酿酒酵母缺陷型菌株的筛选

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实验说明
• 1.本实验采用的诱变剂是物理诱变剂——紫外线。紫外线诱变处理的有效波长为 200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。dna和rna的嘌呤和嘧啶吸收 紫外光后，dna分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱 双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能 引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响dna的复制和转录. 总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。 2.利用酵母菌进行诱变工作，首先要获得单倍体菌株。在二倍体细胞中，隐性性状（突 变往往是隐性）不能表现。而单倍体细胞，隐性突变性状就能直接表现。因此，获得 单倍体细胞对诱变工作来说是重要的。 一个简单的办法是：利用营养细胞和子囊孢子的耐热性差异进行热处理，就能很容易 得到单倍体细胞。具体做法是把二倍体营养细胞接种于产孢子培养基的斜面上，用5毫 升无菌水制成悬浊液，将此悬浊液浸于55℃—60℃恒温水浴中，不断振荡处理约10分 钟（处理时间，根据对营养细胞耐热性预备试验而定。一般以约106—107的营养细胞 菌悬液经一定时间处理后，用接种环挑取一环菌液接种于完全平板或斜面，30℃培养2 天后，看完全不生长或只有一两个菌落生长为标准作为所需的处理时间）。处理后， 用自来水迅速冷却，适当稀释涂布于完全培养基平板，30℃培养2天后，用接种环挑取 较小的圆锥形菌落镜检，从形态上判断单倍体细胞。用这方法，一般要划线纯化后较 为可靠。为了进一步提高可靠性，可接种于产孢子培养基上看是否产孢子来确定。如 先用一定浓度的纤维素酶处理，再进行热处理可提高获得单倍体细胞的效率。
2.诱变处理
• • （1）从30℃水浴中取出另一支菌悬液，倒入灭菌培养皿中。将培养皿至于紫 外灯下，打开紫外灯照射1h，打开培养皿盖照射。 （2）等待时间进行对照组处理。时间到关闭紫外灯，盖上培养皿盖。将培养 皿中液体吸回原离心管中，用少量生理盐水冲洗培养皿并定容到10ml刻度处。 立即离心（3500转/分10min），弃去上清液，加无菌水至5毫升打匀菌块， 再加生理盐水至10ml，制成菌悬液（号液）。 （3）将熔化不烫手的完全培养基倒入灭菌培养皿中（每皿15—20毫升）， 放平待凝，共6皿。 （4）将经紫外线处理过的菌液稀释为10-3（希望每只培养皿中长50—100个 菌落。稀释方法：吸取号液0.1ml于1支灭菌离心管中，加生理盐水至10ml 刻度处作为号液，吸取号液0.1ml于1支灭菌离心管中，加生理盐水至 10ml刻度处作为号液，吸取号液0.1ml于1支灭菌离心管中，加生理盐水 至10ml刻度处作为号液），吸取0.1ml号液于上述预先倒好的培养皿中。 （5）用灭过菌的Y形涂棒将菌液涂匀，30℃培养3—4天，计算活菌数。 （6）计算杀菌率及存活率（从诱变组中选择不污染、菌落分布均匀、菌数适 中的培养皿留作下步影印备用）。
实验步骤
• 4.影印 • （1）准备好影印用丝绒布（高压灭菌，干燥箱内烘干备用）。 • （2）将一定数量的母平板和预先准备好的基本培养基及完全培养基 平板，以一个母平板，一个基本平板，一个完全平板作为一组，每组 编号，并在每个平板的底部用记号笔划上箭头作为标记。 • （3）将灭菌的丝绒布放在圆本柱上，用橡皮筋扣住（注意绒面不能 用手摸），先取母平板倒复在绒面上，然后用铅笔轻轻在皿底上均匀 地敲几下，取下母平板（放冰箱保存起来），立即把MM平板（基本 培养基平板）按箭头标记的相同方向复印上去（方法同上），取下 MM平板，再把CM平板（完全培养基平板）也按上述同样方法复印， 印毕，30℃培养2—3天。影印见图14－l。
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3.活菌计算（用没有经紫外线处理的菌液作对照）
• （l）从30℃水浴中取出一支菌悬液，然后用生理盐水稀 释到10-4、10-5（稀释方法：在菌悬液中加入生理盐水至 10ml作为A液，吸0.1mlA液于1支灭菌离心管中加入生理 盐水至10ml作为B液，再吸0.1mlB液于1支灭菌离心管中 加入生理盐水至10ml作为C液，再吸0.1mlC液于1支灭菌 离心管中加入生理盐水至10ml作为D液）。 • （2）将熔化不烫手的完全培养基倒入灭菌培养皿中（每 皿15—20毫升），放平待凝，共4皿。从D液中吸取0.1和 0.5ml于上述预先倒好的培养皿中，各做2皿，共4皿。 • （3）用灭过菌的Y形涂棒将菌液涂匀，先涂布低浓度小剂 量的，再涂布高浓度大剂量的，30℃培养2天，计算活菌 数。
实验步骤
• • 5.点种复证 （1）将每组复印的平板按箭头标记的同一方向进行比较，找出CM平板上生 长而MM平板上不生长的相应菌落，用记号笔在相应位置的母平板上作上记号， 并编号，以便进一步复证。 （2）准备MM平板和CM平板，平板数量可根据编号菌落多少而定，一个皿 可划36个格子左右。 （3）用灭菌牙签从母平板上挑取已编号的单菌落，按顺序在MM和CM平板 上的相应位置上点种，点毕，30℃培养2—3天左右。
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•存斜面上，用接种环 挑一些菌，接种到盛有5ml完全液体培养液的灭菌 离心管中，28℃—30℃培养16—18小时，共接2 支。
• （2）将培养过的菌液倒入盛有玻璃珠的灭菌三角 瓶中，振荡10分钟，使酵母菌充分均匀分散。
• （3）将上述菌液各吸4ml于2支灭菌离心管中离 心（3500转/分，10分钟），倒去上清液，各加无 菌水至5ml制成菌悬液，打匀菌块，并存放在 30℃水浴中备用。
实验结果
处 皿 稀释 取样 活菌总数 理 数 菌数 菌数 /ml /皿 对 4 照 存活菌数 菌数 /皿 菌数 /ml 突变型数 菌数 /皿 菌数 /ml 杀菌率 诱变率
10-4 或 者 10-5
10-3
0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1
紫 6 外 线
实验结果
啤酒酵母菌营养缺陷型菌株的筛选
实验原理
• 利用化学诱变剂诱发突变是遗传学研究和育种工作的常用手段。
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化学诱变剂按其诱变机理一般可分为三类：（1）通过掺入DNA分子引起突变，（2） 通过和DNA直接起化学反应后引起突变，（3）通过一对核苷酸的插入或缺失引起突变。 例如：以烷化剂亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）为诱变源，它的诱变机理属于第 二类。现在一般认为烷化剂的诱变机理主要是由于对鸟嘌呤N-7位置上的烷化作用（鸟 嘌呤其它位置以及其它碱基的许多位置也可能被烷化），然后被烷化的碱基同碱基结 构类似物作用机制一样，通过DNA复制，引起碱基错误配对导致碱基转换或颠换造成 基因突变。通常烷化后的碱基（G）偶然与胸腺嘧啶（T）错误配对代替胞嘧啶（C）。
NTG主要诱发GC—AT的转换。它除有较强的诱变作用外，还能诱发邻近位置基因的并 发突变，而且特别容易诱发DNA复制叉附近的基因突变，随着复制叉的移动，它的作 用位置也随着移动。 NTG是一种超诱变剂，它的诱发效率可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变，因 此经NTG处理的细菌不必经过青霉素浓缩处理，而只要通过适当的筛选方法就能检出 营养缺陷型。一般讲，一种高效率的诱变剂，只要有一种有效的筛选方法是可以获得 任何突变型的。 诱变处理所用的细胞一般为对数期细胞。化学诱变剂的剂量一般以药物浓度表示。一 定的剂量有一定的杀菌率和诱变率，通过杀菌率和诱变率可帮助我们了解一定剂量的 诱变作用。诱变作用往往与药物处理时间和温度有关。具有较强诱变作用，较弱杀菌 作用的诱变剂（如烷化剂）可采用较低剂量（约50％的杀菌率），反之，紫外线一般 采用较高杀菌作用的剂量（如90％—99.9％杀菌率）。
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（4）从温箱中取出培养皿，用接种环挑取确实只能在CM上生长而MM上不 生长的单菌落接种于CM斜面，30℃培养2天
后放冰箱保存，供生长谱鉴定用。
实验步骤
• 6.生长谱鉴定方法与微生物大肠杆菌诱变营 养缺陷型的鉴定方法相同，所以从略。
实验报告
1.绘制本实验的实验流程图，以保证实验的 思路清晰。 2.根据实验结果填写下列表格：见下页 3.总结酵母菌营养缺陷型菌株筛选实验的成 败经验。