简化基因组测序RAD技术
基于RAD-seq_的菜心InDel_标记开发及应用
广东农业科学Guangdong Agricultural Sciences 2024，51（3）：91-102 DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2024.03.009许玉富，黄依琳，李荣华，黄红弟，郭少龙，李光光，郭培国，夏岩石. 基于RAD-seq的菜心InDel标记开发及应用［J］. 广东农业科学，2024，51（3）：91-102.XU Yufu, HUANG Yilin, LI Ronghua, HUANG Hongdi, GUO Shaolong, LI Guangguang, GUO Peiguo, XIA Yanshi. Development and application of InDel markers in flowering Chinese cabbage based on RAD-seq［J］. Guangdong Agricultural Sciences, 2024，51（3）：91-102.基于RAD-seq的菜心InDel标记开发及应用许玉富1，黄依琳1，李荣华1，黄红弟2，郭少龙2，李光光3，郭培国1，夏岩石1（1.广州大学生命科学学院/广东省植物适应性与分子设计重点实验室，广东 广州 510006；2.广东省良种引进服务公司，广东 广州 510091；3. 广州市农业科学研究院，广东 广州 510308）摘 要：【目的】开发多态性丰富的的InDel分子标记，为菜心育种提供研究基础。
【方法】以Chiifu-401-42的基因组序列为模板，利用4份菜心材料的RAD-seq重测序数据，在全基因组范围内鉴定InDel位点。
利用生物信息学方法筛选4份菜心材料间具有潜在多态性的InDel 位点，挑选分布于10条染色体的80个InDel 位点设计引物，对55份菜心种质材料进行遗传多样评价。
【结果】通过与参考基因组序列比对，在4份菜心材料的重测序数据中共鉴定出84 510个InDel位点，其中插入/缺失长度大于5 bp的3 609个InDel位点在4份菜心材料间具有潜在多态性。
景观基因组学方法在保护生物学研究中的应用与前景
DOI ：10.11913/PSJ. 2095-0837. 23166王天瑞，邱英雄. 景观基因组学方法在保护生物学研究中的应用与前景[J ]. 植物科学学报，2023，41（6）：741−750Wang TR ，Qiu YX. Application and prospects of landscape genomics in conservation biology [J ]. Plant Science Journal ，2023，41（6）：741−750景观基因组学方法在保护生物学研究中的应用与前景王天瑞1, 2，邱英雄1 *（1. 中国科学院武汉植物园，武汉 430074； 2. 中国科学院大学，北京 100049）摘 要： 生物多样性是人类生存与发展的基础，全球气候的快速波动正对生物多样性造成严重威胁。
保护生物学旨在研究全球生物多样性面临的危机及如何更加有效地进行生物多样性保护。
景观基因组学（Landscape ge-nomics ）研究通过解析基因型与环境因子之间的关联性，揭示物种响应气候变化的适应性遗传变异与适应性进化，推动了保护生物学的快速发展。
本文简要阐述了景观基因组学解析物种适应性遗传变异空间分布格局的主要研究方法，总结了近年来景观基因组学方法在动植物保护研究中的应用案例，并针对景观基因组学方法在保护生物学研究中存在的问题及未来研究方向提出了建议。
关键词： 生物多样性；气候变化；适应性遗传变异；景观基因组学；保护生物学中图分类号：Q346 文献标识码：A 文章编号：2095-0837（2023）06-0741-10Application and prospects of landscape genomics inconservation biologyWang Tian-Rui1, 2，Qiu Ying-Xiong1 *（1. Wuhan Botanical Garden , Chinese Academy of Sciences , Wuhan 430074, China ； 2. University of Chinese Academy of Sciences ,Beijing 100049, China ）Abstract ：Biodiversity serves as the foundation of human survival and development yet faces significant threats from rapid global climate fluctuations. Conservation biology seeks to address this global biodiversity crisis by developing more effective conservation strategies. By analyzing the relationship between genotypes and environmental factors, landscape genomics can reveal the adaptive genetic variations and evolutionary responses of species to climate change, leading to the rapid development of conservation biology. In this re-view, we discuss the major methodologies used to analyze the distribution patterns of adaptive genetic varia-tion in species. We also summarize recent findings in landscape genomics as applied to the conservation of plants and animals. Finally, we address current challenges and suggest future research directions in the use of landscape genomics for conservation biology, offering targeted recommendations.Key words ：Biodiversity ；Climate change ；Adaptive genetic variation ；Landscape genomics ；Conserva-tion biology生物多样性作为地球上生命体的重要特征之一，是人类社会赖以生存和发展的物质基础[1, 2]。
动植物全基因组重测序简介
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
基于全基因组重测序技术，人们可以快速进行资源普查筛选，寻找到大量遗传变异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
随着测序成本降低和拥有参考基因组序列物种增多，全基因组重测序成为动植物育种和群体进化研究迅速有效的方法。
简化基因组测序技术是对与限制性核酸内切酶识别位点相关的DNA进行高通量测序。
RAD-seq（Restriction-site Associated DNA Sequence）和GBS （Genotyping-by-Sequencing）技术是目前应用最为广泛的简化基因组技术，可大幅降低基因组的复杂度，操作简便，同时不受参考基因组的限制，可快速鉴定出高密度的SNP位点，从而实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
简化基因组技术尤其适合于大样本量的研究，可以为利用全基因组重测序技术做深度信息挖掘奠定坚实的基础。
全基因组重测序和简化基因组测序技术可广泛应用于变异检测、遗传图谱构建、功能基因挖掘、群体进化等研究，具有重大的科研和产业价值。
产品脉络图。
简化基因组测序RAD技术
基于酶切的简化基因组测序(RAD)
1. 对于群体进化研究，个体的混样策略是怎样的？
答：如果更关注群体间的遗传多样性差异，希望消除群体内个体遗传差异带来的干扰，可以采用群体内个体混样的策略，我们会进一步在生物信息分析流程中采用优化的群体内SNP纠错与过滤程序达到分析目的。
2. 我们的RAD-Seq建库测序策略是怎样的？
答：建库策略选择基于综合考虑序列碱基质量、测序成本和物种基因组情况，主要有Single‐end 50 bp和Pair‐end 90 bp。
对于有参考基因组的物种，我们建议采用PE90文库测序。
对于无参考基因组的物种，则建议采用SE50文库测序。
3. RAD-Seq测序结果受哪些因素影响？测序成功的标准是什么？
答：设备、耗材、操作问题等方面都会对测序的结果造成影响。
测序成功标准包括：reads 数达标，错误率低，Q20高等。
群体进化-基于简化基因组测序
X. malinche X. birchmanni
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
B
X. nezahualcoyotl
X. montezumae
X. nigrensis
X. multilineatus
X. pygmaeus
X. continens
C
X. alvarezi
X. signum
X. mayae
X. hellerii
X. kallmani X. mixei
minor allele frequency
Sword Intermediate No sword
X. meyeri
X. gordoni
X. couchianus
X. variatus
X. evelynae
A
X. milleri
X. xiphidium
X. andersi
X. maculatus
X. cortezi
参考基因组未知
tag聚类、局部组装 SNP检测及统计 构建系统进化树 群体主成分分析 群体遗传结构分析
标准分析为90天，个性化分析需根据项目实际情况进行评估
案例解析
［案例一］ RAD-seq 研究剑尾鱼属的系统发生关系[1] 剑尾鱼属（花鳉科）包括26种来自中美洲的热带小型淡水鱼，外 型上最吸引人的莫过于雄鱼的剑尾。关于剑尾鱼属的系统发生关 系一直存在争议，本文用RAD-seq来解决这一问题。26种鱼每种 测5个个体，作为外群的3种鱼每种测2-7个个体，共测序143个个 体，平均每个个体每个位点覆盖深度为15X，找到约66,000个 SNP，以从未有的精度构建了剑尾鱼属的系统发育树。
简化基因组-GBS
GBS 300ng 96 或 96 的倍数 PCR 扩增选择片段大小 200Mb
略少 更低
2、 什么情况下适合体的物种，有无参考基因组均可；尤其适合重复序
列较多的物种，如玉米、高粱等。 3、GBS 为什么比较适合重复序列高的物种？
因为 GBS 选择的酶 ApekI 是一种甲基化敏感酶，位于高重复区域的酶切识别位点容易发 生甲基化，不能被 ApekI 切开，因此可以避开高重复区域，得到的标记有效性更高。
简化基因组-GBS
1、GBS 和 RAD 都是简化基因组技术，区别在哪里？
GBS 和 RAD 都是基于酶切处理的简化基因组技术，主要区别如下：
区别 DNA 起始量 Pooling 数目 片段大小选择方法
测序量 SNP 成本
RAD 1ug 4/8/16/24 随机打断选择片段大小 根据基因组大小而定 较多 低
新一代测序领域中的RAD
会议综述新一代测序领域中的RADH. C. ROWE, S. RENAUT and A. GUGGISBERGRAD技术最初用于低成本的芯片分型原料(Miller et al. 2007)。
但是第二代测序技术的到来以及大幅度成本的降低，使得短片段测序和RAD的分型技术结合起来(Baird et al. 2008)。
RAD测序先将接头连接在经过酶切的DNA片段，然后再进行剪切，将测序重点放在标记过的限制性位点，而不是在整个基因组上随机的测序。
这种方法极大的提高了给定序列位点的覆盖范围，提高了碱基识别的可信性和在多样本中同一位点被测序的可能性。
ＲＡＤ测序提供了一个开发ＳＮＰ极为有效的的方法。
It was initially developed by Dr. Eric Johnson at the University of Oregon and later expanded into commercial services for plant (Floragenex)and ‘other’(Biota Sciences) genome studies. This ‘centre of origin’has led to the strong representation of fish and plants in studies employing RAD sequencing, as reflected in the organization of the symposium into ‘Plant Genom-ics’and ‘Marine and Conservation Genomics’sections,capped by a ‘Technology and Bioinformatics’section 然而随着ＲＡＤ及其类似技术在科学界的推广，论坛形式更多是关于它的数据应用而不是生命研究。
Illumina平台测序原理及常见测序文库构建
应用： 转录本的种类和基因 定量 基因的转录结构 可变剪切 发现新的转录本
真核生物
总RNA
原核生物
利用Oligo (dT)富 集mRNA
去除 rRNA
将mRNA 随机打断成 ~200 nt
桥式PCR：
冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR
线性化：
将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除
阻断3’–OH： 防止在后续测序过程中继续延伸DNA链
杂交测序引物
DNA模板杂交和一链合成
单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交
以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头ng Primer
此单链部分与 FlowCell表面上P7接
头相同
此单链部分与 FlowCamples
cBot HiSeq2500
MiSe液相杂交
• 液相杂交是通过在溶液中， 利用链碱基配对的原理， 将DNA片段与探针杂交， 然后洗脱，富集目的片段。
Exon测序
特点
• 优点：
• 不足：
• 1、 与全基因组测序相比，外 显 • 1、与全基因组测序相比，不能
子测序具有测序覆盖度更深、 数 检测到基因组内较大的结构性
4种 Fl-NTP’s +
聚合酶
拍照，收集信号
去阻断，切除荧光基团
X 36 - 151
可逆终止化学反应
• 一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子) • 准确度高 • 可以得到同聚物序列
• 合成 • 照相，收集信号 • 去阻断，切除荧
光基团
下一个碱基合成
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基于酶切的简化基因组测序(RAD)
1. 对于群体进化研究，个体的混样策略是怎样的？
答：如果更关注群体间的遗传多样性差异，希望消除群体内个体遗传差异带来的干扰，可以采用群体内个体混样的策略，我们会进一步在生物信息分析流程中采用优化的群体内SNP纠错与过滤程序达到分析目的。
2. 我们的RAD-Seq建库测序策略是怎样的？
答：建库策略选择基于综合考虑序列碱基质量、测序成本和物种基因组情况，主要有Single‐end 50 bp和Pair‐end 90 bp。
对于有参考基因组的物种，我们建议采用PE90文库测序。
对于无参考基因组的物种，则建议采用SE50文库测序。
3. RAD-Seq测序结果受哪些因素影响？测序成功的标准是什么？
答：设备、耗材、操作问题等方面都会对测序的结果造成影响。
测序成功标准包括：reads 数达标，错误率低，Q20高等。