实验四 同工酶分析
同工酶测定
保护酶（SOD、POD、CAT、APX）同工酶分析酶液提取：称取1g样品鲜叶，在冰浴条件下加酶提取液（0.1 mol·L-1 Tris-HCl 缓冲液pH8.0（每100ml内含半胱氨酸0.073g、抗坏血酸0.105g、EDTANa20.075g、甘油10ml、1mol·L-1HCl 5.84ml）2ml，研磨至匀浆，然后在低温冷冻离心机中4℃、13000r·min-1离心20min，上清液极为酶提取液。
电泳（邹琦，2000）：采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行同工酶分析，分离胶浓度POD、CAT为7.5%，SOD、APX为10%，浓缩胶浓度为3%（配方如表1）。
电泳时采用稳流控制，SOD、POD、CAT电泳浓缩胶为15mA/板，分离胶20mA/板；APX电泳浓缩胶、分离胶均为30mA/板，电泳缓冲液中加入2mmol·L-1抗坏血酸，上样前预电10min。
电泳至溴酸蓝标志到达凝胶前沿为止。
酶谱染色：根据酶反应的专一性，采用不同的染色方法，进行同工酶酶谱分析。
SOD同工酶的染色方法：采用四氮唑蓝（NBT）法（胡能书，1985）染色。
电泳完毕后，取下胶片，用无离子水冲洗干净，然后依次浸入下述染色液中：（1）把电泳完毕后的胶片放在A液（2.45mmol·L-1 NBT溶液）中于黑暗下浸20min；（2）在B液（含有28μmol·L-1核黄素、2.8mmol·L-1四甲基乙二胺的36mmol·L-1 pH7.8 磷酸缓冲液）中于黑暗下浸15min；（3）在C液（含10mmol·L-1 EDTA的0.05mol·L-1 pH7.8 磷酸缓冲液）中浸泡并于40W日光灯下照光至出现清晰透明的SOD同工酶谱带。
染色后的胶片洗掉浮色后，可保存在7%的醋酸溶液中，供分析、照相、亦可制成干板永久保存。
表1聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板配置方法Table 1 Gel and dyeing solution compounds药剂分离胶10% 分离胶7.5% 浓缩胶3%30%Acr 9.75 ml 7.3 ml 1 ml1%Bis 7.50 ml 5.6 ml 1 ml 分离胶缓冲液 3.75 ml 3.75 ml浓缩胶缓冲液 2.5 ml 蒸馏水8.80 ml 13.15 ml 5.43 mlPOD 同工酶电泳染色：采用联苯胺溶液染色法（邹琦，2000）。
同工酶检测方法
同工酶检测方法
同工酶检测方法是一种用于确定酶活性和酶的存在性的常用实验技术。
同工酶是指具有相似化学结构但在酶活性和功能上有差异的酶。
通过检测同工酶的存在和活性，我们可以了解酶的功能差异和其在生物体内的重要作用。
同工酶检测方法主要包括以下几种：
1. 凝胶电泳法：这是最常用的同工酶检测方法之一。
通过将样品中的酶进行凝胶电泳分离，然后在凝胶上加入适当的底物和染色剂，可以观察到酶的活性带和相应的颜色变化。
根据活性带的位置和颜色变化，可以确定酶的存在和活性差异。
2. 免疫学方法：同工酶也可以通过免疫学方法进行检测。
这种方法利用特异性抗体与酶结合，形成免疫复合物，然后通过染色或荧光标记的抗体检测酶的存在和活性。
这种方法具有高灵敏度和高特异性，适用于复杂样品的检测。
3. 分子生物学方法：随着分子生物学技术的发展，同工酶的检测也可以通过PCR、测序和基因表达等方法进行。
这些方法可以直接检测目标酶基因的序列差异或转录水平的变化，从而确定不同同工酶的存在和表达差异。
除了以上常用的方法外，还有一些新兴的技术被应用于同工酶的检测，例如质谱分析、表面等离子共振和生物传感器等。
这些方法具有高灵敏度和高通量的特点，可以快速、准确地检测同工酶的存在和活性。
总之，同工酶检测方法在生物学研究和临床诊断中起着重要的作用。
不同的方法可以根据研究目的和样品类型选择使用，从而更好地了解同工酶的功能和生物学意义。
实验四 同工酶分析
+
+ ○
○
+ ○
2
【实验原理】—聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺 （Bis）在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和 催化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网状结 构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝 胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)
5
【实验原理】—聚丙烯酰胺凝胶电泳
6
【实验原理】—过氧化物同工酶分析
1.同工酶 凡能催化同一种化学反应，但其分子结 构和带电性质不同的一组酶称同工酶。
植物组织中的同工酶是基因表达的产物。 在研究植物基因调控与生长发育、与环境条 件的关系，以及许多生理生化和遗传问题时， 常常需要分析同工酶谱的差异。
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【实验方法与步骤】
2.样品制备
称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研成匀浆，转入 离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟， 取上清液，加入等量的上样缓冲液，混匀，即为 样品液。
11
【实验方法与步骤】
3.上样
30-50μL
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【实验方法与步骤】
实验四 过氧化物同工酶分析
【实验目的】
掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术的原理和
操作方法。 掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理和方法。
1
【实验原理】—聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.电泳概念 带电粒子在电场中向与其电性相反的 电极移动的现象。如：琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等。
同工酶分析
同工酶分析实验组：周四上午5组小组成员：张福超、热孜往古力、黄珍稀、叶金杰实验时间：2011年11月一、实验目的1．掌握同工酶分析的方法技术。
2．理解同工酶分析的遗传学意义。
二、实验原理同工酶（isozymes ）是指催化反应相同，但结构和理化性质不同的一族酶。
是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。
结合利用电泳技术（根据分子量、电荷），将不同的蛋白质区分开来，利用专一底物和特殊染料染色进行分析即可检验某一反应同工酶的种类、大小、含量及活性等。
本实验中共涉及酯酶（Est ）和乳酸脱氢酶(LDH)两种体系同工酶，其中Est 是催化酯类化合物水解的酶系是；LDH 是催化乳酸脱氢反应的酶。
两种同工酶产物的染色原理如下：1. Est ：酯的水解产物与偶氮化合物（如坚牢蓝RR 盐）结合产生红褐色物质。
2. LDH ：三、实验材料黒腹果蝇（亲本、子代）、大果蝇、金鱼、小鼠四、实验内容1．凝胶制备 2．提取酶液 3．活性电泳 4．染色分析五、实验方法和步骤1.配制分离胶（7.5%）：乳酸 丙酮酸LDHNAD+NADHNBT(黄)NBTH(蓝紫)双蒸水/mL 4.5 mL1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）/mL2.5 mLAcr/Bis（30%）/mL （有毒！） 2.5 mLTEMED/μL 10 μL10%Aps/μL 50 μL总体积/mL 10 mL注入两玻璃夹缝中（加到离短玻璃上缘2cm），胶面上加1cm蒸馏水（自然凝胶后倾出、除干净）。
2.提取酶液每份材料加入200ul匀浆缓冲液匀浆，匀好后倒入2ml离心管中，4℃，10000rpm，10分钟，上清移入另一离心管中保存。
3．4%浓缩胶的配制：双蒸水/mL 3.1 mL0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）/mL 1.25 mLAcr/Bis（30%）/mL 1.5 mLTEMED/μL 10 μL10%Aps/μL 25 μL总体积/mL 5 mL加入两玻璃夹缝中，并在两玻璃板夹缝中水平插入梳子，待凝胶后小心拔出梳子（在缓冲液中拔梳子）。
(整理)检验医学专业实验IV临床生物化学检验部分
自动生化分析仪实际K值测定实际K值：理论K值受样品和试剂的加量准确度、比色杯光径准确度，尤其是ε的影响。
ε在波长和温度等不同时有所不同，故有必要获得用户所用分析仪的实际ε，再计算K值，此为~。
一、340nm波长实际K值测定【实验原理】：通过有NAD+（NADP+）参与的反应途径，用NADH或NADPH标准液来校正仪器。
用己糖激酶（HK）方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。
葡萄糖有标准纯品，当反应达到终点时，NADH的摩尔数等于标准的葡萄糖摩尔数。
在需要校正的仪器上测其A即可求得实际摩尔吸光系数，计算出实际K值。
【注意事项】1．减少偶然误差重复测定10次，当CV>5％时，则重新测定10次。
2．减少系统误差使用实际K值计算酶活性。
3．如果实际ε值与理论ε值偏差过大，需对仪器检修和校正。
二、405nm波长实际K值测定【实验原理】：许多酶活性测定时，以人工“色素原”为底物，经酶作用后可释放出在405nm 波长具有吸收峰有色的反应产物，如对硝基苯酚(4-NP)、对硝基苯胺(4-NA)、对硝基-5-氨基苯甲酸(ANBA)。
他们在405nm波长时的理论ε分别为18 700、9 870、9 490。
可使用其相应的纯标准品在需要校正的仪器上测其A即可求得实际ε，计算出实际K值。
以ALP实验(产物为4-NP) 为例测定实际K值。
【注意事项】1．4-NP标准品纯度要求较高，必要时需纯化。
2．其他注意事项参见340nm K值校正。
三、如何校正K值在理论K值或实际K值得情况下，测定某标准品的含量，若测得的结果偏低，则需要把测得的结果调整至原标准品的含量，此时调整的数值称为校正因子，则校正K值=理论（实际）K值×校正因子=理论（实际）K值×校准值÷实测值NADH正负向反应测定酶活性一、血清乳酸脱氢酶测定LD催化反应式为：L-乳酸+ NAD+（LD）→丙酮酸+ NADH + H+在反应过程中，乳酸被氧化生成丙酮酸，同时NAD+还原为NADH。
同工酶检测原理
同工酶检测是一种常用的生物学实验技术，用于检测特定分子的存在和浓度。
其原理基于同工酶的特异性反应。
同工酶是指在酶的催化作用下，对于同一底物具有相同的催化活性，但其结构或电荷可能有所不同的酶。
同工酶的存在是由于基因突变或多态性引起的。
同工酶检测的步骤如下：
1. 提取样品中的酶：首先，从待检测的样品中提取出目标酶。
2. 准备底物：选择适当的底物，该底物在酶的催化下会发生特定的反应。
3. 反应：将提取的酶与底物一起反应，使其发生催化作用。
4. 分离产物：通过某种方法（如电泳）将反应产物分离开来。
5. 可视化：使用某种染色剂或显色剂，将分离的产物可视化。
6. 分析结果：根据产物的分离情况和可视化结果，判断样品中是否存在目标酶，并确定其浓度。
同工酶检测的原理是基于同工酶的特异性反应。
由于同工酶的结构或电荷可能有所不同，因此它们对于特定底物的催化活性也可能有所不同。
通过检测底物的反应产物，可以确定样品中是否存在目标酶，并且可以根据产物的浓度来估计目标酶的浓度。
同工酶实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解同工酶的概念及其在生物体中的生物学意义；2. 掌握同工酶电泳技术的基本原理和方法；3. 通过同工酶电泳实验，观察和分析同工酶在样品中的分布情况。
二、实验原理同工酶是指具有相同催化功能，但氨基酸序列和分子结构不同的酶。
同工酶电泳技术是一种分离和鉴定同工酶的方法，其原理是利用同工酶在电场中的迁移速率差异，将其分离。
三、实验材料1. 实验样品：植物叶片、动物组织等；2. 电泳试剂：琼脂糖、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等；3. 电泳仪器：电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统等；4. 其他：移液器、吸管、剪刀、镊子等。
四、实验方法1. 样品制备：将实验样品研磨，加入适量提取液（如Tris-HCl缓冲液），在冰浴中匀浆，离心取上清液；2. 电泳凝胶制备：按照电泳试剂的配方，制备琼脂糖凝胶；3. 电泳样品制备：将提取液加入适量的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，混合均匀后，加入适量的样品，制成样品胶；4. 电泳：将制备好的样品胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，进行电泳；5. 成像与分析：电泳结束后，取出凝胶，用凝胶成像系统拍照，分析同工酶的分布情况。
五、实验结果1. 通过电泳实验，观察到样品中存在多种同工酶；2. 不同样品的同工酶分布情况存在差异，说明同工酶在生物体中具有特异性；3. 同工酶的迁移速率与酶的分子量有关，分子量较小的酶迁移速率较快。
六、实验结论1. 同工酶在生物体中具有重要作用，其生物学意义包括催化、调控、信号传递等；2. 同工酶电泳技术是一种有效的分离和鉴定同工酶的方法；3. 本实验成功分离和鉴定了样品中的同工酶，为后续研究提供了基础。
七、实验讨论1. 实验过程中，样品制备和电泳操作应注意无菌操作，以避免污染；2. 电泳条件的选择对同工酶的分离效果有较大影响，应根据实验目的和样品特点进行优化；3. 同工酶的研究有助于揭示生物体的遗传、变异和进化规律。
八、实验总结本实验通过同工酶电泳技术，成功分离和鉴定了样品中的同工酶，验证了同工酶在生物体中的生物学意义。
同工酶测定技术
同工酶测定技术一、电泳测定技术在研究同工酶的方法中，电泳法的使用最广泛。
大致分为显微电泳、自由界面电泳和区带电泳3大类。
以区带电泳最为常用，因其简便、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态。
区带电泳法分离的原理与其他蛋白电泳相似。
可选支持物虽多，但目前多用醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。
自动化电泳分析系统多采用分辨率较高的琼脂糖凝胶作为支持介质，采用高压或常压电泳。
电泳后同工酶各组分的检测常用以下方法。
（一）活性显色电泳分离得到的同工酶区带用酶反应染色法进行显色，不能直接显色者可加入工具酶经偶联反应显色。
由于活性显色需依赖其催化活性，因此，电泳后不能进行固定，并且呈色产物要求非水溶性。
常用活性显色系统有：1.重氮试剂染料人工合成的萘酚或萘胺衍生物在酶促反应后产生的萘酚或萘胺，与偶氮染料如固蓝B等生成难溶于水的有色重氮化合物。
如ALP、GGT 同工酶的测定。
2.电子传递染料氧化还原酶类催化反应产生的H+经PMS传递给四唑盐染料，生成不溶性紫红色的甲臜化合物或蓝色的双甲臜。
这类染料适用于氧化还原酶类同工酶检测，如LD同工酶的测定。
3.脱氢酶偶联的指示反应检测波长340nm处NAD （P）H吸光度变化推算同工酶各组分活性，如AST、CK等同工酶测定。
（二）光密度计扫描这是最常用的同工酶质量相对定量方法。
电泳分离同工酶后，经染色、洗脱、固定（滤纸、醋酸纤维素薄膜尚需透明）制成同工酶谱，再用光密度计扫描作相对定量测定。
若显示的区带数与同工酶数不一致时，要考虑巨分子酶的存在。
（三）洗脱法将染色后的各同工酶区带从支持物上切下溶于洗脱剂中，测定各自的吸光度。
以总吸光度为100%，求出各区带百分含量。
若已知总活性，则可求得各同工酶组分活性的绝对值。
二、免疫化学测定技术由于同工酶一级结构不同，因而抗原性也不同，可用特异免疫反应识别。
免疫化学法生物学特异性、灵敏度较高，即使低浓度的酶也能测定，操作简单。
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四、实验步骤
• 装槽、上样：
30μL左右
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四、实验步骤
• 电泳：
接好电源线（上槽接负极，下槽接正极）。 打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳定电压 电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行至距胶板末 端1-2 cm处，即可停止电泳。
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四、实验步骤
• 剥胶、染色：
电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下， 小心地将两块玻璃板分开，并小心地将凝胶置 于染色盒中，进行染色反应，染色时间为 10min左右，用水漂洗1-2次即可。
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四、实验步骤
• 凝胶制备：
聚丙烯酰胺凝胶配方
成分
含量
N液（29.2%Acr-0.8%Bis） 5mL
L液（Tris）
5mL
蒸馏水
10mL
TEMED
20μL
10% AP
100μL
作用
交联剂 缓冲液
加速剂
催化剂
4℃储存，用量可 适量调整
现用现配，用量 可适量调整
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四、实验步骤
• 样品制备：
称 取 0.5g 植 物 幼 苗 ， 放 入 研 钵 内 ， 加 入 1mL样品提取液（pH8.0），于冰浴中研成匀 浆，全部转入1.5mL离心管中，10000r/min离 心 10min ， 吸 取 100μL 上 清 液 至 新 离 心 管 中 ， 加入等量的上样缓冲液，混匀，即为样品液。
—
○+ ○-
+
○-
○+
二、实验原理
2、电泳分类：
✓ 显微电泳 ✓ 自由界面电泳 ✓ 区带电泳
– 纸电泳 – 醋酸薄膜电泳 – 琼脂糖凝胶电泳 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
二、实验原理
3、电泳法原理：在一定条件下，任何带点颗粒都 有自己特定的电泳迁移率。影响电泳迁移率的因 素：
✓ 颗粒性质：净电荷数目、颗粒大小、颗粒形状 ✓ 电场强度：V/cm ✓ 溶液性质：缓冲液的pH、离子强度、溶液黏度、
电渗
二、实验原理
4、聚丙烯酰胺凝胶电泳：是由单体丙烯酰胺 （Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催 化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网 状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚 丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)
（2）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种 酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定 这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植 物体内代谢的变化。
二、实验原理
➢ 过氧化物同工酶及活性染色
（3）本实验采用PAGE技术，分离植物幼苗过氧化物酶 同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的 不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
➢ 浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、电位梯 度均不连续），从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带 ，即所谓浓缩效应，提高了条带分辩率。（只有不连续 凝胶具有此效应）
10
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二、实验原理
➢ 过氧化物同工酶及活性染色
（1）同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身 的分子结构及其理化性质不同的一组酶。同功酶是机体调节 酶活性的一种方式，在各种生物体中广泛存在。
实验四 过氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝胶 电泳（PAGE）分析
1
一、实验目的
（1）掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术的 原理和操作方法。
（2）掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理和 方法。
2
二、实验原理
➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） ➢ 过氧化物同工酶及活性染色
二、实验原理
1、电泳概念：带电粒子在电场中向与其电性相反 的电极移动的现象。
反应过程：
➢ TEMED催化AP生成硫酸自由基
S2O82－
2SO4·¯
➢ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体 长链：
8
➢ Bis将单体长链间连成网状结构：
9
PAGE法分离蛋白质的三种效应：
➢ 电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在同一电场 中泳动率不同；
➢ 分子筛效应：蛋白质分子大小和形状各不相同，在通过 一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各不相同，泳动率 也不相同；
19
五、实验结果与分析
1 2
ห้องสมุดไป่ตู้
需要说明：
1、同工酶的数量。
3
2、同工酶的分子量大小。
4
3、同工酶的含量大小。
20
六、思考题
1、简述过氧化物同工酶丙烯酰胺电泳的原理。 2、请说明本实验过程中的注意事项。 3、简述丙烯酰胺电泳的操作要点。 4、上样缓冲液中蔗糖和溴酚蓝的作用是什么？
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双氧水
过氧化物+过氧化物酶 → 复合物
复合物+DH2 → 过氧化物酶+H2O+D
联苯胺
棕色物质
三、仪器和试剂
1、仪器： 高速离心机、垂直电泳槽、电泳仪。
2、试剂： 样品提取液、上样缓冲液（0.5%溴酚蓝+40%蔗
糖）、凝胶贮液N液、分离胶缓冲液L液、10%过硫酸 铵、TEMED、1×电极缓冲液、同工酶显色液。