳鼠培养细胞Ca2+浓度高于野生型乳鼠。

结论该方法取材容易，操作简单，培养的Purkinje细胞生长状态良好，活性较高，可用于电生理和Ca2+动力学研究。

关键词原代培养；Purkinje细胞；乳鼠；全细胞膜片钳；单通道记录法；共华中科技大学硕士学位论文聚焦；细胞内Ca2+浓度测定第二部分质谱分析法测定五周龄NPC小鼠小脑皮层3种氨基酸含量目的测定五周龄NPC小鼠小脑皮层氨基酸含量，比较NPC-/-小鼠与野生型小鼠小脑内氨基酸含量的差异。

原代乳鼠心肌细胞分离培养的改进-论文

Ｍｏｓｔｃｅ１１ｓｗｅｒｅｔｏＵＣｈｉｎｇｔｏｗａｌｌｉｎ１２ｈｏｕｒｓ，ａｎｄａｌ１ｃｅｌｌｓｓｔｉｃｋｉｎｇｔｏｗａｌｌｉｎ２４ｈｏｕｒｓ，ｗｉｔｈｓｍａｌｌａｍｏｕｎｔ
１．１材料
１．１．１实验动物新生ＳＤ大鼠乳鼠（１～３ｄ），由
自主搏动情况及频率。
１．２．５心肌细胞纯度鉴定用免疫荧光法鉴定心肌细胞纯度，一抗为抗心肌肌钙蛋白Ｔ抗体，二抗标有红色荧光。将培养７２ｈ的接有心肌细胞的６孔板用ＰＢＳ清洗２４３遍，室温下４多聚甲醛固定１０ｍｉｎ，０．２５Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００透化１０ｍｉｎ，驴血清封闭３０ｍｉｎ后加入一抗孵育１ｈ。加入二抗避光孵育１ｈ后用ＤＡＰＩ１￣ｇ／ｍＬ染色１ｍｉｎ。于倒置荧光
及纯度低、细胞活性差等原因，尚不能满足于基础研
基金项目：国家自然科学基金（８１０６００２１）作者简介：包馨慧（１９８９一），女，在读硕士，研究方向：心血管疾病基础与临床研究。
通信作者：李晓梅。女，博士，副主任医师，副教授，研究方向：冠脉介人的基础及临床研究，Ｅ — ｍａｉｌ：Ｌｉｘｍ５０５＠１６３．ｃｏｍ。

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ｓｅｒｖｅｄｗｉｔｈｉｎｖｅ￣ｅｄｐｈａｓｅｃｏｎｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｃｅｌｌｐｕｒｉｔｙｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｃｙｔ０ｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｗｉｔｈ
ＺＨＡＮＧＹｉｎｇ－ｑｉａｎ，ＨＵＳｈｕｎｙｉｎｇ，ＣＨＥＮＹｕｎ — ｄａｉ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＶａｓｃｕｌ０ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰＬＡ，５３，Ｃｈｉｎａ）
・
６・
医药杂志２０１３年９月第２５卷第９期Ｍｅｄ＆ＰｈａｒｍＪＣｈｉｎＰＬＡ．Ｖｏ１．２５．Ｎｏ．９．Ｓｅｐ．２０１３
・
论著・
乳鼠心肌微血管内皮细胞体外原代培养与鉴定的实验研究
（ＣＭＥＣｓ）ｏｆｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｓｗｉｔｈｈｉｇｈｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎｐｕｒｉｔｙａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ．ＭｅｔｈｏｄｓＣＭＥＣｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＳＤ
ｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｓｂｙｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅａｎｄｔｒｙｐｓｉｎａｎｄｄｅｐｕｒａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｔｈｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｗａｓｏｂ—
张颖倩，胡舜英，陈韵岱
［摘要］目的探讨体外原代培养与鉴定纯度、成活率均较高的乳鼠心肌微血管内皮细胞（ＣＭＥＣｓ）的方法。方
法双酶消化法分离原代ｓＤ乳鼠ＣＭＥＣｓ并以差速贴壁法进行纯化，倒置显微镜观察细胞生长状态。Ⅷ 因子及ＣＤ３１抗体免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。台盼蓝染色测定细胞存活率，并以ＡｎｎｅｘｉｎＶ＆ＰＩ双标记流式细胞术检测细胞凋亡率。结果倒置相差显微镜观察细胞呈管腔样、铺路石样生长， Ⅷ因子及ＣＤ３１抗体免疫细胞化学染色双阳性细此方法成功培养与鉴定出胞＞９５％，台盼蓝染色及ＡｎｎｅｘｉｎＶ＆ＰＩ双标记流式细胞术检测细胞存活率＞９５％。结论纯度及存活度较高的ＣＭＥＣｓ。［关键词】心肌；内皮，血管；细胞培养技术；大鼠，Ｓｐｒａｇｕｅ．Ｄａｗｌｅｙ［中国图书资料分类号］Ｒ－３３２［文献标志码］Ａ［文章编号］２０９５－１４０Ｘ（２０１３）０９￣００６．０４
［ＤＯＩ］１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５．１４０Ｘ．２０１３．０９．００２
ＰｒｉｍａｒｙＣｕｌｔｕｒｅａｎｄＩｄｅｎｔｉｉｃｆａｔｉｏｎｏｆＣａｒｄｉａｃＭｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａＩＣｅｌｌｓｏｆＮｅｏｎａｔａＩＲａｔｓ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｏｆｃａｒｄｉａｃｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔｆａｃｔｏｒⅧ ａｎｄＣＤ３１．Ｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｃｏｕｎｔｉｎｇｔｙｐｒａｎｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇ．ａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｄｏｕｂｌｅｌａｂｅｌｌｉｎｇｏｆＡｎｎｅｘｉｎＶ＆ＰＩｓｔａｉｎｉｎｇｌｆｏｗｃｙｔｏｍｅｔｙ．ＲｅｒｓｕｌｔｓＣｅｌｌｇｒｏｗｔｈｓｈｏｗｅｄＬｕｍｉｎａｌ —