蛋白质工程的主要研究方法和进展
蛋白质结构与功能的研究方法与进展
蛋白质结构与功能的研究方法与进展蛋白质分子是生物体内最为重要的一类分子，拥有着各种各样的功能，比如酶的催化、信号转导、免疫防御等等。
研究蛋白质分子的结构与功能是生物学研究的重要方向之一，因为其对相应疾病的诊断和治疗、药物开发等方面具有非常重要的价值。
蛋白质分子的结构与功能之间有着很强的相关性，因为蛋白质的结构直接决定了其功能。
那么，如何研究蛋白质的结构与功能呢？本文将会重点介绍蛋白质结构与功能的研究方法与进展。
一、基于生物物理学的研究方法生物物理学是研究生物体内分子结构与功能的学科领域之一，它主要涉及到物理、化学、生物学等领域的知识，可以用于研究蛋白质分子结构与功能。
最为著名的研究方法之一是X射线晶体学。
1. X射线晶体学X射线晶体学是研究分子结构的重要手段之一，它是通过将晶体中的蛋白质分子放大来研究蛋白质的结构。
这个技术需要的是高质量的晶体样品，因为只有在晶体样品的存在下，X射线才能形成衍射斑图，从而得到分子的三维结构。
这种方法的优点是能够提供高分辨率的结构信息，但需要的样品纯度、稳定性和晶体形成能力就较高。
2. 核磁共振技术核磁共振技术是一种无损检测分子结构的方法，它可以提供比X射线晶体学更加全面的信息。
通过测量分子的的核磁共振谱，可以得到分子结构中各个原子核的位置和运动形态等各种信息。
然而，这种技术常常需要用到高浓度的蛋白质样品，而且数据的处理过程相对来说比较复杂。
二、基于生物化学的研究方法生物化学主要研究生命体系中的化学反应，通过实验室技术来研究分子的结构、功能等方面。
其中比较重要的方法有：1. 蛋白质纯化蛋白质纯化是蛋白质研究中的基本工具，通过不同的手段，将混合的蛋白质分离出来并获取单独的蛋白质分子。
这个过程中需要分析样品本身的特性，如性状、水溶性、静电特性等，标准化不同的分离方法，一般情况下要对同一个样品进行多次提取以获得可用的纯品。
2. 胶质电泳胶质电泳是将样品在凝胶中进行分离的一种技术，通过不同的电场和凝胶媒介，将蛋白质样品在空间上进行分离。
蛋白质工程的研究与进展
蛋白质工程的研究与进展蛋白质工程的研究与进展摘要：蛋白质是生命的体现者离开了蛋白质生命将不复存在。
蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。
它所取得的进展向人们展示出诱人的前景。
关键词：蛋白质工程；研究；进展；蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。
蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。
1、蛋白质工程1.1蛋白质工程的定义所谓蛋白质工程就是利用基因工程手段包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。
1.2蛋白质工程的由来蛋白质工程是在基因工程冲击下应运而生的。
基因工程的研究与开发是以遗传基因即脱氧核糖核酸为内容的。
这种生物大分子的研究与开发诱发了另一个生物大分子蛋白质的研究与开发。
这就是蛋白质工程的由来。
它是以蛋白质的结构及其功能为基础通过基因修饰和基因合成对现存蛋白质加以改造组建成新型蛋白质的现代生物技术。
这种新型蛋白质必须是更符合人类的需要。
因此有学者称蛋白质工程是第二代基因工程。
其基本实施目标是运用基因工程的DN A重组技术将克隆后的基因编码加以改造或者人工组装成新的基因再将上述基因通过载体引入挑选的宿主系统内进行表达从而产生符合人类设计需要的“突变型”蛋白质分子。
这种蛋白质分子只有表达了人类需要的性状才算是实现了蛋白质工程的目标。
1.3蛋白质工程的原理由于基因工程的发展人们已经可以运用基因重组等理论和方法去设计并制造出预想的各种性能的蛋白质。
这种改变蛋白质的操作可以在蛋白质水平上也可以在基因水平上。
如基因水平的改变是在功能基因开发的基础上对编码蛋白质的基因进行改造小到可改变一个核昔酸大到可以加入或消除某一结构的编码序列。
蛋白质水平的改变则主要是对制造出的蛋白质进行加工、修饰如磷酸化、糖基化等。
蛋白质工程的新方法与新模型
蛋白质工程的新方法与新模型蛋白质工程是一项非常重要的研究领域，它是基于分子生物学的技术手段，对于蛋白质的丰富性、多样性和功能性进行探究并开发新的技术方法。
在传统的蛋白质工程方法中，通常采用点突变、敲除或添加伪基因等手段，来使蛋白质的特性发生变化。
但是，这些方法有时效果不显著，且存在着生产难度较大的问题。
为此，近年来，一些新的蛋白质工程方法已经被提出并应用于实际生产中，以期改善产品质量和提高生产效率。
一、自适应蛋白质工程方法自适应蛋白质工程方法是近年来被提出的一种新型蛋白质工程策略。
这种方法基于对于细胞生长环境变化的自适应调节机制，让蛋白质自动地适应外界调节变化。
这种方法能够显著地提高蛋白质质量、产量和稳定性，同时丰富蛋白质功能。
自适应蛋白质工程方法的核心技术是蛋白质折叠调节器（Protein Foldiing Regulator，PFR），即一种具备对蛋白质结构进行自动调节的蛋白质结构调节器。
PFR通过识别、分离和折叠蛋白质，调节其空间构形来自适应环境变化。
这种方法可以用于改善蛋白质的稳定性、结构和功能，并提高生产效率。
二、结构生物学和计算机模拟另一方面，结构生物学和计算机模拟技术也成为了蛋白质工程的新型研究方法。
结构生物学通过解析蛋白质三维结构，揭示蛋白质分子之间的互动机制，以及蛋白质功能的基础多样性。
结构生物学的最大优势在于可以以原子级别理解蛋白质结构和功能，并提供了新的突破蛋白质工程的方法和方案。
同时，计算机模拟技术也成为了蛋白质工程的重要手段。
其可以通过大规模的互动性网络分析来建立高效、智能的蛋白质预测模型，以优化蛋白质的研究和工程。
这种技术可以通过大量计算实现大量数据并行计算，以实现更快的分子动力学模拟、分子建模和虚拟药物筛选。
三、多样性开发和低成本生产近年来，为了开发更多样化的蛋白质和提高生产效率，新型的蛋白质生产方法不断涌现，例如基因重组技术（Gene Recombination），人源化（Humanization）等等。
蛋白质工程技术的研究进展
蛋白质工程技术的研究进展蛋白质是生命体中重要的大分子有机化合物。
它们扮演着许多生物过程中至关重要的角色，例如结构成分、催化反应等等。
因此，蛋白质在医学诊断、药物研发以及工业生产等领域都具有极高的使用价值。
近年来，蛋白质工程技术不断取得进展，成为蛋白质应用研究的重要手段。
蛋白质工程技术的基础是分子生物学和生物化学，目的是通过改变蛋白质的结构和功能，使其适应特殊的应用需求。
它包括构筑新蛋白质、改良已有蛋白质和研究蛋白质的分子机制等方面。
目前，常用的蛋白质工程技术主要包括基因工程、蛋白质纯化、生物反应器的建设和高通量筛选技术等。
其中，基因工程是蛋白质工程技术的核心和基础，其主要方法包括PCR扩增、定点突变、拼接等。
通过基因工程技术，人们可以快速构建出自己想要的蛋白质序列，并进行高效稳定的表达和纯化。
生物反应器建设是蛋白质工程技术中至关重要的一环。
在生物反应器中，我们可以控制温度、气氛、营养物等条件，获得稳定的菌群并在其内进行目标蛋白质的表达。
由于不同的蛋白质在构造、结构和性质上存在差异，因此在生产过程中应考虑不同的生产策略，选择不同的产生菌株，并对其进行优化改良。
高通量筛选技术是蛋白质工程技术中的前沿方向之一。
通过高通量筛选，可以在每次实验中同时测试大量的样品，快速选出符合要求的目标蛋白质。
目前，高通量筛选技术已广泛运用于抗体制备、药物筛选、蛋白质交互作用研究等方面。
蛋白质工程技术的广泛应用使之成为制药和工业领域的关键技术。
比如，基因工程菌生产的重组生物制剂具有高效、安全的特性，被广泛用于癌症治疗、传染病治疗、生物制剂等诊断和治疗领域。
此外，蛋白质工程技术还可以帮助制定更好的食品加工工艺等。
随着研究的深入，蛋白质工程技术仍然面临着很多挑战。
蛋白质工程中的问题包括蛋白质表达的不稳定性、蛋白质极性对稳定性和活性的影响、产物的低产率、低纯度等等。
未来，蛋白质工程技术需要进一步发展以解决这些问题，使其更好的适应实际应用需求。
蛋白质工程技术的研究与应用
蛋白质工程技术的研究与应用近年来，随着科技的不断发展和进步，人们对于生命科学的研究和应用越来越深入，其中一个重要的方向就是蛋白质工程技术。
蛋白质作为生命体的基本组成部分，它的研究和应用一直是生命科学领域的重要课题，而蛋白质工程技术的出现，则为人们提供了更多的可能性和发展空间。
一、蛋白质工程技术的研究和发展蛋白质工程技术是指对蛋白质分子进行人工改造和设计，使其具有更符合人类需求的性质、结构和功能的技术。
这种技术主要通过对蛋白质分子的基因序列、空间构象、化学结构等方面进行调整和改变，从而获得具备特定功能或性质的新型蛋白质。
蛋白质工程技术的研究和发展已经成为了当今生命科学领域的热点之一。
目前，蛋白质工程技术主要包括以下几种类型：1. 蛋白质表达与纯化技术。
这是蛋白质工程技术中最基础的一种类型，它主要是通过对蛋白质基因进行重组和表达，在细胞内大量生产目标蛋白质，并对其进行提纯和纯化，从而获得高品质的蛋白质样品。
2. 蛋白质结构与构象解析技术。
这种技术主要是通过利用X射线晶体学、核磁共振等技术手段对蛋白质样品的结构和构象进行精细分析和解析，从而了解其在三维空间中的构成和结构特点。
3. 蛋白质设计与改造技术。
这种技术主要是通过对蛋白质基因和分子结构进行人工设计和改造，从而获得具有一定特殊功能或属性的新型蛋白质。
二、蛋白质工程技术的应用蛋白质工程技术的应用领域非常广泛，涵盖了生物制药、生物能源、生物催化、食品、保健品等多个领域。
下面简单介绍一下其中几个比较重要的应用领域。
1. 生物制药领域。
蛋白质工程技术在生物制药领域的应用非常广泛，可以用于生产各种治疗性蛋白质、抗体、酶等生物制剂，从而为临床治疗提供更好的选择和有效的帮助。
2. 生物能源领域。
蛋白质工程技术可以用于生产能量生产生物质，如生物柴油、生物气和生物酒精等，从而代替传统的化石能源，降低对环境的污染和损害。
3. 食品和保健品领域。
蛋白质工程技术可以用于生产具有特殊功能的新型蛋白质，如特殊食品原料、保健品成分等。
蛋白质研究新进展及其应用
蛋白质研究新进展及其应用随着生物技术的不断发展和进步，蛋白质研究也越来越受到研究人员的关注。
蛋白质是生命体的基本组成部分，包括酶、激素、抗体以及细胞膜等。
因此，研究蛋白质结构和功能的新进展，对于人类疾病的治疗和基础研究领域具有重要意义。
一、新型蛋白质纯化方法的研究及应用传统的蛋白质纯化方法主要是离子交换、凝胶过滤、亲和层析等技术，但这些方法存在一定的缺陷：需要使用大量试剂，操作繁琐，时间长且复杂等。
为了解决这些问题，研究人员开发了一系列新型蛋白质纯化方法，如反相高效液相色谱、气相色谱-质谱联用法等。
这些方法不但提高了蛋白质分离的效率和准确性，而且减少了副产物的产生，大大降低了成本。
此外，蛋白质纯化技术还应用于制药领域。
对于药品的研发过程中，蛋白质纯化是一个必不可少的环节。
纯化后的蛋白质可用于生物制药，比如重组蛋白和抗体等，这些药物已成为当今医疗领域不可或缺的一环。
二、蛋白质组学的发展及其应用蛋白质组学是指通过分析细胞或组织中所有蛋白质的表达谱来研究复杂生物系统的功能和生理病理机制的一种高通量技术。
随着蛋白质组学技术的不断发展，其在人类卫生领域的应用越来越广泛。
在疾病治疗方面，蛋白质组学技术可以用于寻找疾病标记物，辅助诊断和治疗疾病。
比如，在肿瘤的研究中，人们利用蛋白质组学技术分析了癌细胞和正常细胞的蛋白质组差异，从而发现许多与癌症相关的新标记物，这些标记物可以作为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。
三、基因编辑和蛋白质工程技术在蛋白质研究中的应用基因编辑和蛋白质工程技术是当今生物技术领域的热点研究方向之一。
通过基因编辑技术，研究人员不仅可以快速、准确地改变目标基因的序列，从而影响蛋白质的表达和功能，还可以用这些新编码的基因在大量表达系统中高效表达蛋白质。
这些基因编辑和蛋白质工程技术的应用，让蛋白质研究更加高效和精确。
基因编辑和蛋白质工程技术还应用于生物制药领域。
通过对生物制药蛋白质进行改造和改良，可以提高生物制药的效率和质量，从而减少生产成本和提高输出效率。
生物学中的蛋白质工程技术
生物学中的蛋白质工程技术在生物学中，蛋白质是一类非常重要的生物大分子，它们负责细胞内许多生化反应的调节和催化，也是许多药物、酶工业和生物技术的基础原料。
而蛋白质工程技术是一项重要的科学技术，它可以对蛋白质进行改造和设计，以实现一些特定的功能或应用。
本文将介绍蛋白质工程技术的基本原理、主要方法和应用前景。
一、蛋白质工程技术的基本原理蛋白质工程技术是一项通过改造蛋白质的基本结构和性质，使其获得特定的物理、化学或生物学功能的技术。
其基本原理是通过对蛋白质结构的了解和对遗传工程技术的应用，实现对蛋白质分子的改造和设计。
这种技术可以通过改变蛋白质分子的氨基酸序列，以达到改变蛋白质结构和功能的目的。
二、蛋白质工程技术的主要方法1、随机突变法随机突变法是蛋白质工程中最常用的方法之一。
通过对蛋白质分子的基因进行随机突变，可以得到一系列具有不同性质的蛋白质分子，进而筛选出具有特定性质的蛋白质分子。
2、有针对性的突变法有针对性的突变法是在随机突变法的基础上进一步发展而来的。
它利用已知的蛋白质结构和功能信息，针对特定的氨基酸进行有针对性的突变，以实现改变蛋白质结构和功能的目的。
3、融合蛋白质法融合蛋白质法是利用已知的蛋白质分子和一些特定的蛋白质分子结合起来形成一个新的蛋白质分子。
这种新的蛋白质分子通常具有比原有的蛋白质分子更强的结构稳定性和更高的活性。
4、基因重组技术基因重组技术是一种在分子水平上对DNA序列进行编辑的技术。
利用基因重组技术，可以将两个或更多不同来源的蛋白质分子结合起来，通过重组和修饰形成新的蛋白质分子。
这种技术通常包括PCR扩增、互补DNA靶向插入、基因拆分、取代、插入等多种技术方法。
三、蛋白质工程技术的应用前景蛋白质工程技术具有广泛的应用前景，尤其是在生命科学和生物技术领域。
具体包括以下几个方面：1、药物和医疗用途蛋白质工程技术可以用于生产或改造一些具有特定功能的蛋白质，如适体、抗体、酶、生长因子等。
蛋白质工程的主要研究方法和进展
蛋白质工程的主要研究方法和进展李 强 施碧红* 罗晓蕾 左祖祯 邢佩佩 刘 璐(福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108)摘 要:蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。
介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。
关键词:蛋白质工程;定点诱变;定向进化中图分类号 Q816 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)05-47-02Advances in The Techni q ues of P rotein EngineeringL i Q iang et al (Co llege o f L ife Sc iences,Fu jian N or m a lU n i versity,Fuzhou350108,Chi na)Ab strac t:P ro tein eng ineer i ng is a techn i que used to i m prove prote i n m o l ecular In th i s paper,seve ra l m ethods and t he ir pr i nci p les and their advantag es f o r m olecu lar m odifica ti on have been rev ie w edK ey words:P rote i n eng i neer i ng;site-d i rected m utag enesis;d irected evoluti on20世纪70年代以来,对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域,通过对蛋白质分子进行突变,得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。
蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。
1 理性进化理性进化主要是利用定点诱变技术,通过在已知D NA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。
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蛋白质工程的主要研究方法和进展李 强 施碧红* 罗晓蕾 左祖祯 邢佩佩 刘 璐(福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108)摘 要:蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。
介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。
关键词:蛋白质工程;定点诱变;定向进化中图分类号 Q816 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)05-47-02Advances in The Techni q ues of P rotein EngineeringL i Q iang et al (Co llege o f L ife Sc iences,Fu jian N or m a lU n i versity,Fuzhou350108,Chi na)Ab strac t:P ro tein eng ineer i ng is a techn i que used to i m prove prote i n m o l ecular In th i s paper,seve ra l m ethods and t he ir pr i nci p les and their advantag es f o r m olecu lar m odifica ti on have been rev ie w edK ey words:P rote i n eng i neer i ng;site-d i rected m utag enesis;d irected evoluti on20世纪70年代以来,对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域,通过对蛋白质分子进行突变,得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。
蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。
1 理性进化理性进化主要是利用定点诱变技术,通过在已知D NA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。
运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。
M arkus Rot h通过同源性比对和定点突变技术,对E c o R DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍[1]。
定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。
酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键,Cahoo 通过定点突变研究,发现将五个氨基酸残基置换之后的酶,由 6-16:0-ACP脱氢酶变成 9-18:0-ACP脱氢酶[2]。
Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacill us stear other m oph il us分离出来的嗜热菌蛋白酶突变,得到的突变体稳定性提高了8倍,100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用[3],但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构,从而造成很大的影响[4],所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术,用于改造蛋白质分子。
2 非理性进化非理性蛋白质进化,又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程,利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性,结合高通量筛选技术,使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。
这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质,而是人为地制造进化条件,在体外对酶的编码基因进行改造,定向筛选,获得具有预期特征的改良酶,在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足,具有很大的实际应用价值。
一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。
绿色荧光蛋白由于本身独特的发光性质,被应用到细胞生物学当中,作为体内原位跟踪蛋白质的一个极其有效的工具。
D i sc oso m a红色荧光蛋白(Ds R ed)在荧光共振能量转移技术(fl uoresce nce resonance e ner gy tr ansfer)中可以和绿色荧光蛋白一起作用,作为研究两种蛋白质相互作用的有效工具,但是野生型的D s Red由于显色速率较慢,而且稳定性较差,B r oo ke B evi s建立随机突变文库,在103-105个转化子中筛选到了大大提高显色效率的突变体,使显色效率提高了10-15倍[5-6]。
易错PCR是利用DNA聚合酶不具有3 -5 校对功能的性质,在PCR扩增待进化酶基因的反应中,使用低保真度的聚合酶,改变四种d NTP的比例,加入锰离子并增加镁离子的浓度,使DNA聚合酶以较低的比率向目的基因中随机引入突变,并构建突变库。
M oor e等对鼠伤寒沙门菌Sal m onella t yph m i uri u m产生的门冬氨酰二肽酶(asp-art yld i pepti dase)进行改良,经两次易错PCR引入随机突变,并结合D NA改组和正向选择筛选,得到的pepEm3074突变株,其酶活力比野生菌提高47倍[7]。
D NA改组(DNA shuffli ng)技术克服了随机突变的随机性较大的限制,能够直接将多条基因的有利突变直接重组到一起,它的原理是使用D N ase 酶切或超声波断裂多条具有一定同源关系的蛋白编码基因,这些小片段随机出现部分片段的重叠,产生的片段在不加引物的情况下进行几轮PCR,通过随机的自身引导或在组装PCR过程中重47安徽农学通报,Anhu iAgri Sci Bu ll 2009,15(5)作者简介:李强(1983-),男,辽宁抚顺人,硕士研究生,研究方向:分子遗传育种。
*通讯作者 收稿日期:2009-01-15新组装成全长的基因,由于存在不同的模板,使得到的全长基因具有不同谱系之间的重组,再进行最后一轮PCR,加入全长引物,扩增得到改造过的全长基因。
利用D NA 改组已成功进化了编码 -内酰胺酶、 -葡萄糖苷酶、脂肪酶、绿色荧光蛋白、烷基转移酶、苯甲基脂酶基因以及编码砷酸盐和阿特拉津降解酶的整个操纵子[8]。
在DNA改组技术的基础上又发展出外显子改组(e x-on shu ffli ng)和家族改组(fa m il y shuffli ng)。
外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动,而使D NA改组不受任何限制,发生在整个基因片段上,更适用于真核生物,并可获得各种大小的随机文库。
交错延伸重组(stagger ed e xtens i on p r ocess,S t EP)是一种简化的DNA shu ffli ng方法,是在PCR反应中,将含不同点突变的模板混合,随之进行多轮变性、短暂复性及延伸反应,在每一轮中,那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸,由于模板转换而实现不同模板间的重组,如此重复直至获得全长基因片段[9]。
RPR法(Rando m-P rm i ing R e-co m b i nati on DNA Shu ffli ng)是以单链DNA为模板,配合一套随机序列引物,先产生大量互补于模板不同位点的短D NA片段,由于碱基的错配和错误引发,这些短D NA片段中也会有少量的点突变,在随后的PCR反应中,它们互为引物进行合成,伴随组合,再组装成完整的基因长度[10]。
过渡模板随机嵌合(r ando m c h m i era ge nes i s on tran-sie n t te m p l ates,AC H I TT)技术是改进的基因改组技术,不包括热循环、链转移或交错延伸反应,而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时DNA模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接,其中的悬垂切割步骤可使短片段得以重组,提高重组的频率和密度[11]。
发酵过程常常由于微生物对温度、p H、溶液的影响而导致产量低,微生物的自身调控系统十分复杂和精细,致使单个基因的突变很难对其产生某种产物的能力造成影响,因此,对微生物的进化要在整个基因组的水平上进行才能起到有效的作用,于是出现了一种叫全基因组改组(W hole-Geno m e Shu ffli ng)的技术,它结合了D NA shuf-f li ng和传统的育种技术的优点,传统的育种技术耗时较长,经常由于亲本的相容性不好而影响育种效果,而且实验过程完全可以用随机突变和筛选文库来完成,Zhang等从能产泰乐菌素的Str epto m yces fradiae的改造过程中证明了这种方法可以快速改善泰乐菌素的产量[12],R anjan Pa-t nai k比较了传统育种方法和基因组改组技术之后,发现乳酸菌Lact obacillus能在p H4 0的条件下产出比野生菌株多三倍的乳酸,而传统育种方法明显没有基因组改组取得的效果好[13]。
体外异源杂交和体内修复,这种方法首先在体外进行异源杂交DNA双链,转化细菌,在胞内完成修复,同时产生出一种新的以亲本D NA为模板的杂交DNA文库,这是对DNA Shuffli ng等已存在的基因重组方法的补充,特别适用于大片段DNA和整个操作子的重组[14],但是这种方法需要亲本基因具有极高的同源性,而且每次重组只能进行两个亲本,这也在一定程度上限制了它的应用。
通过同源重组或随机突变产生的蛋白突变体一定程度上都是依照模板蛋白进行的,它们与模板蛋白的相似程度较大,而非同源重组(N onho m ol ogous Reco m b i nati on)能够产生完全不同于模板的新的蛋白质,新的蛋白可能在自然界中并不存在,为研究进化蛋白提供了潜在的可能性,很多种方法可以进行非同源重组,如杂交酶递增切断技术(Incre m ental truncati on for the cr eati on of hybri d enzy m es, I TCHY)[15]可以产生由基因氨基端和羧基端杂交形成的嵌合体基因库。
该法首先用核酸外切酶 代替DN ase 分别消化两种基因建立I TCHY库(I TL s),对靶序列末端基因完全删除,并通过降低切断温度、改变消化缓冲液浓度和加入酶抑制剂等方法改变外切酶在37 消化过快的问题。
最后将两种I TLs混合后进行DNA改组建立SCRATC HY库(shu ffled I TC HY li b r aries)。
这项技术降低了家族改组对同源性的要求,使家族D NA改组的概念和应用得到了进一步深化和延伸,并在其他领域得到有效的运用。
G ris w ol d等将序列同源性仅54 3%、且对底物的专一性不同的人类和大白鼠 类GS T酶进行家族改组,利用I TCHY技术对两者的同源编码基因进行融合重组,获得的重组表达蛋白SCR23活性是人类 类GST酶的300倍,同时突变体酶还获得了催化谷胱甘肽和利尿酸结合的合成酶活性[16]。