壳聚糖酶的研究进展
壳聚糖的研究
壳聚糖的研究壳聚糖的研究郑英奇 04300079壳聚糖[CS, (1 , 4) - 2- 氨基- 2- 脱氧- B- D - 葡聚糖]是目前自然界中发现的膳食纤维中唯一带正电荷的动物纤维, 分子内存的大量游离氨基, 使得其溶解性能较甲壳素有很大提高, 同时反应活性大大增强, 引起人们的广泛关注[ 1 ]。
壳聚糖分子中的氨基、羟基与大部分重金属离子形成稳定螯合物的性质, 可应用于贵金属回收、工业废水处理; 其天然生物活性的直链聚阳离子结构具有抑菌、消炎、保湿等功能, 可用于医药、化妆品配方等领域; 特别是经过化学改性得到的壳聚糖衍生物, 其物理化学性质得到改善, 使其应用范围大大拓展, 因此壳聚糖及其衍生物的开发及应用研究已引起人们广泛的兴趣。
本文就其功能化及其作为生物医用高分子材料方面的研究进行了简要综述。
1 壳聚糖的功能化及其在生物医用高分子材料方面的应用同其它碳水化合物一样, 壳聚糖也可以发生交联与接枝、酯化、氧化、醚化等反应, 生成一系列各具其特殊功能的新材料。
1. 1 壳聚糖的接枝反应及其在生物医用高分子方面的应用近几年壳聚糖的接枝共聚研究进展较快, 较为典型的引发剂是偶氮二异丁腈、Ce (IV ) [ 2 ]和氧化还原体系。
壳聚糖C6- 伯, C3- 仲羟基及C2-氨基皆可以成为接枝点, 通过接枝反应, 可将糖基、多肽、聚酯链、烷基链等引入到壳聚糖中, 赋予壳聚糖新的性能。
单纯的壳聚糖作为药物释放包覆物, 有溶解性差、对pH 的依赖性太强和机械性能不好等缺点, 而接枝上具有水溶性、生物相容性好的PVA 后, 能极大地改善其对药物的释放行为, 且满足H iguch i’s 扩散模型[ 3 ]。
在壳聚糖上接枝唾液酸的一部分, 有望成为人类红细胞凝结的抑制剂, 壳聚糖上NH2 的正电荷与细胞表面的脂质体的负电荷(如唾液酸) 相结合后, 可抑制细胞的活动能力, 从而抑制细菌生长; 低聚体的壳聚糖能穿透细胞壁, 进入细菌的细胞内, 抑制其细胞中mRNA 的形成, 从而抑制细菌的生长。
从菌丝体中提取壳聚糖的研究进展
Ｙ Ｎ ｉ— ｈ ｏ． Ｈ ａ ｇ ｙｎ ｚＬＵ Ｊ ｎ ｊｎ Ａ Ｇ Ｘｎ ｃ ａ １ ＡＯＸｉ — ｉｇ，Ｉ ｉ －ｕ Ｚ ｎ ａ
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摘要： 壳聚糖可应用于水处理、 医疗卫生、 食品及保健等领域。其制备通常是从虾、 蟹壳提取的 ， 由于原料的不稳 定 但 性 ， 壳聚糖的产量和质量受到影响 。因此， ８ 使 从 ０年代后期， 日本和美国先后开始研究用微 生物发酵的方法生产壳聚 糖 。本文对 壳聚糖 的性质、 生产及应 用进行了综述。 关键词 ： 壳聚糖 ； 几丁质 ； 发酵
ｆ． ｐ ｒ ｎ ｆＦ ｏ ｎ ｏ ｎ ｉｅ ｒ ｈ ｎ ｏ ｇ Ｉ ｓｉ ｔ ｆＬ ｇ ｔＩｄ ｓｒ ，ｉａ ５ １ ｏＣ ｉａ ２ １ Ｄｅ ａｔ ｔｏ ｏ ｄ ａ ｄ Ｂｉｅ ｇｎ ｅ， ａ ｄ ｎ ｎ ｔｕ ｅ ｏ ｉｈ ｎ ｕ ｔ Ｊｎ ｎ ２ ０ ０ ， ｈｎ ； ． ｍｅ Ｓ ｔ ｙ
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壳聚糖酶的作用
壳聚糖酶的作用
壳聚糖酶是一类在生物体中起着重要作用的酶，它具有分解壳聚糖的能力。
壳聚糖是一种多糖，广泛存在于生物体内，特别是在海洋生物和昆虫的外骨骼中。
壳聚糖酶的作用是将壳聚糖分解为更小的单糖分子，从而使其能够被生物体更容易吸收和利用。
壳聚糖酶在海洋生物中的作用尤为重要。
例如，在贝类和甲壳类动物的外壳中含有大量的壳聚糖。
当它们生长或需要修复外壳时，壳聚糖酶就会发挥作用，将外壳中的壳聚糖分解为单糖，以供生物体利用。
这一过程不仅帮助生物体增长和恢复，还可以使它们更好地适应环境的变化。
壳聚糖酶对昆虫也有重要作用。
昆虫的外骨骼中含有大量的壳聚糖，这为昆虫提供了保护和支撑。
然而，在蜕皮和生长过程中，昆虫需要不断更新外骨骼。
壳聚糖酶通过分解外骨骼中的壳聚糖，使昆虫能够顺利蜕皮和生长，完成它们的生命周期。
除了在海洋生物和昆虫中的作用，壳聚糖酶在其他生物体中也起着重要的作用。
例如，在真菌中，壳聚糖是构成菌丝壁的重要成分，壳聚糖酶可以分解菌丝壁中的壳聚糖，帮助真菌生长和繁殖。
在植物中，壳聚糖酶可以分解植物细胞壁中的壳聚糖，促进植物生长和发育。
总体而言，壳聚糖酶在生物体中的作用是不可忽视的。
它通过分解
壳聚糖，帮助生物体进行生长、修复和适应环境的变化。
壳聚糖酶的发现和研究不仅有助于我们更好地理解生物体的生长和适应机制，还为生物技术和生物医药领域的研究提供了重要的参考和借鉴。
通过深入研究壳聚糖酶的作用机制，我们可以进一步挖掘其潜在的应用价值，为人类社会的可持续发展做出更大的贡献。
低分子量壳聚糖
低分子量壳聚糖低分子量壳聚糖（Low Molecular Weight Chitosan, LMWC）是一种重要的功能性生物材料，具有广泛的应用前景。
本文将介绍低分子量壳聚糖的特性、制备方法、生物活性及其应用领域的研究进展。
一、低分子量壳聚糖的特性低分子量壳聚糖是由壳聚糖经酶或化学方法降解而得到的，其相对分子质量较小，一般在1-10 kDa范围内。
相对于普通的壳聚糖，低分子量壳聚糖具有以下独特的特性：1. 溶解度好：由于分子量较小，低分子量壳聚糖在水中的溶解度较高，易于制备各种溶液和制剂。
2. 生物相容性优异：低分子量壳聚糖是从天然壳聚糖中提取得到的，具有良好的生物相容性和生物可降解性。
3. 生物活性显著：研究表明，低分子量壳聚糖具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤和促进伤口愈合等多种生物活性。
4. 调节免疫功能：低分子量壳聚糖可以增强机体的免疫功能，调节免疫细胞的活性和细胞因子的产生。
二、低分子量壳聚糖的制备方法目前，低分子量壳聚糖制备方法主要包括酶解法、酸解法、还原法和辐照法等。
1. 酶解法：通过壳聚糖酶的作用，将壳聚糖降解成低分子量的产物。
2. 酸解法：利用酸（如盐酸、硫酸等）将壳聚糖进行酸解，得到低分子量壳聚糖。
3. 还原法：壳聚糖经过还原处理，将壳聚糖的N-乙酰胺基团还原为氨基基团，从而使壳聚糖的分子量降低。
4. 辐照法：利用电子束辐照或γ射线辐照壳聚糖，使其分子量降低。
三、低分子量壳聚糖的生物活性1. 抗菌活性：低分子量壳聚糖具有较好的抗菌活性，可以通过破坏细菌膜结构、抑制细菌的生物膜形成和干扰细菌DNA复制等机制发挥抗菌作用。
2. 抗氧化活性：低分子量壳聚糖可以清除自由基、抑制氧化反应、调节抗氧化酶活性等，具有较好的抗氧化活性。
3. 抗肿瘤活性：研究显示，低分子量壳聚糖可以诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，并调节肿瘤相关信号通路，具有良好的抗肿瘤活性。
4. 促进伤口愈合：低分子量壳聚糖可以促进伤口愈合过程中的纤维母细胞增殖、胶原合成、血管新生和上皮细胞迁移等，加速伤口愈合。
固定化细胞产壳聚糖酶条件的研究
ｍ ｂ ｉ ｄｃｌ ． ｄ ｔｅｂ ｓ ｃ ｍ ｉ ｔ ｎ ｗ ｓＡ ３ ３ ３ ：ｏ ｉ ｇ ａｅｃ ｎ ｅ ｔ ｔ ｎ ２ ， ａ ｈ ｃ ｎ ｅ ｔ ｔ ｎ４ ， ｏ ｉ ｅ ｅｓ Ａｎ ｈ ｅ ｔ ｏ ｂｎ ｉ ａ １ ， ｓｄｕ ａ ｉ ｔ ｏ ｃ ｎｒ ｉ ％ ｅ Ｃ ｏ ｃｎ ｒ ｉ ％ ｌ ｚ ｌ ａｏ ＢＣＤ ｍｌ ｎ ａｏ ａｏ
Ｔｈ ｅ ｕｔｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｈ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｎ ｏ ｄ ｕ ａｇ ｎ ｔ ｓｔ ｅ ｍｏ ｔ ｍｐ ｒａ ｔ ａ ｔ ｒｉ ｒ ｄ ｃｎ ｈ ｔｓ ｎ ｅ ｂ ｅ ｒｓ ｌ ｈ ｗｅ ｈ ｔｔ ｅｃ ｎ ｅ ｔａ ｉ ｆ ｏ ｉ ｍ ｌ ｉ ａ ｅｗａ ｈ ｓ ｏ ｔｎ ｃ ｏ ｐ ｏ ｕ ｉ ｇｃ ｉ ａ ａ ｙ ｉ ｏ ｓ ｉ ｆ ｎ ｏ ｓ ｍ－
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【 ｂｔ ｃ】 Ｉ ｉｐｐｒｔｅｉｆ ｅｃｓ ｆｏｉｍ ａ ｉａ ｏｃｎｒｔ ｎ Ｃ Ｃ ｏｃｎｒｔ ｎ ｃｉ ｓｎｃｎｅｔ ｎ ｍ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｎｔ ｓ ａｅ，ｈ ｌ ｎｅ ｏ ｄｕ ｌ ｎ ｔ ｃｎｅ ｔ ｉ ，ａ ｈ ｃｎｅ ｔ ｉ ，ｈ ｏａ ｏ ｔ ｄｅ — ｈ ｎｕ ｓ ｇ ｅ ａｏ ａｏ ｔ ｎａ ｂｄｉｇｑ ａｔｙｏ ａｔ ｉ ｏ ｒｄｃｎ ｈｔ ａ ａｅｗｔ ｏｉｚｄｃｌ ｅ ｔｄ ｄｂ ｈ ｒ ｏｏａ ｔ ｔ （ ． ｅｄｎ ｕｎｉ ｆ ｃ ｒ ｎｐｏｕｉｇｃｉ ｓｎ ｉ ｉ ｔ ｂ ｅａ ｏ ｓ ｈ ｍｍ ｂｌｅ ｅｓｗ ｒ ｓ ｉ ｙｔｅｏｔ ｇｎｌｅ ３） ｉ ｌ ｅ ｕｅ ｈ ｓ
备 高活性 、 稳定 性强 、 地均 一 的壳 聚糖 酶是 甲壳 素 质 工业 中的关键 环节 ， 目前 壳 聚糖酶 的研 究 多集 中在 菌种 的筛选 与 游 离 细胞 产 酶 条 件 等 方 面 。 固定 １
重组烟曲霉壳聚糖酶在毕赤酵母中高密度发酵表达及性质研究
的、 相对分子质量 （ 即聚合成寡糖的单糖数量 ） 可控
的水溶性壳 聚糖 或壳寡 糖 引， 使 壳聚糖 的应用受 到极大 的限制． 壳聚糖 酶 （ Ｃ ｈ ｉ ｔ ｏ ｓ ａ ｎ ａ ｓ ｅ ， Ｅ Ｃ 。 ３ ． ２ 。 １ ．
１ ３ ２ ） （ ｃ ｓ ｎ ） 是酶法 制备壳寡 聚糖 的专一性酶 ， 可特 异性 的水解壳聚糖 ， 得到特异相对分子质量范 围的 壳寡聚糖． 在降解壳 聚糖 多聚物 和壳寡糖生产 中有 重要作用． 壳寡糖可提高人体免疫力 ， 抑制癌肿细胞 生长 ， 促进肝脾抗体形成 ， 促进钙及矿物质的吸收 ， 增殖乳酸菌、 双歧杆菌等有益菌群 ， 还有降血压 、 降
通信作者 ： 王曼莹（ １ ９ ４ ４ ． ） ， 女， 江 西南 昌人 ， 教授 ， 主要从事新资源 开发 与利 用方面的研究．
６ ０ ８
江 西 师到 ４ ２ ０ ０ Ｕ・ ｍＬ ～， 发 酵液 经乙醇浓缩 、 透析 和 阳离 子交换色谱 等步骤进 行分离纯
化， 获得 了纯度较高 的重组壳 聚糖酶． 该重组壳 聚糖 酶与野生型壳聚糖酶对 壳聚糖作 用模 式相 同， 其最终 产物均为壳 三糖 ， 且其最适作用 温度为 ６ Ｏ℃ ， 最适 ｐ Ｈ值为 ６ ． ０ ．
关键 词 ： 重组壳聚糖酶； 毕赤酵母 ； 高密度发酵
中图分 类号 ： Ｑ ７ ８ ６
文献 标 志码 ： Ａ
品工业 ， 就显 得尤 为重 要 ， 也 吸引 了各 国研究 机构 与
０ 引 言
壳聚糖 （ ｃ ｈ ｉ ｔ ｏ ｓ ａ ｎ ）是 由自然界广泛存在 的几 丁 质（ ｃ ｈ ｉ ｔ ｉ ｎ ） 经过脱 乙酰作用得到的， 化学名称为聚葡 萄糖胺 ［ （ １ － ４ ） 一 一 氨基１ Ｂ — Ｄ葡萄糖 ］ ， 它 只能溶 于一
被孢霉菌株产壳聚糖酶的诱变育种初探
Vol.28No.7Jul.2012赤峰学院学报（自然科学版）Journal of Chifeng University （Natural Science Edition ）第28卷第7期（上）2012年7月壳聚糖酶(chitosanase ，EC3.2.1.99)是一种不同于几丁质酶的新酶，这种酶不水解胶态几丁质，但能够水解完全脱乙酰化的壳聚糖，所以该酶被认为是专一性水解壳聚糖的酶[1].壳聚糖酶在工业上可用于壳寡糖(Chitooligosaccharides ，简称COSs)的制备，由于COSs 较好的水溶性，更利于人体吸收，因而COSs 在食品工业、医药、诊断试剂等方面前景广阔，特别是聚合度在5、6的COSs 具有较强的抗感染、抑制肿瘤的活性及抗菌作用，能对植物病原菌产生拮抗作用，诱导植物产生抗菌物质[2,3].但利用化学合成方法生产COSs 不仅产率低且生产成本较高、易污染环境，而使用专一性的壳聚糖酶降解生产COSs 却有着高效、环保等优势.从已报道的微生物产酶能力来看，目前获得的壳聚糖酶活性较低，纯品酶活一般都在5～250U/mg 之间[4].目前报道产酶活力最高的Streptomyces sp.N174的基因工程菌所产的发酵液粗酶液酶活为36.8U/mL.这也是目前唯一的商品化壳聚糖酶.壳聚糖原料来源广泛，其降解产物壳寡聚糖的应用非常广泛，有着及其广阔的应用前景[5,6].采用特异性的壳聚糖酶进行酶法降解壳聚糖制备壳寡聚糖可以大大降低传统工艺给环境带来的污染.随着研究的深入，人们对壳聚糖酶的作用方式和特点将会了解得更加透彻，从而给生产带来更大的经济效益.因此为了向医药工业生产提供更加廉价、高效的壳聚糖酶，在寻找不同微生物来源的壳聚糖酶，筛选产壳聚糖酶能力更强的菌株成为研究的热点,而诱变育种是筛选菌株最常用的方式之一.本文选用不同的诱变手段对被孢霉菌株产壳聚糖酶进行了初步研究.1材料与方法1.1菌种及培养基本实验由福清平潭海边土壤中筛选得到的产壳聚糖酶菌株，初步鉴定为真菌，经26SrDNA 鉴定与高山被孢霉的同源性较高，本文命名为M 1.固体诱导培养基：1%的壳聚糖、0.5%（NH 4）2SO 4、0.2%K 2HPO 4.3H 2O 、0.5%NaCl 、0.1%M g-SO 4.7H 2O 、0.1%酵母提取物、2%琼脂；pH6.5，在121℃灭菌20min.液体培养基：1%的水溶性壳聚糖、0.13%M g-SO 4.7H 2O 、0.14%K 2HPO 4.3H 2O 、0.03%KH 2PO 4、0.5%NaCl 、0.3%酵母提取物、1.87%(NH 4)2SO 4、0.1%葡萄糖；调pH6.5，在121℃灭菌20min.1.2实验方法1.2.1紫外线诱变处理用无菌接种环挑取M 1菌株少许于已灭菌的液体培养基中，放入摇床150r/min ，28~30℃培养72h ，取适量菌液于离心管中，在4000r/min 下离心10min ，取上清液，在相同条件下再离心一次，取上清液.用无菌水将孢子悬液稀释到107~108个/mL ，即制成孢子悬液.取5mL 孢子悬液置于培养皿内，放在电磁搅拌器上，紫外灯照射距离为30cm ，功率为15W ，照射时间分别为：0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5min （每个时间设定3次重复），再将诱变后的孢子悬液稀释到1.0×10-5个/mL 后，取0.1mL 涂平板，28℃避光培养72h ，计算致死率和正突变率，并挑透明圈大的菌落进行摇瓶培养，测菌被孢霉菌株产壳聚糖酶的诱变育种初探王艳君，危晓琴（福建师范大学福清分校生化系，福建福清350300）摘要：本研究以被孢霉菌株（Mortierella alpina ）为出发菌株，分别采用紫外线诱变、亚硝酸钠诱变及紫外线与亚硝酸钠的复合诱变方式对孢子悬浮液进行诱变处理.结果表明，在紫外线处理6min 后，酶活性高达8.657U/mL ，比出发菌株提高2.354倍；在亚硝酸钠处理8min 后，酶活性为6.081U/mL ，较之出发菌株提高1.658倍；在复合诱变的紫外照射6min 和亚硝酸钠处理8min 的情况下，酶活性高达9.141U/mL ，比出发菌株提高了2.493倍.关键词：被孢霉菌；紫外线诱变；亚硝酸钠诱变；复合诱变中图分类号：Ｑ９３３文献标识码：A文章编号：1673-260X （2012）07-0012-03基金项目：福建省自然科学基金项目（2010J05056）；福建省教育厅科技项目（JB10201）１２－－复合处理组数1234567紫外线照射时间（min ）0345678亚硝酸钠恒温水浴时间（min ）5678910表1复合诱变处理组实验设计株产壳聚糖酶活力[7].1.2.2亚硝酸钠诱变处理制孢子悬浮液方法同上.吸取1mL 0.1mol/L NaNO 2溶液于无菌250mL 带塞三角瓶中，加入8mL 单孢子悬浮液，最后加入lmL pH4.5的1mol/L 乙酸缓冲溶液并充分混合，置28℃恒温水浴，保温0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10min 后加入pH7.0磷酸缓冲液，再将诱变后的孢子悬液稀释到1.0×10-5个/mL 后，吸取0.1mL ，涂平板，28℃避光培养72h ，计算致死率和正突变率，并挑透明圈大的菌落进行摇瓶培养，测其酶活.1.2.3紫外照射和亚硝酸钠复合诱变处理取1mL 孢子悬液按1.2.2亚硝酸钠诱变处理后，按1.2.1紫外照射处理，再将诱变后的孢子悬液稀释到1.0×10-5个/mL 后，吸取0.1mL ，涂平板，28℃避光培养72h ，计算致死率和正突变率，并挑透明圈大的菌落进行摇瓶培养，测其酶活.致死率=对照1mL 菌液中活菌数-处理后1mL 菌液中活菌数×100%酶活性的测定采用DNS 法，取0.1mL 酶液、0.9mL 1%的壳聚糖溶液和1mL pH 值5.6的醋酸缓冲溶液，50℃下保温15min ，加入1.5mL DNS 终止酶促反应，沸水浴显色5min ，冷却后定容至25mL ，6000r/min 离心10min ，取上清液测520nm 处的OD 值.同法处理煮沸灭活的酶液作为对照，根据氨基葡萄糖标准曲线求出反应液中的还原糖含量，换算壳聚糖酶的活力.酶活定义为：每分钟产生1μmol 还原糖所需的酶量为一个壳聚糖酶活力单位(U).2结果与分析2.1紫外线诱变对M 1菌株酶活性的影响紫外线照射对被孢霉菌株M 1均有致死作用，结果如图1所示，致死率与作用时间成正比，即随着时间增长，致死率增大.照射1min 时，致死率为4%；照射8min 时，其致死率高达94.66%.紫外诱变后菌株的酶活性先升后降，结果如图2所示，当紫外照射6min 时，其活性为8.657U/mL ，为处理组中最高，比出发菌株提高2.354倍，而其致死率为86.66%，因此，确定紫外线诱变处理的最佳时间确定为6min.2.2亚硝酸钠诱变对M 1菌株的影响亚硝酸钠处理对被孢霉菌株M 1均有致死作用，结果如图3所示，致死率与作用时间成正比，即随时间增长，致死率增大.当恒温水浴的时间为1min 时，致死率为6.41%；恒温水浴的时间为10min 时，其致死率高达90.91%.酶活性先升后降（图4），当恒温水浴的时间为8min 时，其酶活性为6.081U ，为处理组中最高，比出发菌株提高1.658倍，而其致死率为76.71%，因此将亚硝酸钠诱变的最佳时间确定为8min.2.3复合诱变对被孢霉菌株M 1的影响紫外线照射和亚硝酸钠处理的最优时间分别为确定为6min 和8min ，故按照表1的处理时间，进行复合诱变处理.根据所得数据绘制出紫外照射时间与致死率、酶活性的关系曲线分别见图5、图6.由图5可知，复合诱变处理对被孢霉菌株M1图2紫外诱变后菌株的酶活性比较图4亚硝酸钠诱变处理后菌株酶活性的比较１３－－均有不同程度的致死作用，致死率与作用时间成正比，即随时间延长，致死率增大；且致死的强度更大.当紫外照射时间3min 、亚硝酸钠恒温水浴5min 时，其致死率已达到39.68%；当紫外照射时间8min 、亚硝酸钠恒温水浴10min 时，其致死率达到39.68%；当恒温水浴的时间为1min 时，致死率为6.41%；而当恒温水浴的时间为10min 时，其致死率高达94.66%.酶活性的变化趋势是先升后降，结果如图6所示，当紫外照射时间6min 、亚硝酸钠恒温水浴8min 时，其酶活性为9.141U ，为处理组中最高，其致死率为774.60%，相比单纯紫外照射6min 的诱变结果，酶活性提高了1.020倍；相比亚硝酸钠恒温水浴处理8min 的诱变结果，酶活性提高了1.503倍，相比出发菌株，酶活提高了2.493倍.3讨论微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以培育优质、高产的微生物菌株具有重要的现实意义.微生物育种的主要目的是人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种.诱变育种是获得优良菌株的较好方法，获得的正突变率相对较高，可以得到多种优良突变体和新的基因型.从本研究的结果分析，紫外照射诱变操作简单、成本低廉，且出现正突变的几率较高，诱变菌株的致死率和酶活性的效果较明显；而亚硝酸钠诱变育种的效果相对于紫外线诱变育种而言并没有明显的优势；复合诱变效果最为明显.梁亮[8]等以1株谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutam-icum ）S 6为出发菌株，利用紫外线（UV ）、亚硝酸钠（NaNO 2）、紫外线与亚硝酸钠复合诱变，并经过6-巯基嘌呤结构类似物的抗性平板筛选，最终筛得3株突变菌株，Y 1产量达到331mg/L,比出发菌株S 6高了5.08%，Z 1产L-组氨酸量达到325mg/L ，比出发菌株S 6高了1.9%，F 6产量达到330mg/L ，比出发菌株S 6高了7.14%.其研究结果显示，经紫外线与亚硝酸钠复合诱变后的菌株F 6产L-组氨酸的产量最高，比亚硝酸钠诱变后的菌株产L-组氨酸量提高2.06%，比紫外线诱变后的菌株产L-组氨酸量提高5.24%.刘春芬[9]等研究表明：紫外线、亚硝酸钠诱变因子对绿色木霉13010菌体细胞的致死作用表现出相似的趋势，在一定范围内都与诱变剂量呈线性正相关.在协同诱变条件下，多轮反复诱变绿色木霉13010后，菌株的酶活力有大幅提高，最终筛选得到了产纤维素酶活力单位提高了70.63%.本实验将物理因子和化学因子结合起来进行复合诱变，得到了理想的突变菌株.此外，我们正在尝试反复采用几种诱变因子进行多次诱变，以期得到更为理想的基因工程菌.———————————————————参考文献：〔1〕吴晓宗，王岁楼，郝莉花.壳聚糖酶的分类及其功能应用现状[J].食品工业科技,2005(8):189-192.〔2〕王扬，娄永江，杨文鸽.酶法制备几丁寡糖和壳聚糖研究现状与进展[J].东海海洋,2001(4):40-44.〔3〕YOL J 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壳聚糖复合涂膜在果蔬保鲜中的应用研究进展
壳聚糖复合涂膜在果蔬保鲜中的应用研究进展张洪;王明力;毛玉涛【摘要】Chitosan is safe and non-toxic to people, which has the advantages of biodegradability and strong antimicrobial activity as a natural food preservative. In recent years, the technology of chitosan coating has become a research focus on storage of fruits and vegetables. In this paper, the studies on application of chitosan in fresh-keeping of fruits and vegetables at home and abroad were reviewed. Moreover, the existing problems and development trends were proposed.%天然食品防腐剂壳聚糖具有易于生物降解、抗菌性强、安全无毒等优点.近年来,壳聚糖复合涂膜保鲜技术已成为保鲜领域的研究热点.笔者从壳聚糖与其他天然防腐剂的复合及改性壳聚糖在果蔬保鲜中的应用等方面,对国内外有关壳聚糖复合物保鲜应用的研究进行了综述,提出了现阶段壳聚糖复合物保鲜技术研究与应用中存在的问题及其今后的研究发展方向.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2011(039)010【总页数】4页(P149-152)【关键词】壳聚糖;复合膜;果蔬;保鲜;应用【作者】张洪;王明力;毛玉涛【作者单位】贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳550003;贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳550003;贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳550003【正文语种】中文【中图分类】S609.3壳聚糖是一种无毒无害可食用的天然物质，易于生物降解，有良好的生物相容性、成膜性和很强的抗菌保鲜防腐能力[1]，用于食品保鲜不存在安全隐患，故而在果蔬保鲜中得到广泛应用。
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3.2.壳聚糖酶的分离纯化
目前，壳聚糖酶常用的分离纯化方法有分级盐
析、凝胶过滤层析和离子交换层析等。我国在壳
聚糖酶分离纯化方面已经做了许多研究，如天津
科技大学通过硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25凝 胶过滤层析、DEAE Cellulose 52离子交换层析， 对曲霉TCCC45017产的壳聚糖酶进行分离纯化和 性质研究。得到的酶纯化倍数为57.21，回收率为
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3.壳聚糖酶的研究进展
3.1.壳聚糖酶的获取
近年来，科学家已从微生物中开发出了许多种
壳聚糖酶，但这些酶的生产成本普遍比较昂贵，
且难以实现商业化应用。目前研究公认大多数微
生物来源的壳聚糖酶属于诱导酶，基因表达大多 受阻遏物/诱导物系统控制，一般以壳聚糖为诱导 物，它们的降解产物为阻遏物。天然菌株产壳聚 糖酶的能力一般较低，因此现在大多都使用诱变
一周查看其储存稳定性。
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结果表明DEAE纤维素固定化壳聚糖酶的酶活 最高，储存稳定性最好(一周后酶活还高达原来的
93%)。而且将成品固定化酶重复使用10次，酶活
力损失小于15%，这些都表明该固定化酶具有较
好的操作稳定性。
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3.4.酶法制备壳寡糖的生产工艺
酶法制备壳寡糖常见的生产工艺流程如下：
育种以获取较为理想的壳聚糖酶。
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孙金凤[6]研究组以从自然界中筛选得到的一株
壳聚糖酶活为9.84 nkat/mL的芽孢杆菌属菌株为出
发菌株，经硫酸二乙酯（DES）诱变处理后，筛
选得到壳聚糖酶活明显提高的突变株DES-4，其 壳聚糖酶活为26.67 nkat/mL，是出发菌株的2.7倍。
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KOD1所产壳聚糖酶的耐热性很好，其最适反应
温度高达 80℃[4]。
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2.4．壳聚糖酶的分类
根据壳聚糖酶的作用模型可分为内切型和外切 型两种。内切型壳聚糖酶以释放二聚体、三聚体 或低聚糖为主，外切型则从壳聚糖的非还原末端 产生单糖残基-氨基葡萄糖[5]。壳聚糖酶对壳聚糖
的降解，产物一般为二至八糖的壳聚糖。
解形成的产物，具有较低的分子量，呈水溶性，
容易被机体吸收，是一种功能性低聚糖，具有壳 聚糖无法比拟的特性。
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研究发现，低分子量壳寡糖（如五糖、六糖）
具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特点，
这使其在功能食品、医药、化妆品等领域有着广 泛的应用前景[1] 。 现在制备壳寡糖的方法主要有两种：化学降解 法和酶解法。其中酶解法因条件温和、选择性高， 对环境污染小，产物安全性好，受到学术界越来 越多的重视与关注。如今，酶法水解壳聚糖制备
王艳[7]等曾以假单胞菌Y8.0为出发菌株，分别
通过亚硝基胍（NTG）、Co60、UV诱变，获得 的突变株Y8，其酶活力达到50.01 nkat/mL，提高 近6倍，并具有较好的遗传稳定性。 甘肃省天水师范学院利用紫外线诱变不同稀释
度的黑曲霉菌液后，筛选得到一株酶活力较强的
菌株A3，其酶活为52.34 nkat/mL，是出发菌株的 1.42倍[8]。
虾、蟹壳→洗净→脱钙→脱蛋白质→脱乙酰基→
酶解→精制→产品
生产过程大体可分为三个阶段。
制备甲壳素
生产壳聚糖
制取壳寡糖
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⑴ 制备甲壳素。由于虾、蟹壳中除了含有甲壳素成
分外，还含有钙和蛋白质等成分，所以先要用稀
盐酸溶去钙质，再用氢氧化钠溶液浸泡，煮沸除 去虾、蟹壳中的蛋白质；
⑵ 生产壳聚糖。用40%的NaOH溶液将甲壳素进行脱
壳寡糖已成为甲壳素领域的一个研究热点。
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壳聚糖酶是酶法水解壳聚糖制备壳寡糖的专一
性酶。本文综述了目前壳聚糖酶的研究概况，以
及通过酶法制取壳寡糖的发展现状，同时展望了 其应用前景。
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2.壳聚糖酶的简介
2.1．壳聚糖酶的概念
壳聚糖酶(chitosanase)是分解壳聚糖的专一性酶， 是20世纪70年代初发现的一种新酶。它是由 Monaghan于1973年在研究细菌和真菌过程中首先 提出来的。壳聚糖酶不同于几丁质酶，它能够降
26.55%，比活力提高至578.55U/mg[9]。
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3.3.壳聚糖酶的固定化
对于壳聚糖酶的研究应用来说，固定化是一个
重要的研究方向。浙江大学以 DEAE 纤维素为载
体，戊二醛为交联剂，对固定壳聚糖酶进行研究。
将0.1g 精制的载体与5mL 5%戊二醛交联后加入 30mg 壳聚糖酶固定化，然后用DNS法分别测定固 定化前溶液的总酶活、固定化后溶液的总酶活以 及固定化酶的总酶活，再将固定化酶在4℃下储存
乙酰基处理，生产出的壳聚糖，由于其分子量高，
虽然能溶于稀酸，但难溶于水；
⑶ 制取壳寡糖。将脱去乙酰基的壳聚糖用壳聚糖酶
降解，制取壳寡糖。
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解完全脱乙酰化的壳聚糖，生成壳寡糖。
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2.2．壳糖酶的分布
壳聚糖酶在细菌、真菌和病毒等微生物类群中 均有存在，但大多数微生物产壳聚糖酶的活性低， 分离和提纯的技术比较复杂，使生产成本相对较 高，从而影响壳聚糖的酶法生产。
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2.3．壳聚糖酶的理化性质
微生物壳聚糖酶的分子质量一般为10～50ku。 同时也存在少数分子量较高的壳聚糖酶，如曲霉 Aspergillussp CJ-22-326合成两种壳聚糖酶，其中 外切酶的相对分子质量高达109ku[2]，另一种由
Trichoderma reesei PC-3-7合成的外切壳聚糖酶的
相对分子质量也有93ku[3]。
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壳聚糖酶大部分为碱性蛋白，等电点(pI)变化范
围比较大，在4.0～10.1之间。大多数微生物的壳 聚糖酶具有较好的热稳定性，且最适反应温度一
般为30～70℃， 如Thermococcu skodakaraensis
壳聚糖酶的研究进展
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目 录
1.前言
2.壳聚糖酶的简介 3.壳聚糖酶的研究进展
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1.前言
壳聚糖(chitosan)是由D- 氨基葡萄糖通过β-１， ４糖苷键连接而成的线性多糖，由于其相对分子 量较大，不易溶于水，在机体内不易被吸收，使
其应用受到很大限制。
壳寡糖(chitooligosaccharides)是壳聚糖进一步降