猪血红蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)
《血红蛋白的提取和分离》名师教案
专题5 DNA与蛋白质技术课题5.3 血红蛋白的提取和分离辉县市第二高级中学李艳琴一、【课题目标】知识与能力目标1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白。
2、说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
学科素养1、基础知识（从血液中提取和分离血红蛋白；色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理）；2、基本技能（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤，培养学生理论联系实际的能力）；3、基本思想（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神）；4、基本活动经验（通过色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理的学习，关注学生科学态度的教育，拓展学生视野）。
二、【课题重点】凝胶色谱法的原理和方法三、【课题难点】样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填四、【教学方法】启发式教学五、【教学工具】多媒体课件六、【教学过程】（一）引入新课蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。
对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。
所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。
怎样提取蛋白质呢？（二）进行新课1．基础知识蛋白质的理化性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1.1凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：（图5－13b）混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
1.2缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
猪血清蛋白的提取与分级盐析
猪血清蛋白的提取与分级盐析猪血清蛋白是指从猪的血液中提取出的一类蛋白质。
猪血清蛋白在生物医药领域有很广泛的应用，具有抗菌、抗病毒、促进伤口愈合等多种生物学功能。
提取猪血清蛋白的方法有多种，其中最常用的是分级盐析法。
分级盐析法是在梯度浓度的溶液中，利用蛋白质在不同盐浓度下的沉淀性质，将蛋白质按照不同的分子大小进行分级分离的方法。
分级盐析法可以通过调节盐浓度和pH值来实现对蛋白质的分离。
在实验过程中，首先要选择合适的盐，通常使用的有氯化铵、硫酸铵等。
接下来是设定梯度溶液的盐浓度和pH值，通常是从低浓度的盐溶液到高浓度的盐溶液，同时根据蛋白质的等电点来调节pH值。
分级盐析的实验步骤如下：1.首先准备好所需的实验仪器，包括pH计、离心机、显微镜等。
2.将猪血液收集到干净的容器中，然后进行离心分离，分离出血浆。
3.将血浆转移到离心管中，使用高速离心将血浆中的红细胞沉淀。
4.取出上清液，加入盐溶液，然后将溶液pH值调节到合适的范围。
根据蛋白质的等电点，选择合适的pH值，使得蛋白质带有电荷，有利于分离。
5.将设定好盐浓度和pH值的梯度溶液按顺序加入离心管中。
6.使用离心机将离心管进行离心操作，通过离心将不同分子大小的蛋白质分离出来。
7.将离心后的上清液收集，并进行蛋白浓度的分析。
8.最后根据蛋白质的功能和应用需求，对不同分级的蛋白质进行进一步的分离和纯化。
分级盐析的优点是简单易行，操作方便，不需要复杂的设备和试剂。
同时，分级盐析还可用于分离其他生物大分子，如蛋白质复合物、DNA和RNA等。
然而，分级盐析也有一些不足之处。
首先，它只能实现基于分子大小的分级分离，对于相似分子大小的蛋白质可能无法有效分离。
其次，分级盐析法可能存在某些蛋白质聚集成球状和沉淀问题，导致损失较大。
总的来说，猪血清蛋白的提取与分级盐析是一种常用的方法，能够有效分离出不同大小的蛋白质。
通过调节盐浓度和pH值，可以实现对猪血清蛋白的分级分离，为后续的纯化和应用提供了基础。
《血红蛋白的提取和分离》 讲义
《血红蛋白的提取和分离》讲义一、血红蛋白的简介血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。
它存在于红细胞中，使血液呈现红色。
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，其功能主要是将氧气从肺部输送到身体的各个组织，并将二氧化碳从组织带回肺部排出。
了解血红蛋白的结构和功能对于我们进行其提取和分离的研究具有重要意义。
二、血红蛋白提取和分离的原理1、凝胶色谱法凝胶色谱法也称分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，当不同相对分子质量的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
这样，相对分子质量不同的蛋白质就得以分离。
2、电泳法电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
在一定的 pH 下，蛋白质分子会带上电荷，由于不同蛋白质分子所带电荷的性质和数量不同，以及分子大小不同，在电场中的迁移速度也就不同，从而实现蛋白质的分离。
三、血红蛋白提取和分离的实验材料和用具1、实验材料新鲜的血液（通常选用哺乳动物的血液，如猪、牛等）2、实验用具（1）色谱柱：用于凝胶色谱法分离血红蛋白。
（2）电泳装置：包括电泳槽、电源等，用于电泳分离。
（3）离心机：用于离心分离血细胞和血浆。
（4）透析袋：用于去除小分子杂质。
四、血红蛋白提取和分离的实验步骤1、样品处理（1）采集新鲜血液，加入柠檬酸钠防止血液凝固。
（2）低速短时间离心，将血液分为血浆和血细胞两部分。
（3）向血细胞中加入蒸馏水，使红细胞吸水涨破，释放出血红蛋白。
2、粗分离（1）将混合液高速长时间离心，除去细胞膜等杂质，得到血红蛋白溶液。
（2）将血红蛋白溶液装入透析袋中，放入磷酸缓冲液中透析，以除去小分子杂质。
3、纯化（1）凝胶色谱操作装填凝胶色谱柱：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，避免出现气泡。
猪血清白蛋白的分离纯化与鉴定课件
编号
溶液名称
12%分离胶 4%浓缩胶
1 30% Acr –0.8% Bis
2 pH 8.9 Tris -HCI
3 pH 6.7 Tris- HCI
4 10%SDS
5 TEMED
6 10%AP
7
H2O
总体积
2.0ml 1.25ml
100ul 2.5ul 50ul 1.65ml 约5 mL
0.33ml -
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原理与操作
血清的制备
白蛋白的分离
留样：2，3
留样：1
留样：4,…
白蛋白的纯化
白蛋白纯度的 检测
蛋白质含量的 白蛋白的相对分
测定
子质量的测定
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一、血清白蛋白的分离
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DEAE-纤维素离子交换层析：
1. 装柱：将层析柱垂直固定。将DEAE-纤维素装入柱
内，至8-10cm高度，平衡过夜；
2. 洗脱液流速调节为 1mL/min； 3. 上样：将透析袋剪开，用移液管转至层析柱内，待
样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进 入胶内；
• 层析洗脱，可以采用保持洗脱液成分一直
不变的方式洗脱，也可采用改变洗脱的盐 浓度和（或）pH的方式洗脱，后一种方式 又可以分为两种：一种是跳跃式的分段改 变（梯度洗脱），另一种是渐进式的连续 改变（连续洗脱）。
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血红蛋白的分离和提取
答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便 于进行DNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞 无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便 于提取血红蛋白。
一、基础知识：
（一）蛋白质分离原理
（二）蛋白质分离的方法
1）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法
（三）缓冲液的作用
二、实验操作－－实验步骤 注意事项
血液组成成分
5、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不
同蛋白质的电泳迁移率完全取决于
A 电荷的多少
B 分子的大小
C 肽链的多少
D 分子形状的差异
6.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作， 其中正确的是（ A ）
• A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞
• C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液
2）影响蛋白质分子运动速度的因素
3）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同 时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利 用相关计算公式算出相对分子量
SDS 带负电荷多的 ，因而掩盖了不同种蛋白质 间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子 大小。
8.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原 因是
A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果
B、气泡阻碍蛋白质的运动 C、气泡与蛋白质发生化学反应 D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
9.样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝
胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C、等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D、用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的
《血红蛋白的提取和分离》名师教案
专题5D N A与蛋白质技术课题5.3 血红蛋白的提取和分离辉县市第二高级中学李艳琴一、【课题目标】知识与能力目标1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白。
2、说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
学科素养1、基础知识（从血液中提取和分离血红蛋白；色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理）；2、基本技能（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤，培养学生理论联系实际的能力）；3、基本思想（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神）；4、基本活动经验（通过色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理的学习，关注学生科学态度的教育，拓展学生视野）。
二、【课题重点】凝胶色谱法的原理和方法三、【课题难点】样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填四、【教学方法】启发式教学五、【教学工具】多媒体课件六、【教学过程】（一）引入新课蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。
对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。
所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。
怎样提取蛋白质呢？（二）进行新课1．基础知识蛋白质的理化性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1.1凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：（图5－13b）混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
1.2缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
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猪血红蛋白的提取纯化与鉴定
系别：生命科学与技术学院
专业：生物科学
班级：生物科学0701
姓名：李嘉、潘婷婷
血红蛋白(Hemoglobin , Hb)是动物血液中的一种由4个亚基组成的多亚基蛋白质。
作为体内氧运输的载体具有重要的生理功能。
在 Hb 与氧结合及释放过程中 ,体现了别构蛋白各亚基之间相互作用的正协同效应特征 ,具有很强的代表性 ,是研究别构蛋白特性的良好材料。
此外 ,Hb 的单亚基结构还与食用肉主要色素蛋白-肌红蛋白(Myoglobin , Mb)的结构非常相似 ,均为血红素蛋白质,具有一个血红素活性中心。
只是 Mb 是单亚基结构 ,而 Hb为4亚基结构,相当于Mb的4倍体。
Hb和Mb均具有3种天然诱导体构型 ,即氧合型 (Oxy-Hb ; Oxy-Mb) ,还原型(Red-Hb ; Red-Mb)和氧化型(Met-Hb; Met-Mb) 。
两种蛋白质的相同构型均具有相同的颜色及相似的光谱学特性。
为此 ,也有人用 Hb 作为成本昂贵的 Mb 的代用品来研究食用肉色调变化的规律性。
而目前市售的Hb多采用冷冻干燥法制备 ,多为Met-Hb 构型,其纯度较低 ,氧合活性较差 ,且该产品不能进行诱导体构型转化的调制 ,因而不能满足人们对食用肉色调变化进行研究的要求。
用丰富而廉价动物血液为原料，通过简便生产工艺制备Hb结晶（该结晶属氧化型）可进行多种诱导体形态的调制 ,调制出的各种诱导体具有类似于天然 Hb 的氧合功能特性 ,保持了别构蛋白与底物结合的正协同效应特点 ,同时 ,具有与天然诱导体形态相同的色调变化规律和光谱学特征。
因此 ,可以满足人们进行别构蛋白及食肉色调研究的需求。
此结晶具有稳定的理化性质 ,可长期保存。
一、教学目的
通过血红蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。
整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。
有利于培养学生的学习兴趣。
二、实验方案
图1 血红蛋白的提取纯化工艺流程图
1、动物血液的收集与处理
①取动物血液80-100ml，按 1：1 加入抗凝剂肝素（1250U/mL）混匀备用。
②将抗凝血液分装在4支50ml离心管中，3000 r/min ，4℃，离心10 min，弃去上
清 ,收集红血球。
③向压积红细胞中加3-5倍量预冷的生理盐水，轻轻搅匀洗涤，3000 r/min ，4℃，离心10 min，吸出上清液弃去。
再用生理盐水如上洗涤3次、最后吸出上清液弃去，收集红血球。
2、红细胞的破碎和血红蛋白原液的制备
方法一：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,置4℃冰箱中过夜 ,使其自然溶胀破碎，10000 r/min ，4℃，离心20min，收集上层血红蛋白溶液（血红蛋白粗提液）。
方法二：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,置-20℃冰箱中冰冻过夜 , 次日将冰冻红细胞放置室温或37℃水浴使之融化，摇匀，10000 r/min ，4℃，离心20min，收集上层血红蛋白溶液（血红蛋白粗提液）。
方法三：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,超声波破碎，破碎条件：功率500W，能量80%，室温，开3秒停2秒，破碎时间30秒～X秒（180秒）。
10000 r/min ，4℃，离心20min，收集上层血红蛋白溶液（血红蛋白粗提液）。
【取5mL血红蛋白粗提液留作血红蛋白含量测定和纯度分析】
3、盐析沉淀
取50ml血红蛋白粗提液制作盐析曲线，剩余部分（准确量体积）用于血红蛋白的盐析制备。
（1）血红蛋白盐析曲线的制作（需要粗酶液40～50 ml）
a.取7支干净试管编号1～7，分别加入粗酶液5 ml；
b.分别向1～5号试管中加入饱和硫酸铵1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，然后再分别加入蒸馏水4 ml、3 ml、2 ml 、1 ml、0 ml；分别向6号、7号试管中加先入固体硫酸铵0.66g和1.37g，再加饱和硫酸铵5 ml，充分摇晃溶解完全后，每管各取5ml×2混匀的溶液装入7ml×2离心管中，对应编号1、1/～7、7/，静置1h以上，对称放入离心机中，10000 r/min ，离心10min，弃去上清液，收集沉淀。
c.向收集的沉淀加入5 ml 0.1 mol/L（ pH7.0）磷酸缓冲溶液溶解沉淀物；
d.采用Folin法测定各管中蛋白质的浓度，采用文齐氏液测定血红蛋白。
e.以硫酸铵饱和度为横坐标，蛋白质浓度和血红蛋白的含量为纵坐标作图，得到蛋白质盐析曲线和血红蛋白盐析曲线。
（2）盐析制备血红蛋白
①根据血红蛋白盐析曲线选择硫酸铵饱和度(40%饱和度)去除杂质，选择硫酸铵饱和度(60%饱和度)沉淀血红蛋白。
并计算每升溶液达到40%饱和度和60%饱和度所需要的固体硫酸铵的量（g），根据血红蛋白粗提液的体积计算40%饱和度和60%饱和度时实际所需要的固体硫酸铵的量（g）。
②在血红蛋白粗提液中加入经研细的(NH
4)
2
SO
4
粉末 ,使其达到40%饱和度,充分溶解
后,4℃，10000r/min ,离心20 min ,除去沉淀。
收集上清夜。
③继续向上清液中加入(NH
4)
2
SO
4
粉末，使其达到 60 %饱和度 ,充分溶解后，4℃，
10000 r/min ,离心 20 min ,弃去上清液，收集沉淀。
④-I将沉淀溶于少量蒸馏水中 ,加磷酸盐(K
2HPO
4
∶ NaH
2
PO
4
=1∶ 1 ,1mol/1mol)达
到 1 mol/L ,充分混均 ,4 ℃放置约48 h后（可见血红蛋白粗结晶生成），4℃，10000 r/min，离心20 min ,将浮在上面的结晶收集 ,4 ℃保存。
④-II将沉淀溶于少量0.1 mol/L（ pH7.0）磷酸缓冲溶液中,进一步纯化。
【取5mL血红蛋白粗提液留作血红蛋白含量测定和纯度分析】
4、Sephadex G-75色谱纯化
选用φ15×600～800mm Sephadex G-75色谱柱，加样量为 3～5mL （约含蛋白60～100mg）用20mmol/L （pH为7.0 ）的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度可控制为 0.5mL/min 即10min/管，可用A280的紫外线进行检测。
如果测得的数值很高，说明蛋白含量过高，需要稀释后测量，测量方法如下：每管取 0.5mL 稀释10 倍后用紫外线测量的结果。
以A280测量值为纵坐标，收集管号为横坐标绘制洗脱曲线，收集血红蛋白洗脱峰，取适当浓缩后进行蛋白质纯度的鉴定。
剩余部分测量体积，置于冻干管中冷冻干燥（纯品血红蛋白）。
【取5mL血红蛋白粗提液留作血红蛋白含量测定和纯度分析】
5、纯度鉴定
三、结果与讨论
1、蛋白质标准曲线
2、血红蛋白盐析曲线
3、Sephadex G-100柱层析图谱
4
5
参考文献。