药用真菌桑黄分子鉴定及遗传多样性分析

浙江农业学报！#!&()(&*! 2019，％1(2): 307 -314 王伟科，宋吉玲，巫优良，等.药用真菌桑黄分子鉴定及遗传多样性分析[J].浙江农业学报，2019，％1(2): 307 -314.D O I： 10.3969/j.issn.1004-1524. 2019. 02. 17药用真菌桑黄分子鉴定及遗传多样性分析王伟科\宋吉玲\巫优良2!闫静1，陆娜\袁卫东\陈观平3(1.杭州市农业科学研究院蔬菜研究所，浙江杭州310024* 2.江山市农业科学研究所，浙江江山324104* 3.浙江省中医药研究院，浙江杭州310012)摘要:通过对不同来源的桑黄菌株进行分子鉴定和遗传多样性分析，为后续桑黄种质资源的研究、开发及利用提供参考。

采用rD N A IT S序列分析技术，对收集到的国内22个桑黄菌株进行分子鉴定与遗传多样性分析。

依据rD X A IT S序列计算遗传距离并构建系统发育树，结果显示收集到的桑黄菌株明确聚为3个独立类群，且3个类群的桑黄真菌存在明显的遗传分化。

通过BLA ST分析，成功鉴定出3类桑黄种质分别为:桑树桑黄/.%,($.%)、杨树桑黄%'$)及丁香桑黄（W^0#5G(5'。

不同来源的桑黄菌株间具有一定的遗传多样性，种间遗传趋异度显著高于种内。

本研究结果提供了一种准确可靠且简单易行的桑黄真菌分子鉴定技术，可明确各桑黄真菌的种属来源及遗传结构组成，为桑黄真菌的进一步研究及开发应用奠定了基础。

关键词:桑黄;_N A I T S;分子鉴定;遗传多样性中图分类号:S567.9;R282 文献标志码:A文章编号:1004-1524(2019)02-0307-08Molecular identification and genetic di^ersit^ of a traditional Chinese medicinal fungus Sang-huangWANG Weil^e1，SONG Jiling1，WU Youliang2，YAN Jing1，LU Na1，YUAN Weidong1，CHEN Guanping3(1. Institute o f Vegetables，Hangzhou Academy o f A gricultural Sciences，Hangzhou 310024，China* 2.Jiangshan In­stitute o f Agricultural Sciences，Jiangshan 324104,China*3. Zhejiang Academy o f Chinese Medicine，Hangzhoo310012，China)A bstract ：To study the genetic diversity and genetic relationship of Phellinus baumii，and their relative species byITS molecular mariner technique，and to provicde the reference for Phellinus baumii icdentification and breeding，the ri-bosomal DNAinternal transcribed spacer(rD N AITS)region was amplified and sequenced to identify the22 speciesof Sanghuang which were collected from domestic and detect its genetic diversity.Based on rDNAITS sequences，thegenetic distance and phylogenetic tree were obtained.Results showed that tliere were distinct genetic divergences a­mong22 species of Sanghuang，which formed three separate species cluster in the topol bootstrap value.Meanwhile，two counterfeit Sanghuang strain，Fuscoporid gilva and Inonotus baum successfully，and the certified Sanghuang germplasms were distinguislied as Sanghuangporns sanghuang unambigu­ously by BLAST analysis.The results of ITS analysis revealed that Phellinus baumii had the plentiful genetic diversityand the genetic relationships were consistent with morphological characters of taxonomy.ITS method was收稿日期=2018-05-9基金项目：浙江省科技计划（2016F10025)*杭州市农业与社会发展科研项目（20180416A02)*杭州市农业科学研究院科技创新项目 (2017H N C X-03)作者简介:王伟科(1981-)，男，浙江宁海人，硕士，高级农艺师，研究方向为食药用菌育种与栽培技术研究。

E-m a il: a k e k@126. c m• 308 -浙江农业学报第％1卷第！期identification of Phellinus baumii,which could p rovide a scientific basis for tlie resource collection and identification of tlie species in Phellinus baumii.K ey words: Sanghuang; ribosomal DNAinternal transcribed spacer; molecular identification; genetic biodiversity a­nalysis桑黄是一种珍贵的药用真菌，因寄生于桑树 树干，子实体呈黄褐色而得名，俗称桑耳、桑臣 等，是我国一种传统而名贵的中药材[1]。

桑黄真 菌种群隶属于担子菌门（Basidiom ycotina)、层菌 纲（Hymenomycetes)、非裙菌目（Aphyllopho-rales)、锈革孔菌科（Hymenochaetaceae)[!]。

桑黄 的功效最早记载在《本草纲目》一书中，《药性 论》也有桑黄味微苦、性寒等功效描述[3]。

传统 中医认为桑黄具利五脏、软坚、排毒、止血和止泻 等药效，可用于治疗痢疾、盗汗、血崩、血淋、脱肛 和闭经等症[6];现代药理学研究证实，桑黄还具 有抗肿瘤、降血糖、护肝、抗炎、免疫调节、抗氧化 等药理作用[“]。

因此，桑黄具有极高的开发利 用价值。

当前，桑黄产品的开发主要以桑黄子实体为 原料，但由于桑黄野生资源的日益匮乏，加之桑 黄子实体生长对环境的依赖性很高，生长周期 长，产量不稳定;对桑黄人工栽培等相关技术研 究尚处于起步阶段[&]，这严重限制了桑黄的进一 步开发和利用。

而桑黄种质鉴定、新品种选育及 高效栽培技术研究等一直是研究者关注的重点。

作为珍贵的药用真菌，桑黄真菌大多寄生在桑 树、栎树、桦树、杨树等阔叶植物的枯立木及树干 上，且该类真菌的子实体均呈蹄形，同时与桑黄 真菌在外观形态上相似的大型真菌种类繁多，仅 依赖于形态特征的传统鉴定方法很难确定菌株 的分类归属["〇]。

在基础研究及开发应用中，往 往出现“同种异名”“同名异种”的现象，严重阻 碍了桑黄新品种的选育及产业的发展。

rDNA内转录间隔区（ITS)是真菌核糖体SXA基因非转录区的一部分，其在绝大多数的真 核生物中表现出了极为广泛的序列多态性，表现 为种内菌株间相对保守，种间差异比较明显。

这 种特点使；S适合于真菌物种的分子鉴定以及属 内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发 育关系分析。

即使亲缘关系非常接近的！个种 都能在；S序列上表现出差异，显示最近的进化特征。

因此，ITS已被广泛应用于微生物菌种分 类与鉴定、中药材鉴定和品质评价、植物种质资 源鉴定、遗传多样性与亲缘关系、病原诊断、系统 发育等不同方面的研究[11_14]。

对种属模糊的食 用真菌；S序列进行测序，可通过将测序得到的 ;S序列与已知真菌ITS序列比较，从而能获得 该菌株的信息及系统的遗传谱系。

由于用于真 菌鉴定的ITS序列通常包括ITS1、5.8S和IT S2, 长度为500 ~750 bp，故利用高保真PCR技术并 结合直接测序法在食用真菌的分类、鉴定中有很 大的优越性[15]。

我们在参考真菌rDN A ITS扩增通用引物及 GenBank中登录的桑黄真菌属（Phe/lnus baumf rDNAITS序列基础上，设计并合成了桑黄rD N A ITS通用引物，并利用PCR技术克隆了 rDN A IT S 基因片段，同时结合直接测序技术，对从杭州千 岛湖、桐庐等地区采集到的桑黄真菌进行了分子 鉴定及遗传结构分析工作。

本文的研究结果可 以提供-种准确可靠且简单易行的桑黄真菌分 子鉴定技术，有助于明确各桑黄菌株的种属来源 及遗传结构，为桑黄真菌的分类及进一步开发应 用提供参考依据。

1材料与方法1.材料1.1.1样品采集测试菌种（株）收集自我国各主要桑黄真菌 保藏单位（表1)。

此外，检索近期发表的Gen-B ank 中登录的其他 12 种桑黄真菌 IT S 序列 （基 因登录号分别为：A P080458.1、AP082102.1、AF200226.1、A F534065.1、AY436626.1、AY513234.1、AY640937.1、D Q103884.1、D Q462333.1、E F506943.1、E F694971.1、F J940908.1)，下载保存，用于序列比较。

1.1.2仪器与试剂主要仪器:V eriti型 PCR仪(ABI，U SA)、DYY-6D王伟科，等.药用真菌桑黄分子鉴定及遗传多样性分析• 309 -表1桑黄真菌测试菌株来源T a b le 1 T h e s tra in s used fo r S angh u an g g e n e tic d iv e rs ity a nd m o le c u la r id e n tific a tio n序号N o.菌株S t r a i n菌株来源S o u r c e o f s t r a i n序号N o.菌株S t r a i n菌株来源S o u r c e o f s t r a i n1S1淳安微生物研究所C h u n’a n I n s t i t u t e o f M ic r o b io lo g y 12S13淳安桑都食用菌专业合作社C h u n’a n“s a n g d u”E d ib le M u s h r o o m P r o fe s s io n a l C o o p e r a t iv e2S2淳安微生物研究所C h u n’a n I n s t i t u t e o f M ic r o b io lo g y 13S15杭州市食用菌协会H a n g z h o u E d ib le F u n g i A s s o c ia t io n3S3四川省农业科学院S ic h u a n A c a d e m y o f A g r ic u lt u r a l S c ie n c e s 14S17杭州市食用菌协会H a n g z h o u E d ib le F u n g i A s s o c ia t io n4S4四川省农业科学院S ic h u a n A c a d e m y o f A g r ic u lt u r a l S c ie n c e s 15S19安徽金寨采集C o lle c t io n fr o m J i n z h a i A n h u i5S5浙江桐庐野生采集W ild c o lle c t io n f r o m T o n g lu Z h e jia n g 16S21浙江淳安野生采集W ild c o lle c t io n f r o m C h u n’a n Z h e jia n g6S6浙江桐庐野生采集W ild c o lle c t io n f r o m T o n g lu Z h e jia n g 17S22浙江淳安野生采集W ild c o lle c t io n f r o m C h u n’a n Z h e jia n g7S7浙江临安野生采集W ild c o lle c t io n f r o m L in’a n Z h e jia n g 18S23浙江淳安野生采集W ild c o lle c t io n f r o m C h u n’a n Z h e jia n g8S8浙江淳安野生采集W ild c o lle c t io n f r o m C h u n’n Z h e jia n g 19S26浙江衢州野生采集W ild c o lle c t io n f r o m Q u z h o u Z h e jia n g9S9桐庐桐君堂药业有限公司T o n g lu T o n g J u n T a n g P h a r m a c e u t ic a l C o.L t d.20S27安徽金寨采集C o lle c t io n fr o m J i n z h a i A n h u i10S10浙江桐庐野生采集W ild c o lle c t io n f r o m T o n g lu Z h e jia n g 21S28浙江丽水采集W ild c o lle c t io n f r o m L is h u i Z h e jia n g11S11延边朝鲜族自治州农业科学院Y a n b ia n A g r ic u lt u r a l S c ie n c c I n s t i t u t e 22S KH C H浙江开化采集W ild c o lle c t io n f r o m K a ih u a Z h e jia n g电泳仪（北京六一仪器厂，中国）、GelDoc X R凝 胶成像系统（Bio-Rad，USA)、3700型D N A测序仪(美国）。