37李阳Crazy口语终极整理2
李阳疯狂英语句子速成
李阳疯狂英语句子速成李阳疯狂英语句子速成1. Absolutely. (用于答话）是这样;当然是;正是如此;绝对如此。
2. Absolutely impossible! 绝对不可能的！3. All I have to do is learn English. 我所要做的就是学英语。
4. Are you free tomorrow? 你明天有空吗?5. Are you married? 你结婚了吗？6. Are you used to the food here? 你习惯吃这儿的饭菜吗？7. Be careful. 小心／注意。
8. Be my guest. 请便／别客气。
9. Better late than never. 迟到总比不到好。
10. Better luck next time. 祝你下一次好运。
11. Better safe than sorry. 小心不出大错。
12. Can I have a day off? 我能请一天假吗？13. Can I help? 要我帮助吗？14. Can I take a message? 要我传话吗？15. Can I take a rain check? 你能改天再请我吗？16. Can I take your order? 您要点菜吗？17. Can you give me a wake-up call? 你能打叫醒我吗？18. Can you give me some feedback? 你能给我一些建议吗？19. Can you make it？你能来吗？20. Can I have a word with you? 我能跟你谈一谈吗？21. Catch me later. 过会儿再来找我。
22. Cheer up! 快乐起来！振作起来！23. Come in and make yourself at home. 请进，别客气。
24. Could I have the bill, please? 请把账单给我好吗？25. Could you drop me off at the airport? 你能载我到飞机场吗？26. Could you speak slower? 你能说得慢一点吗？27. Could you take a picture for me? 你能帮我拍照吗？28. Did you enjoy your flight? 你的飞行旅途愉快吗？29. Did you have a good day today? 你今天过得好吗?30. Did you have a nice holiday? 你假期过得愉快吗？31. Did you have fun？你玩得开心吗？32. Dinner is on me. 晚饭我请客。
李阳疯狂英语100个发音秘诀
李阳疯狂英语LI YANG CRAZY ENGLISH第一章字母发音突破秘诀1最坚实的基础——疯狂突破字母关这是一首优美、现代的字母歌，绝对不是我们从小就熟悉的那首“比较弱智”的字母歌!请一定要反复听、反复模仿。
26个字母、26个单词、26个句子，疯狂模仿，发音必会产生飞跃！A的读音为IPA: [♏♓]I’m afr ai d you’ve m a de a mist a ke.K.K: [♏]恐怕您搞错了。
B的读音为IPA: [♌♓]I won’t be able to finish my work.K.K:[♌♓]我不能完成工作了。
C的读音为IPA:[♦♓]I don’t see what you mean.K.K[♦♓]我不懂你的意思。
D的读音为IPA[♎♓] I’ve heard a great dea l about you.K.K[♎♓]久仰大名。
E的读音为IPA[♓] He is ea sy to deal with.K.K[♓]他很容易打交道。
F的读音为IPA[♏♐] Will you sit on my l ef t?K.K[☪♐] 你坐在我左边好么？G的读音为IPA[♎✞♓]Lots of students wear jea ns nowadays.K.K[♎✞♓]现在很多学生穿牛仔裤。
H的读音为IPA[♏✋♦☞]Let me h ave a look at the book.K.K[♏♦☞] 让我看看这本书。
I的读音为IPA[ ✋] I could,and I should, but I won’t do it.K.K[ ✋] 这个我能做，我也应该做，但我不愿意做。
J的读音为IPA[♎✞♏✋] He was jai led for tow years.K.K[♎✞♏] 他被囚禁了两年。
K的读音为IPA[ ♏✋]In any ca se, it’s none of your business.K.K[ ♏] 无论如何，那事于你无关。
李阳疯狂英语句子速成
李阳疯狂英语句子速成李阳疯狂英语句子速成1. Absolutely. (用于答话）是这样;当然是;正是如此;绝对如此。
2. Absolutely impossible! 绝对不可能的！3. All I have to do is learn English. 我所要做的就是学英语。
4. Are you free tomorrow? 你明天有空吗?5. Are you married? 你结婚了吗？6. Are you used to the food here? 你习惯吃这儿的饭菜吗？7. Be careful. 小心／注意。
8. Be my guest. 请便／别客气。
9. Better late than never. 迟到总比不到好。
10. Better luck next time. 祝你下一次好运。
11. Better safe than sorry. 小心不出大错。
12. Can I have a day off? 我能请一天假吗？13. Can I help? 要我帮忙吗？14. Can I take a message? 要我传话吗？15. Can I take a rain check? 你能改天再请我吗？16. Can I take your order? 您要点菜吗？17. Can you give me a wake-up call? 你能打电话叫醒我吗？18. Can you give me some feedback? 你能给我一些建议吗？19. Can you make it？你能来吗？20. Can I have a word with you? 我能跟你谈一谈吗？21. Catch me later. 过会儿再来找我。
22. Cheer up! 高兴起来！振作起来！23. Come in and make yourself at home. 请进，别客气。
24. Could I have the bill, please? 请把账单给我好吗？25. Could you drop me off at the airport? 你能载我到飞机场吗？26. Could you speak slower? 你能说得慢一点吗？27. Could you take a picture for me? 你能帮我拍照吗？28. Did you enjoy your flight? 你的飞行旅途愉快吗？29. Did you have a good day today? 你今天过得好吗?30. Did you have a nice holiday? 你假期过得愉快吗？31. Did you have fun？你玩得开心吗？32. Dinner is on me. 晚饭我请客。
李阳-疯狂英语精选365句 完全版
李阳英语365句1.Absolutely.(用于答话）是这样;当然是;正是如此;绝对如此。
2.Absolutely impossible!绝对不可能的！3.All I have to do is learn English.我所要做的就是学英语。
4.Are you free tomorrow?你明天有空吗?5.Are you married?你结婚了吗？6.Are you used to the food here?你习惯吃这儿的饭菜吗？7.Be careful.小心／注意。
8.Be my guest.请便／别客气。
9.Better late than never.迟到总比不到好。
10.Better luck next time.祝你下一次好运。
11.Better safe than sorry.小心不出大错。
12.Can I have a day off?我能请一天假吗？13.Can I help?要我帮忙吗？14.Can I take a message?要我传话吗？15.Can I take a rain check?你能改天再请我吗？16.Can I take your order?您要点菜吗？17.Can you give me a wake-up call?你能打电话叫醒我吗？18.Can you give me some feedback?你能给我一些建议吗？19.Can you make it？你能来吗？20.Can I have a word with you?我能跟你谈一谈吗？21.Cath me later.过会儿再来找我。
22.Cheer up!高兴起来！振作起来！e in and make yourself at home.请进，别客气。
24.Could I have the bill,please?请把账单给我好吗？25.Could you drop me off at the airport? 你能载我到飞机场吗？26.Could you speak slower?你能说得慢一点吗？27.Could you take a picture for me?你能帮我拍照吗？28.Did you enjoy your flight?你的飞行旅途愉快吗？29.Did you have a good day today?你今天过得好吗?30.Did you have a nice holiday?你假期过得愉快吗？31.Did you have fun？你玩得开心吗？32.Dinner is on me.晚饭我请客。
李阳疯狂英语 拿手好戏卡系列
李阳疯狂英语拿手好戏卡系列（转贴）李阳疯狂英语拿手好戏卡系列李阳疯狂英语拿手好戏卡 1第一拿手好戏：社交性寒暄的全面总结用英语交流，第一关是最平常(ordinary;common)，也是最重要的，几乎构成了日常生活，商务交往中的主要部分。
做得好能给人留下深刻印象，使自己如鱼得水，(like a stranded fish put back into water ) 瀟酒应酬。
同时也给自己带来巨大语言学习满足感!但这也是最难自如应用的部分!这第一关就是“社交性的寒喧”。
当中外人士夸奖我英文说得地道时，我最后发现我并没有和他们深谈。
不过就是脱而出这些社交性的寒喧(greetings) 。
可惜的是，绝大多数中国英语学习者苦学英语这么多年，连最基本的“打招呼”都没有搞清楚!十岁的中国小孩如果不会用中文打招呼，一定是“弱智”!我教的七岁小孩，第一天就能脱口而出下面的精彩句子，你呢？1. A: How are you doing? (你好吗?)(比How are you?更地道，更亲切!学了十年英语的人也没几个会说!下次见了外国人只管脱口而出，一定会一鸣惊人!)B: I'm doing fine/OK/pretty (相当；颇)well/great(极好的；超乎寻常的)/super(特级的；特佳的)/terrific(非常的；了不起的)/so-so. (很好/好/挺好的/棒极了/太好了/好得不得了/一般。
)或: Not bad. /The same as ever. /I can't complain(抱怨；发牢骚) too much. (还过得去/和以前一样/我不能太抱怨。
/还不错。
)因为用“How are you doing?”打招呼显得比较亲切，所以如果你不太舒服，可以如实回答：C: Terrible.（极糟糕的；极差的） I've had a headache all morning. （难受极了，我整个早上都头痛。
李扬疯狂英语通用口语课程中级教材
李阳疯狂英语通用口语课程中级教材Crazy EnglishMake the voice of Chinabe widely heard throughout the world! Practice Makes PerfectStart your day:Practice English in your dreams.Practice English when you wake up in the morning. Practice English when you wash your face!Practice English when you brush your teeth! Practice English when you comb your hair!Practice English when you put on your clothes!On the way:Practice English on the bus.Practice English in the car.Practice English on your way to work!Practice English on your way to school!Practice English when you walk.Practice English when you fall down. Everywhere:Practice English when you go shopping.Practice English in restaurants.Practice English in elevators.Eating:Practice English before you eat to get hungry. Practice English after you eat to digest.Don’t practice English while you eat.Bathroom:Practice English when you are in the bathroom! Practice English when you piss.Practice English when you shit.In the evening:Practice English while you clean up your room. Practice English instead of watching TV. Practice English when you go to sleep at night. Practice English anytime you can catch the chance.熟能生巧开始一天：做梦时练英语。
李阳疯狂英语365句
[00:03.10]1. Absolutely. (用于答话)是这样；当然是；正是如此；绝对如此。
[00:14.65]2. Absolutely impossible! 绝对不可能的！[00:24.94]3. All I have to do is learn English. 我所要做的就是学英语。
[00:36.36]4. Are you free tomorrow？你明天有空吗？[00:45.54]5. Are you married？你结婚了吗？[00:54.00]6. Are you used to the food here？你习惯吃这儿的饭菜吗？[01:04.58]7. Be careful. 小心／注意。
[01:13.00]8. Be my guest. 请便／别客气。
[01:22.00]9. Better late than never. 迟到总比不到好。
[01:31.72]10. Better luck next time. 祝你下一次好运。
[01:41.37]11. Better safe than sorry. 小心不出大错。
[01:51.27]12. Can I have a day off？我能请一天假吗？[02:02.50]13. Can I help？要我帮忙吗？[02:10.64]14. Can I take a message？要我传话吗？[02:19.75]15. Can I take a rain check？你能改天再请我吗？[02:30.08]16. Can I take your order？您要点菜吗？[02:39.12]17. Can you give me a wake-up call？你能打电话叫醒我吗？[02:49.84]18. Can you give me some feedback？你能给我一些建议吗？[03:00.43]19. Can you make it？你能来吗？[03:08.56]20. Can I have a word with you？我能跟你谈一谈吗？[03:18.50]21. Cath me later. 过会儿再来找我。
疯狂英语句子速成 sentences1-99
00:00.00]Li Yang Crazy English Sentences Crash course;李阳疯狂英语口语速成系列之句子速成[00:07.92]365 key sentences for international Chinese.;国际化中国人必备英语365句.[00:29.24]Li Yang's words. 李阳的话.;[02:14.75]This is Kim.And I'm telling you teacher Li is right.;我是Kim.李老师说得对.[02:19.36]365 key sentences for international Chinese;国际化中国人必备365句[02:24.25]can make huge difference in your English.;能使你的英语发生巨变.[02:27.07]One sentence a day can give you the power to be an international Chinese.;一天一句给你成为国际化中国人的力量.[02:40.20]Li Yang's words. 李阳的话.;[03:01.15]1.Absolutely;1.(用于答话)是这样; 当然是;正是如此;绝对如此;没错;太对了![03:07.59]2.Absolutely impossible!;2.绝对不可能！[03:17.06]3.All I have to do is learn English.;3.我所要做的是就是学英语.[03:26.66]4.Are you free tomorrow?;4.你明天有空吗？[03:33.86]5.Are you married?;5.你结婚了吗？[03:40.35]6.Are you used to the food here?;6.你吃得惯这儿的饭菜吗？[03:48.54]7.Be careful.;7.小心/注意.[03:55.15]8.Be my guest.;8.请便.[04:01.25]9.Better late than never.;9.迟到总比不到好.[04:09.43]10.Better luck next time.;10.祝你下一次好运.[04:18.02]11.Better safe than sorry.;11.小心不出大错.[04:27.26]12.Can I have a day off?;12.我能请一天假吗？[04:39.76]13.Can I help?;13.要我帮忙吗？[04:47.00]14.Can I take a message?;14.要我传话吗？[04:56.40]15.Can I take a rain check?;15.你能改天在请我吗？[05:06.49]16.Can I take your order?;16.你要点菜吗？[05:16.71]17.Can you give me a wake-up call?;17.你能打电话叫醒我吗？[05:28.41]18.Can you give me some feedback?;18.你能给我一些建议吗？[05:38.98]19.Can you make it?;19.你能来吗？[05:46.49]20.Can I have a word with you?;20.我能跟你谈一谈吗？[05:56.23]21.Catch me later.;21.过会儿再来找我.[06:05.00]22.Cheer up!;22.高兴起来！振作起来！[06:11.82]e in and make yourself at home.;23.请进，别客气. [06:24.15]24.Could I have the bill,please?;24.请把帐单给我好吗？[06:34.09]25.Could you drop me off at the airport?;25.你能载我到飞机场吗？[06:46.71]26.Could you speak slower?;26.你能说得慢一点儿吗？[06:57.68]27.Could you take a picture for me?;27.你能帮我照张相吗？[07:09.57]28.Did you enjoy your flight?;28.你的飞机旅途愉快吗？[07:19.43]29.Did you have a good day today?;29.你今天过得好吗？[07:31.23]30.Did you have a nice holiday?;30.你假期过得愉快吗？[07:41.57]31.Did you have fun?;31.你玩得开心吗？[07:49.95]32.Dinner is on me.;32.晚饭我请客.[07:58.60]33.Do you have a room available?;33.你们有空房间吗？[08:08.72]34.Do you have any hobbies?;34.你有什么爱好吗？[08:17.99]35.Do you have some change?;35.你有零钱吗？[08:28.04]36.Do you mind my smoking? (I sure do.);36.你介意我抽烟吗？ (当然介意）[08:50.61]37. (Here's a good one for me.) Do you often work out?;37. （这句话对我很好）你经常锻炼身体吗？[09:01.22](About four times a week. Yep,four times a week.;（大约一周四次。
李阳疯狂英语之100个超级短句
一百个超级短句反复操练、滚瓜烂熟、据为己有、随时卖弄!【疯狂短评】人们在日常生活中不离口的都是小词、短句。
学会使用适当的惯用语短句进行交谈，就会让别人觉得你的英语地道、精炼而流利。
我们每期为你精选的100个超级短句都是在美国好莱坞电影中频频出现的最常用、最时髦的口语精华，帮助大家表达英语更加地道、生动、活泼、自然。
【Kim’s Note】When Americans speak they like to use as few words as possible to get their meaning across. Learning these spoken elements will make you sound natural and more like a native speaker. These are the sentences that appear in movies and TV shows because they are the most authentic American English. These sentences are the way people really talk to each other! The formal dialogues in most traditional textbooks sound very unnatural and are more difficult to learn.【李老师的建议】上面的这段话一定要用―三最法‖脱口而出！一步登天，显示出你对美国、美国语言、美国文化的了解。
【录音说明】1. Any more?（还有吗？/ 还要吗？）2. Are you alone?（你一个人吗？）3. Are you ready?（你准备好了吗？）【Kim’s Note】I always use this sentence to encourage someone who is taking too long. Teacher Li has heard me use this sentence hundreds of times!4. Be my guest.（别客气！/ 请用！）【Kim’s Note】If you use these three little words when someone makes a request, you will amaze people with your English. In fact, if you say this when someone is just looking at an empty seat beside you, they will feel grateful and relieved! It is much more eloquent than saying ―Sit down please!‖【疯狂实战】A: Pardon me, Miss, but may I sit here?（对不起，小姐，我可以坐这里吗？）B: Be my guest.（当然，别客气！）5. Can you believe it?（你能相信吗？）6. Don’t argue!（不要争辩！）7. Don’t be childish.（别那么孩子气。
李阳疯狂英语脱口而出_完美打印版
李阳疯狂英语脱口而出第三辑目录第一部疯狂精神篇; (1)My Pledge My OathIII;我的誓言III (1)第二部疯狂准备篇; (1)第一节疯狂演绎一百个句型以一顶十、以一顶百的核裂变超级句型; (1)第二节一百个纯正时尚、精炼达意的口语要素, 英语语言精华集中奉献!; (7)第三节一个最疯狂、最典型的美国发音奉献"小开口45度音"［e］; (9)【经典绕口令】; (9)【二十大精彩例句】; (9)第四节四星级五星级六星级单词全面奉献; (10)generation; (10)额外奉献十个以-tion 结尾的常用名词; (10)第五节语法大战短文操练语法，轻松突破语法!; (12)第一篇：在医院--if 和whether 引导的宾语从句; (12)第二篇公寓问题--现在完成进行时; (12)第六节三最短文--中国成功加入世贸!; (13)第七节成语的挑战--征服成语，让英语形同母语!; (13)第三部疯狂英语卖弄篇; (14)第一节参加观光团的自我介绍--展现自我风采，广交天下朋友!; (14)第二节笑话与幽默--茶余饭后的卖弄!; (15)第三节用英语讲中国成语故事--向老外炫耀中国语言文化的博大精深!; (15)成语故事一对牛弹琴;1.Playing the Lute to a Cow; (15)成语故事二刻舟求剑;2.Notching the Boat to Find the Sword; (16)成语故事三杞人忧天;The Man of Qi Who Worried that the Sky Would Fall; (16)成语故事四谈虎色变;Turn Pale at the Mention of a Tiger; (16)第四节副词大战--准确表达个人意愿和感情!; (17)第四部疯狂实战篇; (19)第一节请你来当播音员--超级模仿秀大赛!; (19)第二节广告配音员的梦想--梦幻之声，撼动心灵!; (20)经典广告一HIV/AIDS Awareness 爱滋病毒爱滋病防范意识; (20)经典广告二Alibaba. com 阿里巴巴网站; (20)第三节成功翻译必备中英文双语自由转换，国际化人才的必经之路!; (20)第四节善于制造气氛的主持人--让你成为万众瞩目的焦点!; (21)第五节成功演讲家必备--脱口而出欢迎辞!; (21)Greeting Newcomers 欢迎新进人员; (21)Receiving Foreign Guests 迎接外宾; (22)第六节商务谈判高手之路--察言观色、明争暗斗、寸土必争的谈判技巧!; (22)第七节脱口而出求职信--助你在芸芸众生中脱颖而出!; (23)第八节国际导游必备--指引人们发现美丽、享受美丽!; (23)第五部疯狂挑战篇; (24)第一节地道美语--让美国人误认为你是老乡!; (24)Cat Proverbs and Sayings 与猫相关的英语谚语和俗语; (24)Dog Proverbs and Sayings 与狗相关的英语谚语和俗语; (25)第二节高级口译自测; (25)第六部疯狂奉献篇; (27)第一节教你一招--如何在面试中脱颖而出; (27)第二节：10句与时间相关的谚语--珍视光阴!时光飞逝，惟有实力永存!; (28)第一部疯狂精神篇;My Pledge My OathIII;我的誓言IIIToday I believe- This unique trip will completely change my life!;今天我相信-- 这段特殊的旅程将彻底改变我的一生!Today I believe- That all my efforts will produce generous returns!;今天我相信-- 我所有的付出终将得到丰厚的回报Today I believe- English will be a powerful weapon in my life!;今天我相信-- 英语一定会成为我人生奋斗的强有力的武器!Therefore,I must devote all my energy to learning English with high spirit,; enthusiasm and vigor!;I will enjoy losing face!;I will pour all my effort into leaning English.;所以，我一定要精神饱满、热情高涨、热爱丢脸、疯狂投入!I must be absolutely responsible for myself!;我必须对自己百分之百地责任!I must not waste one minute, or even one second!;我必须每一分每一秒全力以赴!I must challenge my limits and then surpass them!;挑战极限、超越自我!I will conquer English and charge toward success!;征服英文，迈向成功!I can speak good English!;我一定能讲一口最漂亮的英文!第二部疯狂准备篇;第一节疯狂演绎一百个句型以一顶十、以一顶百的核裂变超级句型; 1．According to...按照/根据……;According to my watch, it's five twenty now.;按我的手表看，现在是5点20分。
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人类新基因C17orf32的电子克隆和编码区序列RT2PCR验证3
张德礼1)33 丁培国1) 凌伦奖2) 陈润生2) 马大龙1)(1)北京大学人类疾病基因研究中心,国家人类基因组北方研究中心,北京100083;
2)中国科学院生物物理研究所,北京100101
)
摘要 利用生物信息学与实验验证的技术路线,成功地克隆了人类新基因C17orf32的cDNA(GenBank登记号:
AY074907和TPA:BK000260),发现C17orf32的完整开放阅读框架(ORF,31～657bp)cDNA(627bp)与人
类假定基因LOC124919ORF(25～807bp)的25～651位只有一个碱基不同.经RT2PCR验证并cDNA测序、人类表达序列标签(EST)数据库的BLAST检索和基因组成规律分析三方面的结果,均支持C17orf32的序列,
而不支持LOC124919的编码序列.C17orf32基因组序列全长41610kb,含有6个外显子和5个内含子,cDNA序列全长1679bp,ORF横跨全部6个外显子.该基因ORF翻译起始处符合Kozak规则,ORF起始码上游同一相位有终止码,ORF后有2个加尾信号和PolyA尾.C17orf32基因的成功克隆表明,NCBIGENOMEAnnotation
Project在2001年12月预测的人类假定蛋白XP-058865编码基因LOC124919的模式参考序列XM-058865中存在偏差,即在C17orf32基因cDNA的406与407位碱基之间错误插入一个碱基G,从而导致在插入位点后,
ORF编码125位氨基酸以后蛋白质序列的改变,出现260个氨基酸的多肽.因此,应慎重看待计算机注释的人类基因组编码序列.建立的技术路线有助于发现更多新的人类功能基因.
关键词 C17orf32,LOC124919,XM
-058865,XP-058865,生物信息学,电子克隆,RT2PCR,
人类基因组注释
学科分类号 Q81114
随着基因定位(连锁图谱、物理图谱、转录图谱)和人类基因组测序及生物信息技术的迅猛发展,
特别是人类基因组工作框架图和精细图谱及其初步分析结果的先后公布[1,2],表达序列标签(EST)已
成为人类寻找未知功能的新基因,以及克隆不同时空差异表达基因和疾病相关基因的重要标志物[3～6].
基于EST的电子克隆(insilicocloning)和定位候选克隆策略已成为克隆新基因的主要方法,并在虚拟的网上空间将模式生物基因组的研究成果成功地应用于人类基因组的研究[7～10].C17orf32是单纯采用
生物信息学方法,电子克隆成功并初步实验验证的人类新基因之一.
1 材料和方法111 计算机克隆的策略和技术路线本研究利用人类EST公共数据库,采用解放军参谋部三部的神威Ⅳ型超级计算机运行SiClone
软件(中国科学院生物物理研究所凌伦奖与陈润生教授设计)进行ESTContig序列的全自动化拼接和校对,以BLAST比对为基本方法进行人类新基因大规模搜寻工作,力求至少搜寻到100～300个新的人类cDNA(400～3000bp,包含编码100～300个氨基酸残基的完整开放读码框架),采用
cDNA序列基因预测软件、包含校对过的cDNA的复原基因组序列预测基因软件、蛋白质功能结构预测软件,筛选出30～50个具有典型基因特点和一定功能结构域的人类新基因候选对象,再通过逆转录聚合酶链式反应(RT2PCR)克隆cDNA序列,
得到重组质粒后,通过基因表达谱分析等实验技术验证其客观存在性.技术路线同文献[11]:a1下载人类EST公共数据库的心脏表达cDNA序列.
b1相同Unigene或Cluster的EST片段归类在一起,并初步拼接和校对(SiClone软件完成).c1基于GenBank完整EST数据库的EST拼接、校对并尽可能延长获得大片段或全长cDNA(SiClone软件完成),获得Contig.d1Contig输入nr数据库通过BLAST查新选留新颖Contig,通过人类基因组图谱验证Contig.e1通过GenBank完整EST数据库和人类基因组图谱双重比对按权重校对确定最终cDNAContig;本实验Contig015574源1119bp新cDNA片段经延长和校对,最终成为1679bpcDNAContig,并受人类基因组图谱的完全支持.f1分析包含候选开放读码框架(ORF)的Contig
3中国博士后科学基金资助项目(2920011217608062000).
33通讯联系人.Tel:010262092541
E2mail:delizhang@bjmu.edu.cn;delizhang2000@sohu.com
收稿日期:2002203208,接受日期:2002203228
・345・2002;29(4) 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.
© 1995-2003 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.cDNA典型基因特征,如ORF前有无终止码和启动子,Kozak规则,加尾信号,polyA等;如有基因组序列存在,用ContigcDNA替换基因组序列的相应部分,获得以最终cDNA校对的人类基因组序列.g1启用蛋白质功能结构和/或三维结构预测软件,分析基于序列或三维结构的ORF相应氨基酸序列的独特功能结构域.h1新基因实验克隆、确认并为功能研究提供线索.所用生物信息学软件包括Pcgene,DNAsis和ORFfinder等.112 实验克隆11211 质粒和菌株:质粒pGEM2T2easy载体购自Promega公司;E.coliXL12blue由王琰教授馈赠.11212 工具酶及试剂:限制性内切酶,DNA修饰酶,T4DNA连接酶,TaqDNA聚合酶购于BoehringerMannheim,GIBCO2BRL,Promega,TaKaRa等公司.DNA分子质量标准DL2000是TaKaRa公司产品.其他常规试剂均按《分子克隆手册》配制.11213 引物的合成:根据计算机克隆所得到的完整cDNAORF(编码208个氨基酸残基)设计5′和3′扩增引物.5′引物:5′ATGGCGTCCTCTTTGCTTG3′;3′引物:5′CGGGATCCAGTTCTCCCAGCTCGCC3′.采用NetPrimer引物分析软件评价设计引物.引物由北京赛百盛公司合成.该RT2PCR引物覆盖C17orf32基因完整ORF,仅不含终止码TAA,即从ORF终止码TAA开始序列改为GATCCCG,以便融合表达进行细胞定位.11214 PCR反应:采用RT2PCR方法,以MGC803人胃腺癌细胞系[12]cDNA文库为模板,在2400PCR仪(RPE公司)上进行扩增30个循环[11].反应完毕后取10μl于1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,确定后,再取10μlPCR产物用Silica回收亚克隆化.11215 重组测序质粒的构建:载体pGEM2T2easy和PCR产物(摩尔比为1∶3)用DNA连接试剂盒溶液水浴14～16h.
11216 测序策略及方法:由本室用ABIPRISM3100GeneticAnalyzer进行测序.用T7和Sp6通用引物进行正反向测序.
2 结果与讨论211 RT2PCR结果21111 PCR的扩增:PCR结果经1%琼脂糖凝胶电泳分析出现单一条带,约631bp,与预计大小相符(图1).
21112 重组质粒的构建及酶切鉴定:将末端带A的PCR产物,插入pGEM2T2easy载体的多克隆位点的LacZ基因中,获得的重组质粒命名为pGEM2Teasy2RC208.该重组质粒经EcoRⅠ双酶切后,电泳显示的片段与预计的相符.
212 测序结果及分析将重组的pGEM2Teasy2RC208重组质粒,用全自动测序仪进行序列分析(图2和图3).测序
Fig12 Resultof621bpORFsequencingofC17orf32cDNAGenBankaccessionnumber:AY074907andTPA:BK000260.
・445・生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2002;29(4
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© 1995-2003 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.Fig13 Thefull2length1679bpcDNAsequenceofC17orf32anditscodingproteinof208aminoacidsGenBankaccessionnumber:AY074907andTPA:BK000260.
・545・2002;29(4) 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.
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