同工酶电泳

利用同工酶电泳分析种（属）间亲缘关系

POD和EST（酯酶）

1.原理

1.1 同工酶（isozyme，isoenzyme）是指催化反应相同而结构及理化性质不同的一组酶，它们几乎存在于所有生物中。同工酶作为一类蛋白质，广泛存在于生物的同一种属，同一个体的不同组织，同一组织或同一细胞中。根据同工酶来源和结构的不同，从遗传学的角度可将它分为4类：①单基因决定的同工酶；②多基因决定的同工酶；③复等位基因决定的同工酶；④修饰同工酶或次生同工酶。在生物进化过程中，同工酶是为了适应细胞代谢的多方面需求而产生的，其功能在生理上表现为对代谢的调节作用。在遗传上，当一种酶同时受几个基因控制时，更容易适应环境的变化，一个基因由于突变而无用时，其它基因的存在仍然可以产生类似作用的同工酶，这有助于机体减小基因突变造成不利后果的影响广义。

1.2同工酶分析技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离，并将其位置和活性直接在染色区带以酶谱的形式标记出来的技术。同工酶是基因分子水平的表现型，基因的微小变化都会引起同工酶的变化。因此可以从同工酶谱的变化揭示种间的亲缘关系。同工酶分析技术已在植物系统学研究中广泛应用于研究植物间的亲缘关系，并获得了较为准确的结果。

2. 同工酶分析技术

2.1同工酶分离方法同工酶分离方法主要有电泳法、层析法、酶学法和免疫学法等，其中以电泳法应用最为广泛。其原理在于同工酶是功能相同但结构不同的一组酶，由于其结构中氨基酸序列或组成有差异，致使同工酶在电泳时，其迁移率也存在差异_7 J。2.2同工酶分离的常用电泳技术

2.2.1淀粉凝胶电泳法这是最古老的电泳方法之一，其优点在于便宜，无化学毒性物质，可以迅速筛分不同活性的酶，但其分辨率不高。

2.2.2聚丙烯酷胺凝胶电泳(PAGE)PAGE在分离蛋白质和核酸上应用广泛。实践中采用不连续电泳，即通过浓缩胶的收缩效其中聚丙烯酰胺凝胶电泳由于方法简单、分辨率较高、同工酶不易失活而使用最为普遍。应和分离效应，将同工酶分成一条条狭窄的区带2.2.3等电聚焦利用同工酶的等电点不同，在电泳支持物中加入两性电解质载体，因电场的作用，同工酶在PR梯度凝胶中泳动，当迁移至其等电点的PH处，则不再泳动，而浓缩成狭窄的区带。这种方法分辨率很高，但该法得到的同工酶常失活。

2.2.4双向电泳利用蛋白质或酶样品中不同组分等电点的差异，进行第一向分离；然后纵向切割以垂直于第一向的方向进行第二向电泳，从而使不同分子量的蛋白质或酶样品进一步分离。本法分辨率高于各种单向电泳，但同工酶易失活，特别是碱性同工酶的分析，应采用其它技术方法。

2.3同工酶位点及酶系统的选择

同工酶是基因表达的产物。通过适当的酶系统可以准确识别染色体上的基因位点，从而在最接近DNA的水平上来研究植物群体的变异。同工酶电泳方法克服了传统分析方法所固有的弱点，排除了环境的干扰，使不同的物种及不同的研究可在同水平上进行比较。由于分析的物种，所用的材料不同，分析及所利用的酶系统也存在差别。因此，初次研究某一树种时，筛选并确定适宜的等位酶系统及位点是非常重要的基础工作。

2．4同工酶的染色方法

染色技术即同工酶的染色方法有原染色法、荧光染色法、放射染色法、电子传递染色法和酶连锁染色法等，后三种较为常用，其中以电子传递染色法最常用。染色的原理是利用酶活性的特异性，在染色液中加入底物和酶活性所需的因子，通过酶促反应生成有色物，显示酶带，以便观察和记录结果。

2.5常用分析的同工酶

尽管可用来分析的同工酶有百余种，但过氧化物酶和脂酶是两种最常被用来分析的同工酶。过氧化物酶在植物组织中广泛分布，参与多种生理活动，并且为生长发育提供了基因表达的灵敏指标，是一种重要的遗传标记。脂酶则与植物体内各种酶类的水解息息相关。

2.6酶谱分析

根据迁移率R，值绘制同工酶酶谱及聚类分析；①计算酶谱的相似性系数：c=2w／( +b)，其中，n为种A酶谱的酶带数，b为种B酶谱的酶带数。W为A，B两种的相同酶带数，②计算不相似性系数值：d：z—f。③采用未加权配群法，即UPGMA法，进行聚类分析，根据结果绘出树系图。④计算x值：Xi=(L+Da—Db)／2L。把不相似值总计最大的种酶谱定为n，在x轴上标记为0，Xi为所求种酶沿轴对种A酶谱的距离；L为种A的n与B的b之间的不相似值，Da为种A的a与所求种酶之间的不相似值；Db为种B的b与所求种酶之间的不相似值。经过计算得到各酶谱在x坐标轴上的排序，通过在轴上距离的远近，可以来推测各分类群之间的亲缘关系。

3.材料与方法

3.1材料

3.2酶液提取

3.2.1 提取介质：50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS，pH 7.0）（100ml=39ml A储备液+61ml B储备液，其中A储备液：0.2mol/L KH2PO4；B储备液：0.2mol/L K2H PO4），含1 mmol/L EDTA，1％PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。

3.2.2 提取步骤：0.5 g叶片液氮研磨，待液氮挥发后，加入10 ml提取介质，研磨2 min，4℃，15000 g离心20 min，上清液直接测定酶活性和同工酶谱分析或液氮速冻后－20℃保存备用。

3.3电泳分析

3.3.1凝胶贮液及电极缓冲液的配制

以下各种试剂的配制方法：

30%Acr-Bis溶液：称取30 g Acr，0.8 g Bis用双蒸水定容至100 mL，充分溶解后，用滤纸过滤装入棕色瓶，并置于4℃冰箱中保存。

Tris-HCl pH 8.9缓冲液：称取Tris 36.6 g，加入1mol/L HCl 48 mL，用浓HCl调至pH 8.9

后，再用双蒸水定容至100 mL，用时加入TEMED0.4 mL，于4℃保存。

Tris-HCl pH 6.7缓冲液：称取Tris 6.0 g，加入1mol/L HCl 48 mL，用浓HCl调至pH 6.7后，再用双蒸水定容至100 mL，用时加入TEMED0.4 mL，于4℃保存。

电极缓冲液（Tris-Gly pH 8.3）：称取Tris 6.0 g，gly 28.8 g。用蒸馏水溶解并定容至1000 mL。用时稀释10倍。

10%过硫酸铵（W/V）：称取AP10 g，溶于100 mL双蒸水，用时现配。

溴酚蓝缓冲液：含0.25%溴酚蓝和40%的蔗糖。

醋酸联苯胺染液（母液）：2g 联苯胺溶于18 ml冰醋酸中，加72 ml ddH2O。用时取醋酸联苯胺溶液5 m1加30% H2O2 0.2 ml用94.8 ml ddH2O稀释

3.3.2 凝胶制备及电泳

电泳槽的安装：本实验使用DYY-Ⅲ型垂直板电泳槽，将配套的玻璃板与胶槽安装好，并用1%琼脂封口。

分离胶：分离胶（7％，10％）成分见下表，按顺序取以下各种成分，加入小烧杯中，混匀并缓缓倒入胶室，避免产生气泡，胶液加至距玻璃板顶部约3 cm处，然后将胶室垂直放置，并用胶头滴管在分离胶上表面缓缓加入0.5 cm左右的水层。10-20 min后，可以看到胶与水之间有一清晰的界面出现，此时分离胶已聚合，可以继续加入浓缩胶。

表 1 分离胶组成

Table 1 Composition of separation gel

浓缩胶：待分离胶凝聚后，用滤纸吸干水层，并配制浓缩胶。浓缩胶成分见下表，按以下顺序在小烧杯中加入各种成分，混匀后倒入胶室，避免产生气泡，并立即插入样品梳。约10min后，浓缩胶聚合。小心取下样品梳，并倒入电极缓冲液（负极缓冲液）。

表2 浓缩胶组成

Table 2 Composition of concentration gel