分子生物学实验手册
微量加样器的使用及注意事项
1 微量加样器的使用原理及分类
根据其加样的物理学原理可分为两种①空气垫加样器(又称活塞冲程);②无空气垫的活塞正移动加样器，这两种加样器具有不同的特定应用范围。
活塞冲程(空气垫) 加样器可很方便地用于固定或可调体积液体的加样，加样体积的范围在小于1μl～10ml之间。加样器中的空气垫的作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与加样器内的活塞分隔开来，空气垫通过加样器活塞的弹簧样运动而移动，进而带动吸头中的液体，死体积和移液吸头中高度的增加决定了加样中这种空气垫的膨胀程度。因此，活塞移动的体积必须比所希望吸取的体积要大约2%～4%，温度、气压和空气湿度的影响必须通过对空气垫加样器进行结构上的改良而降低，使得在正常情况下不至于影响加样的准确度。一次性吸头是本加样系统的一个重要组成部分，其形状、材料特性及加样器的吻合程度均对加样的准确度有很大的影响。
以活塞正移动为原理的加样器和分配器与空气垫加样器所受物理因素的影响不同，因此，在空气垫加样器难以应用的情况下，活塞正移动加样器可以应用，如具有高蒸汽压的、高黏稠度以及密度大于2.0g/cm3的液体；又如在临床聚合酶链反应(PCR)测定中，为防止气溶胶的产生，最好使用活塞正移动加样器。活塞正移动加样器的吸头与空气垫加样器吸头有所不同。
2 微量加样器的一般使用原则
加样器根据其加样的物理学原理和结构的不同，其应用特点也有所不同。
（1）活塞正移动加样器无需任何校正，即可用于具不同化学组成和特性(密度和黏度)的液体的吸取加样；相反，空气垫加样器的使用则较受局限。
（2）具有高蒸汽压的液体如氯仿使用空气垫加样器吸取加样通常不能得到跟吸取加样蒸馏水相同的准确度和精密度。由于在液体吸取过程中有部分蒸发，因而加样的体积就会有所减少。可通过预先用液体湿润吸头数次，使得蒸汽相被液体饱和，可以改善加样的准确度。
（3）为防止由高蒸汽压引起液体从吸头中漏出，可使用在底部有瓣的吸头，此瓣只在其与管壁接触的时候打开。
（4）使用空气垫加样器加样，位于液体之上的空气体积膨胀依所加液体密度的不同而不同。当吸取密度高于水的液体时，吸入吸头的体积太低。例如，对于一个密度为1.1的较高浓缩的液体，误差的量将达到0.2%。而吸取较稀的水溶液的这种误差则可以忽略不计。因此，在吸取密度高的液体时，须对加样器吸取体积的设定作相应的校正，才能保证取到正确的体积。然而，在实验室实际工作中，加样器使用者很少碰到要准确吸取密度很高的液体的情况，故由于液体的密度所致加样器使用受限的情况通常难以遇到。
一般来说，为防止所吸取体积上出现误差，有一些基本的操作原则必须遵守。对吸取体积误差影响的因素主要有三个方面：①流体静压；②吸头润湿；③流体动力学。当样本体积从毫升范围降低至微升范围时，物理作用力的关系即发生变化，对于加样来说，其意味着液体表面的作用力效应与其体积或质量（例如重力）的作用力效应相比有所增加，因此，加样器生产厂家在设计和构建加样器和吸头中必须仔细考虑这种情况，而且在使用时也1
必须注意。
流体静压：在吸取液体时，加样器吸头只能浸入液体几毫升以确保与排出液体时相同的流体静压条件，因此，加样器必须以几乎垂直的方式加取液体，因为倾斜的方式将减少液体柱的高度，导
致吸取的液体过多。如果加样器以30℃下以垂直方式吸取液体，可吸取至0.15%更多的液体。吸头润湿：当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以薄膜的形式保留在吸头的侧面，其量取决于液体和吸头表面的相互作用，因此，其是一个常数，但依液体材料的不同而不同。对于水溶液，这种润湿影响在构建加样器时就应考虑。对于蛋白液等黏度高的液体，建议在加样前吸液体数次，以保证加样的一致性。
流体动力学：对体积吸取的第三个影响是从加样器吸头外壁液体的释放，在此过程中，吸头的几何形状起一个关键的作用。为确保加样中的稳定条件，加样器吸头应靠在管壁上，吸头中释放。如果吸头安装不正确或使用不相配的吸头，对加样误差将达到0.4%以上。尽管空气垫加样器的使用有一定的局限性，但其优点耀很明显的，其所覆盖的体积范围大，使用易于掌握。此类加样器很轻，可很空易地应用于各种情况下的加样。
3 注意事项
实验室基本上以使用连续可调的加样器为主。连续可调式加样器在使用时应注意以下几点，从而使加样器能发挥最佳性能。
3. 1 取液之前，所取液体应在室温（15℃～25℃）平衡。
3. 2 操作时要慢和稳。
3. 3 连续可调试加样器在取样加样过程中应注意移液吸头不能触及其他物品，以免被污染；移液吸头盒（架子）、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作过程、避免污染为原则。
3. 4 连续可调试加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
3. 5 吸头浸入液体深度要合适，吸液过程尽量保持不变。
3. 6 改吸不同液体、样品或试剂前要换新吸头。
3. 7 发现吸头内有残液时必须更换。
3. 8 新吸头使用前应先预测。
3. 9 为防止液体进入加样器套筒内，必须注意以下几点：①压放按钮时保持平衡；②加样器不得倒转；③吸头中有液体时不可将加样器平放；④P5000及P10ML加样器一定要加滤芯。
3. 10 勿用油脂等润滑活塞或密封圈。
3. 11 不可把容量计数调超其适用范围。
3. 12 液体温度与室温有异时，将吸头预洗多次再用。
3. 13 移液温度不得超过70℃。
3. 14 使用了酸或有腐蚀蒸气的溶液后，最好拆下套筒，用蒸馏水清洗活塞及密封圈。
3. 15 连续可调式加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
4. 加样器的校准
加样器容量性能的鉴定，可依据国际标准化组织（ISO）文件ISO/DIS8655和国家技术监督局颁发的有关定量、可调移液器的中华人民共和国国家计量检定规程《定量、可调移液器试行检定规程》（JJG646-90）规定的重量测2
试方法。这是目前用于此类仪器有效的校准方法。
4.1. 适用加样器范围各种品牌、型号的固定、可调和多通道加样器。
4.2. 校准环境和用具要求
4.2.1 室温20-25℃，测定中波动范围不大于0.5℃。
4.2.2 电子天平：放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。称量时，为保证天平的湿度（相对湿度60%-90%），天平内应放置一装有10ml蒸馏水的小烧杯。
4.2.3 小烧杯：5-10ml体积。
4.2.4 测定液体：温度为20-25℃的去气双蒸水。
4.3. 选定校准体积①拟校准体积；②加样器标定体积的中间体积；③最小可调体积（不小于拟校准体积的10%）。如为固定体积加样器，则只有一种校准体积。
4.4. 校准步骤
4.4.1 将加样器调至拟校准体积，选择合适的吸头。
4.4.2 调节好天平。
4.4.3 来回吸吹蒸馏水3次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头。
4.4.4 垂直握住加样器，将吸头浸入液面2-3mm处，缓慢（1-3s）一致地吸取蒸馏水。
4.4.5 将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体。
4.4.6 将加样器以30角放入称量烧杯中，缓慢一致地将加样器压至第一档，等待1-3s，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出。
4.4.7 记录称量值。
4.4.8 擦干吸头外面。
4.4.9 按上述步骤称量10次。
4.4.10 取10次测定值的均值作为最后加样器吸取的蒸馏水重量，按蒸馏水在不同温度及气压下的重量与体积的换算因子计算体积。然后，按校准结果调节加样器。
4.5加样器的维护保养程序
加样器应根据使用频率进行维护，但至少应每3个月进行一次，具体方法如下：
4.5.1.一般维护可用中性洗涤剂清洁，或者用60﹪的异丙醇，然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。
4.5.2.如果有液体进入加样器内的严重污染，可将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤参照加样器说明书。
4.5.3.高压消毒，有的加样器的吸管部分可高压消毒，但需注意的是消毒时不可超温超时，也不能挤压放置，以免造成变形。
4.5.4.可调式移液器在不使用时应妥善地竖立放于支架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
4.5.5.在移液操作过程中为防止液体进入加样器套筒内，必须注意：压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。
4.5.6.每天开始工作之前应检查移液器的外表面是否有灰尘或污物，若有则小心抹去。
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田士军
PCR
实验一
一、实验原理：天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡
核类似于DNA的技术的基本原理PCR
经DNA--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板苷酸引物。PCR
由变性--退火解离，使之成扩增形成的双链DNADNA双链或经PCR加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA)：模板物的退火(复性为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引
单链的互补序列配对结合；③引物经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，
引物与模板DNA为反应原料，靶序列为dNTP引物结合物在TaqDNA聚合酶
的作用下，以的延伸：DNA模板--链互补的半保留复制链重复循模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA
，而且这种新链又可成为下次循环的半保留复制链”--退火--延伸三过程，就可
获得更多的“环变性PCR 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。～4分钟，2～模板。每完成一个循环需2的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
二、设备：
TM Thermal cycler）PCR仪（Bio-Rad S10000微量移液器（10μl）；离心机(Eppendorf centrifuge 541B)；三、耗材：
吸头，1.5ml，200μl PCR八连管，
四、试剂和配制方法：
上游引物，下游引物，模板质粒，灭菌去离子水，Kit：天根生化[ 2×Pfu Master Mix Kp201（含有pfu DNA聚合酶，dNTPs，镁离子，反应缓冲液，PCR反应的增强剂，loading buffer）]。
五、步骤：
1．依次在管中加入：
（25μl PCR体系）按照kit的说明书：
Primer 1(10uM) 1μl
Primer 2(10μM) 1μl
4
2×Master Mix 12.5μl
ddHO 9.5μl 2Template
1μl
注：空白对照不加模板；其余先加ddHO，最后加模板。注意加样顺序：ddHO，Primer，2×Master 22Mix，Template。
2．瞬离，将样品甩至管底。
3．PCR参数：94℃5min
35×(94℃25sec - 60 ℃25sec - 72℃30sec)
- 72 ℃20min
（第一个10min后每管加1μl的普通Taq，然后继续72 ℃10min）若无需加A 尾，只需72 ℃10min
4. 立即电泳或保存于4℃
注意事项：
PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和
交叉污染，假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染，尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。
（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。
(2）PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。
超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。
（3）PCR操作应戴手套并勤于更换。
（4）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。
（5）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。
（6）最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。
（7）实验设阳性、阴性对照
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（8）如要配多个管，配反应体系时应先在一个管中把所有共同的试剂混在一起，再分装到每个小管中，然后再加各自不同的模板或引物，这样省时省力，均一性好。
问题及解决办法：
1、出现假阳性的问题：
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、DNA抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。
解决办法：(1)工作区隔离。(2)改进实验操作，如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。(3)操作程序合理化，如后加阳性对照等。
2、假阴性的问题：
如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。造成假阴性的原因包括: (1) DNA 抽提过程不当。(2) DNA 样品中含有Taq 聚合酶抑制剂，如尿素、
DMSO 、SDS 等物质，可抑制Taq 酶活性，DNA 样品中的蛋白质和重金属离子等亦影响Taq
酶活性，尤其是含有较多脓液或分泌物的标本，其中虽有待查菌，但却因标本处理不当而出现假阴性。设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中加入内对照，若内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。3.不出现扩增条带：
（1）引物：引物质量是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
解决办法：①选定合适的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，最好用引物原液做琼脂糖凝胶电泳，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR 有可能失败，应与引物合成单位协商解决，如一条引物亮度高，一条引物亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏而导致变质降解失效；④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（2）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
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（3）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。4.出现非特异性扩增带：
（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带出现的原因：一是引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
（2）其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
解决办法：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
5.出现片状拖带或涂抹带：
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。可能由于Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，GC含量过高引起。
解决办法：适当降低Mg2+浓度；增加模板量；减少循环次数；加入添加剂甘油。
[肖硕,张秀娟]
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实验二 Agarose电泳
一、实验原理：
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)或者ＥＢ类似物，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。
一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA 正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度
的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE（见下）和TB（硼酸）E，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
Marker的选择DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。
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二、设备：
移液器，微波炉，电泳仪电源，水平式凝胶电泳槽，样品梳，电子秤，锥形瓶，凝胶成像系统，烧杯，量筒
三、耗材：
PCR产物，质粒，枪头
四、试剂：
○的冰醋酸，加入57.1ml（三羟甲基氨基甲烷）碱于1L烧杯中，150×TAE缓
冲液：取242gTris100ml的0.5mol/L EDTA（pH 8.0），加入去离子水定容到1L。取2ml 50×TAE缓冲液加入98ml去离子水配成100ml 1×TAE稀释缓冲液备用。
○琼脂糖21.5%○。DNA相对分子质量标准样品：DL20003○胶。3μl/100ml4Goldview溶液：一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，○的缓
冲液中可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚）：6*loading buffer56×上样缓冲液（蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。loading buffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。商品化产品，贮存于4℃。
五、实验步骤：
1．制备胶液：锥形瓶中的0.75g琼脂糖与50ml 1×TAE稀释缓冲液混匀后放入微波炉里加热至琼脂糖完全融化，取出摇匀。
2．制备胶板：将胶槽置于水平支持物上，插入样品梳，注意梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙；琼脂糖溶液中加入1.5μl Goldview溶液使其终浓度为3μl/100ml胶；将琼脂糖小心倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损失梳子底部的凝胶，然后向槽内加入1×TAE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板表面。
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3．加样：取25μl DNA样品（PCR产物中含有染液），用移液器小心加入样品槽中。每加完一个样品要用电泳槽中的buffer清洗枪头，上样时要小心不要将样品槽底部凝胶刺穿，同时将10μl的DL2000点样，记录点样顺序。
4．电泳：加完样后，合上电泳槽盖，连接好电线和电源，注意正负极，接通电源。恒压100V，待阴极有气泡冒出才能离开。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
5．观察：戴好手套小心取出电泳槽，滑出凝胶，放在一次性手套上，置于凝胶成像系统下观察，拍照。
6．清洁：电泳用具，晾干。
六、注意事项
1、Marker的选择
Marker的选择要适中，Marker 应该选择在目标片段大小附近ladder 较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。如果marker太大就可能跑不开，挤到一起，起不到marker的作用。
2煮胶要完全，胶要摇匀
注意煮胶完全，不然有小颗粒会影响跑胶结果。如果胶没有摇匀，跑胶的时候，相同的DNA的速度就不会相同，这样会出现弥散条带。
3、电泳跑完后，怎样看跑胶效果？
先看marker跑的怎样，如果marker跑的很好，没有弯曲，就说明整个电泳体系是没有问题的。
4、点样时别锉到胶。
5、条带模糊暗淡
电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE 缓冲液，一般用2～3 次就要更换，TBE 缓冲液则可使用10 次左右。如果是EB染色，可能是溴化乙锭见光易分解，母液配制时间过长或保存不当(一般4℃避光保存一年内有效)，或者终浓度没达到0．5 vg ／ml
七、讨论
1关于凝胶浓度的选择
琼脂浓度（%）DNA相对分子质量（Kb）
5——60 0.3
1——0.6 20
0.80.7 ——1.0
0.5——0.9
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2跑胶时候。接近阴极的地方胶发黑？
ＴＡＥ的浓度太低，或者是误把水当成TAE，水不能导电，致使负极的胶碳化。3加样时候，样品浮在缓冲液中，不能沉在加样孔里？
Loading buffer 里的甘油浓度太低，又或者根本没加甘油。
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电泳时电压不应超过20V/CM，温度＜30℃，巨大电泳条件不合适DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲带迁移不规则DNA能力，注意经常更换
电泳前勿加热，用20mM Nacl DNA变性缓冲液稀释DNA
增加DNA上样量，聚丙烯酰DNA上样量不够胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低
[于轹文、王楠]
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实验三凝胶中DNA的回收
一、实验原理：
PCR反应后获得的DNA片断、酶切后所得特定的DNA序列等，经过琼脂糖凝胶电泳后，DNA分子按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的 DNA片段，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等。
二、设备：台式离心机、水浴锅、微量移液器（100ul、1ml）
三、耗材：
1.5ml离心管
四、试剂：
无水乙醇，Kit(Omega Gel Extraction Kit， D2500-01)
五、步骤
1．切胶：在长波紫外灯下观察电泳结果，用刀片割下含目的DNA的凝胶块。尽可能多地去掉不含DNA的凝胶，这样对提高质量、简化操作均有好处。
2．将凝胶块放入干净的1.5mlEP管中称重，按每0.1g凝胶加入100μL 的比例加入Binding Buffer（本实验加入700μL），置于55-60℃水浴7min，使琼脂糖块完全溶化，每2-3min颠倒混匀一次。
3．HiBind DNA吸附柱处理。
（1）取一个HiBind DNA吸附柱装在收集管中，吸取200μL Buffer GPS平衡缓冲液
（2）室温放置3-5min，
（3）室温下12000g离心2min。
（4）倒弃滤液，将HiBind DNA吸附柱重新装在收集管中，加700μL灭菌水。（5）室温12000g离心2min。
（6）倒弃滤液，将HiBind DNA吸附柱重新装在收集管中。
4．吸附：将溶化后的DNA 胶液700μL加到吸附柱中，室温放置2min，室温下10000g 离心1min，
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倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
5．洗涤：在HiBind DNA吸附柱中加入300μLBinding Buffer，室温下10000g 离心1min，充分洗涤吸附柱。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集
管中。加入700μL 用乙醇稀释过的SPW Wash Buffer洗涤吸附柱，室温下10000g 离心1min，重复离心洗涤一次。
6．干燥：倒掉收集管中的液体，将HiBind DNA吸附柱于13000g离心2min，将离心柱套在干净1.5ml管上，13000g离心2min，于超净台内风干。
7．洗脱：将HiBind DNA吸附柱放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入40μL
Elution Buffer，室温，静置2min。13000g离心2min.，即可将DNA回收。如果DNA含量较少，可重复洗脱。
8．检测：琼脂糖凝胶电泳鉴定回收的DNA。
六、注意事项：
1.电泳时最好使用新的缓冲液，以免影响电泳和回收效果。
2.如下一步实验要求较高，尽量使用TAE缓冲液。
3.切胶时，紫外线照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。
4.如果胶回收率低，可在胶充分溶解后检测PH值，如PH值大于7.5，则可向胶溶液中加入磷酸钠（PH
5.0），将PH值调到5-7之间。
5. Wash Buffer应保持在低温，否则可能使DNA从柱上脱落而导致回收率降低。
6. 洗脱之前，应再次离心或在空气中放置几分钟，防止其中混入乙醇，影响后续试验。
7.回收大于10kb的DNA片段时，Buffer EB应在50℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱时间，可以增加回收效率。
8.回收率和初始DNA量和洗脱体积有关。
9.所有离心步骤均为台式离心机在室温下进行。
七、常见问题：
1. 未回收到DNA片段或回收效率很低
原因①：胶块未完全溶解。
建议：为加快凝胶的溶解，应将凝胶置于55℃水浴中溶解，期间不断上下颠倒，待确定凝胶完全溶解后再进行后续操作。每100 mg凝胶应加入100uL溶胶液，如果胶块过大，应将胶块切成小块，14
以便于凝胶溶解。
原因②：加入溶胶液过少。
建议：每100 mg凝胶应加入不少于100uL溶胶液。
原因③：DNA Wash Buffer 中未加入无水乙醇。
建议：第一次使用前，按照说明书要求加入无水乙醇。Wash Buffer使用后，应旋紧瓶盖，以防乙醇挥发，导致漂洗时损失DNA，降低回收效率。
原因④：Elution Buffer不合适。
建议：洗脱液的pH值在7.0~8.5时，洗脱效率最高，洗脱液pH超出此范围，将会显著影响收获率，建议使用试剂盒配套的Elution Buffer（pH 8.5，10mM Tris-HCl），或者使用pH值在此范围的ddH2O。
原因⑤：Elution Buffer未加到离心柱中间。
建议：在洗脱时Elution Buffer应加在中间位置，并室温放置1~2分钟，然后再离心洗脱。另外，采用65℃预热的Elution Buffer将显著提高回收效率。原因⑥：起始回收量太少。
建议：如果起始回收量很好的样品，应富集，最好使用不少于1ug的样品。2．电泳时，产物漂出点样孔
原因：洗脱时，柱子中残留有乙醇。
建议：在进行洗脱前，如果柱子上残留乙醇，将会影响洗脱效率，在洗脱前应再次离心，或者空气中放置几分钟，再进行洗脱。
3．后续无法进行连接等实验操作。
原因：洗脱液中含有乙醇。
建议：洗脱前，确保柱子中乙醇已无残留乙醇，再次离心，或者空气中放置几分钟。
[李冠琳、缪新燕]
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实验四连接与转化
一、实验原理
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点，如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入感受态细胞，用所得到重组质粒转化细菌，再筛选就可获得重组的克隆。将感受态细胞与质粒混匀置于冰上，混合物中的DNA形成抗DNase羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，再经过42°C短时热激以促进质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传标记在LB平板上就可进行初步的筛选转化菌落。
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
分子生物学实验设计报告-四川大学
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省
时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理： ~
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学实验复习题附答案(最新整理)
分子生物学复习题 实验一DNA的制备 （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？ 溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？ 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。 （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？ 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？
分子生物学实验课件..
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容 至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培 养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加
热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。 每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 (10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11)接种环蘸取菌液，密密划线。 (12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13)一天后观察菌落。 四、思考题 (1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌 种的什么信息？ (2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完 毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？ (3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什 么不是正放呢？ (4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？ 实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 一实验目的 了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。 二实验原理 本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
分子生物学实验
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
分子生物学实验方法与步骤
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
分子生物学试验基础知识
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
分子生物学常用实验指南
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
分子生物学实验指导-3
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
分子生物学试验设计
分子生物学
利用半定量RT-PCR检测烟碱生物合成的方法 1 研究背景 烟碱是影响烟叶品质和安全性的最主要的因素之一，是烟草栽培和烟草制品消费者追求的主要目的物，也是烟草具有商品价值的根本所在。烟碱合成的第一步是腐胺到N-甲基腐胺的转化，由腐胺-N-甲基转移酶(PMT)催化，而腐胺-N-甲基转移酶(PMT)是合成烟碱过程中的关键限速酶。目前，国内外鲜有将烟碱的快速积累跟烟碱合成关键酶的转录水平直接对应起来的报道。研究表明，打顶后可导致烟草中烟碱的快速积累。所以利用烟草打顶可以增加烟碱生物合成的特点，选择参与烟碱合成的关键酶腐胺-N-甲基转移酶(PMT)，利用半定量RT-PCR检测PMT基因表达变化；同时结合上部烟叶烟碱含量的测定结果，比较两者的变化是否成正相关。这种方法的建立有利于通过检测烟碱合成关键基因的表达来分析烟草中烟碱生物合成情况，增强了检测不同大田管理措施影响烟碱合成的力度。 2 材料与方法 2.1 试验材料 试验材料为普通烟草栽培种K326。烟苗培育采用漂浮育苗法，烟苗长到4叶时，用作水培试验，烟苗管理按常规的溶液培养方法进行。烟苗水培65d时打顶，于打顶后24 h时取样，取烟株的上部叶和根系进行试验。 2.2 测定烟碱含量 烟碱含量的测定采用王瑞新(2003)的紫外分光光度法。每个样品5个重复，数据分析采用student,t检验，显著水平为P<0.05。 2.3 RNA提取 提取打顶烟草和不打顶烟草根部总RNA，总RNA提取后，分别测260nm、280 nm处的吸光值，计算A260/A280的值，估计总RNA的纯度，通过A260的值对总RNA进行定量。在l％琼脂糖凝胶上检测总RNA的提取质量。 2.4 RT-PCR法检测PMT表达变化 取等量打顶处理和不打顶烟株的总RNA，用RT-PCR法检测PMT基因的表达变化。 3 预计结果 3.1 烟碱含量的测定 与对照相比打顶后烟碱含量显著上升 3.2 RNA电泳检测 总RNA提取后，经检测RNA样品纯度好，并没有发生降解，可用于cDNA 第一链的合成。 3.3 PMT引物和内参引物进行分管PCR