细胞同工酶分析进行细胞鉴定
细胞工程思考题
２）ES细胞的分化抑制培养
在ES细胞的培养过程中，一方面要给以足够的营养物质以满足其增殖的需要，另一方面要抑制其分化，其中前者由基础培养基来解决，后者则由分化抑制物来完成。
分化抑制物的选择目前有三种分化抑制物比较常用：
饲养层（feeder layer）：常用的有STO（一种已成系的小鼠成纤维细胞）、小鼠原始胚胎成纤维细胞（PMEF)
Mammary gland bioreactor:乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在乳腺中的表达，并从转基因动物的乳汁中获取重组蛋白。
正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS)
同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。
2.简介转基因动物技术的应用
1)动物品种改良；
2)生物制药(乳腺生物反应器)；
3)建立人类疾病的动物模型；
4)生产可移植用的动物器官；
5)基因治疗(动物模型)；
6)基因打靶。
3.简介转基因哺乳动物的制备方法
显微注射法
逆转录病毒载体感染
精子载体介导法
胚胎干细胞介导法
细胞核移植技术
YAC介导的基因转移
4.请阐述胚胎干细胞途径的基因打靶的基本原理及实验流程
细胞生物学题库 大学生物学 练习题及答案
毒害细胞（5）浸泡器材的蒸溜水容器要专用，并做好标记。
（6）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。
18.对器皿进行有效清洗需注意事项是什么？[10分]参考答案：对器皿进行有效清洗需注意事项是：（1）用后应立即浸泡（2）挑选合适的去污剂（3）流水冲洗干净后，再用去离子水和重蒸馏水漂洗；（4）洗后应及时凉干或烘干；（5）包装后，放置干净处，待消毒19.简述使用甲醛消毒时应注意事项及甲醛气体产生的方法。
[10分]参考答案：甲醛气体产生的方法：（1）多聚甲醛加热法：将多聚甲醛研成粉末，铺在金属板上，加热至150℃以上即产生甲醛气体。
（2）甲醛水溶液蒸发法：将40%甲醛水溶液（福尔马林）倒入蒸发皿中，加热蒸发。
（3）氧化法：先将高锰酸钾放入一较大容器中，再倒入福尔马林。
使用甲醛消毒时应注意事项及注意：（1）熏蒸前应充分暴露物体表面;（2）熏蒸时室内温度应在18℃以上，相对湿度为70%。
20.双蒸器使用应注意哪些事项？[10分]参考答案：双蒸器使用应注意事项是：（1）使用时先开启冷却水水源。
（2）要调节去离子水或蒸馏水流速，使之进入一次横式烧瓶的速度基本上与二次蒸馏水流出速度相等（3）停用时应先关闭去离子水，再关闭电源，最后关闭冷却水21.电热干燥箱使用时应注意哪些事项？[10分]参考答案：电热干燥箱使用时应注意事项是：（1）鼓风与升温应同时开始（2）温度降至100℃以下时，再打开箱门。
（3）最底层不能放置物品22.培养基的基本要求是什么？[10分]参考答案：培养基的基本要求是：（1）营养成分：氨基酸，单糖，维生素，无机离子与微量元素。
（2）促生长因子及激素（3）渗透压（4）pH（5）无毒无污染23.在细胞培养液中加入血清的作用是什么？[10分]参考答案：在细胞培养液中加入血清的作用是：（1）提供基本的营养物质（2）提供贴壁和扩展因子（3）提供激素及各种生长因子（4）提供结合蛋白（5）对培养细胞提供某些保护作用24.使用血清的缺点是什么？[10分]参考答案：使用血清的缺点是：n（1）可能改变细胞在体内的正常状态（2）有些物质对细胞产生毒性作用（3）每批血清之间都有差别（4）取材过程有可能带入支原体、病毒。
临床研究用人间充质干细胞质量检验规范-讨论版
临床研究用人间充质干细胞质量评价规范（讨论稿）前言人间充质干细胞(human MSCs, hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等等组织。
除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生。
hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症，并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。
过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示，不同组织来源的hMSCs均具有不同程度，针对不同临床适应症的治疗效果。
目前在登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种，其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮，等等。
然而，无论是临床前或临床研究阶段，现有的研究结果仍都存在不同程度的问题，而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。
其中临床前研究所表现的问题是，不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异，也存在质量评价内容和技术的合理性等问题，因此导致不同研究者间的研究结果很难具有可比性，或结果难以重复，因此也很难形成相对统一的质量标准。
而临床研究中所存在的问题是，绝大多数临床研究还处在早期阶段，所观察的病例数还很有限，临床研究中细胞质量的标准化和细胞使用的规范性仍存在巨大差异，所有这些尚不足以完全支持hMSCs的安全性和/或疗效。
除此以外，因hMSCs临床前研究还远不够完善，对其临床研究的指导作用还不强，或者临床前研究与临床研究存在严重脱节现象，临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺，细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立，等等。
【生物技术】第六讲(2)植物体细胞杂交技术
3.2 突变互补选择
3.2.1 隐性突变互补选择 3.2.2 显性抗性互补选择 3.2.3 隐性突变与野生型互补选择 3.2.4 显-隐性双突变体选择
植物体细胞杂交技术
周口师范学院生命科学系
植物体细胞杂交的意义
有性杂交是植物遗传改良的一种传统手段. 作用空间:主要限于种内的品种之间. 种及种以上分类单位之间的杂交,例如 种间或属间杂交,则常常遭遇有性不亲和性 障碍.
在无性繁殖植物和性不育植物中,如在 马铃薯,甘薯,木薯,甘蔗和香蕉中,更是 难以通过有性杂交进行遗传改良. 因此,建立在原生质体全能性基础上的 体细胞杂交和胞质杂交技术,对于植物的遗 传改良具有重要的意义.
5 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定
5.2 细胞学和分子细胞学鉴定 通过确定杂种染色体数和染色体形态
5 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定
5.3 生化鉴定 同工酶谱分析法: 将体细胞杂种的同工酶谱与其双亲的酶谱 比较: 杂种植株的酶谱可能是双亲酶谱带的总和 可能只出现双亲的部分酶带 或缺少双亲的某些酶谱而出现新的谱带.
在双亲亲缘关系比较远的杂种细胞中,两 个来源不同的染色体组常常不能完全结合在 一起. 在动物体细胞杂种细胞系中,已知双亲之 一的染色体会逐渐消除,在植物中也看到这 种现象.
3 杂种细胞的选择系统
3.1 根据物理特性选择 3.2 突变互补选择 3.3 根据生长和再生能力的差别选择
3.1 根据物理特性选择
3.3 根据生长和再生能力的差别选择
Q5d 细胞基质的质量要求
1．1 目的
本指导原则的目的是对用于生产生物技术产品及生物制品的人和动物细胞系和微生物 细胞系以及为用于生产的细胞库的制备和鉴定建立标准提供指导。该文件还提供了在这些领 域里申请产品上市应上报哪些资料的建议。
1．2 基本原理
在历史上，由于细胞源性的生物制品存在外来的污染物或出于对用于制备产品的细胞性 质方面的考虑，引发了一些对产品质量的关切。重组 DNA(rDNA)制品的质量也与细胞基质 中构建的表达载体有关：由此，人们达成共识，认为细胞基质的特性以及与之相联系的事件 将影响产品的质量和安全性，为有效地控制产品质量，需对操作细胞基质的各方面进行严格 控制。
容，进行以下所列的有关试验，并在申请制品上市时将试验内容和试验结果一并上报。 对于含有外源构建的表达载体的细胞系，应参照 ICH 指导原则中有关心 rDNA 表达载
体方面的内容，作为核首酸和氨基酸序列鉴定方面的指南。也可用类似的方法对基因序列明 确并已鉴定的某些非重组 DNA 来源的细胞系的编码序列进行分析。但是，没有必要对那些 编码复杂的天然产品的序列进行分析，如相关的基因家庭的产品、微生物疫苗抗原或来自于 杂交瘤的单克隆抗体。
对于人细胞系，应相应描述原供体的下述特征：组织或器官的起源、人种和地理位置、 年龄、性别和一般的生理状况。如有材料，应将供体致病因子的检查结果与健康状况或病史 一并报告。特别是人二倍体成纤维细胞，由于供体的年龄可能影响细胞系的体外寿命，应尽 可能提供。至于动物细胞系的来源，应提供物种、品系、饲养条件、组织或器官的起源、地
通常，MCB 直接从最初的克隆或源于最初克隆的初级细胞库中制得。对某些类型的细 胞，不必从克隆制备细胞库(如二倍体细胞，它们的体外寿命有限或其他的技术因素使细胞 克隆不切合实际；或末被克隆的细胞群体，对某种用途来讲已足够均质)。
细胞系的建立及鉴定
细胞系：
有限细胞系，人的正常组织多数可以建立有 限细胞系。如间充质来源的成纤维细胞，牙 髓细胞、牙髓干细胞、牙周膜细胞等
无限细胞系，永生化细胞系，肿瘤细胞系
细胞系/细胞的鉴定
细胞系的建立：
1.组织块方法
2.单层细胞法
原代培养
传代培养
大量扩增细胞后用于实验研究
使用前对细胞的组织特异性进行鉴定
形态学：多核细胞
牙髓干细胞：需多少个指标证实
干细胞表面标志：CD44,STROL 1,MUC18 ,alpha-SM actin
多潜能功能鉴定： 成骨细胞功能： 细胞碱性磷酸酶（ALP）活性检测：采用 Gomarri 法测定细胞内碱性磷酸酶的活性。
细胞体外矿化能力的检测：细胞经矿化诱导
剂处理后，用von Kossa染色法观察细胞在体外 形成矿化物沉积的能力。
除一般生物学性状外
1. 不死性，代次， 2. 细胞特性的改变： 3. 转染基因的鉴定：PCR, Southern blot ,
证实HPV-16/18 DNA 4. 成瘤性实验：免疫缺陷动物皮下细胞移
细胞悬液的制备
要求：5个浓度的细胞悬液分别是： 10000个；8000个；6000个；4000 个；2000个/100ul/孔 每个浓度3个复孔
丧失生长抑制性
当培养细胞所需任何一种关键性营养物质或生长因子 降到阈值以下时,正常细胞的生长即受到抑制,如异 亮氨酸,磷酸盐,上皮生长因子等。
转化的细胞对一些生长因子需求降低,或失去了对激素 和生长因子的需求，在营养不足的情况下可继续生 长,它们甚至可以杀死一些自身的细胞,以便在不可 能生存的环境下继续生长。或者由于某些转化产生 了生长因子类似物,为自身提供了生长因子。
体细胞杂交
杂种细胞
体细胞杂交(二)新产生的融合细胞称为杂种细胞（hybridcell)，含有双亲不同的染色体。杂种细胞有一个 重要的特点是在其繁殖传代过程中出现保留啮齿类一方染色体而人类染色体则逐渐丢失，最后只剩一条或几条， 其原因至今不明。这种仅保留少数甚至一条人染色体的杂种细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料。 由于人和鼠类细胞都有各自不同的生化和免疫学特征，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂 种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。但凡含有人第17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡。从 而推断TK基因定位于第17号染色体上。这是首例用细胞杂交法进行的基因定位。由此可见，研究基因定位时，由 于有杂种细胞这一工具，只需要集中精力于某一条染色体上，就可找到某一基因座位。
辐射性杂交
1
概念
2
原理3Βιβλιοθήκη 试验流程4特点
5
应用
体细胞杂交(三)辐射性杂交(radiationhybridRH)制图技术是1975年由Goss和Harris创立的一种体细胞杂 交技术，适用于构建人类基因组长范围内的高分辨率连续物理图谱。成熟的辐射性杂交制图技术是由CoxVR等人 于1990年建立的。
Hi5-SF悬浮细胞系的建立及鉴定
Hi5-SF悬浮细胞系的建立及鉴定马伟;王家敏;马桂兰;马祺;马花;乔自林;马忠仁;冯玉萍【摘要】从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)引进High Five细胞并对其进行驯化,获得无血清悬浮驯化株(Hi5-SF).依据《中华人民共和国药典(2010年版三部)》对其进行细胞生物学特性研究、微生物污染、病毒外源因子及细胞致瘤性检测.结果发现,Hi5-SF细胞复苏活力76.3％,生长曲线呈“S”型,最大增殖密度可达3.50×106 mL-1,群体倍增时间为26.2 h;细菌、真菌及支原体检查均为阴性;血细胞吸附试验、致细胞病变试验和特异性病毒荧光抗体结合物检查结果均为阴性;致瘤性检查结果也为阴性.说明该细胞株符合兽用疫苗生产用细胞质量要求,可以在疫苗研究与生产中应用.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2017(026)002【总页数】6页(P173-178)【关键词】High five细胞;悬浮培养;质量评价【作者】马伟;王家敏;马桂兰;马祺;马花;乔自林;马忠仁;冯玉萍【作者单位】西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心,兰州 730030;西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心,兰州 730030;兰州百灵生物技术有限公司,兰州 730010;兰州百灵生物技术有限公司,兰州 730010;西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心,兰州 730030;西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心,兰州 730030;西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室,兰州730030;西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室,兰州 730030【正文语种】中文【中图分类】S85粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵巢细胞株BTI-TN-5B1-4是20世纪90年代Robert R和李国勋等从粉纹夜蛾卵巢细胞系BTI-TN-5B1克隆得到的新型宿主细胞，Invitrogen公司注册商标为High Five细胞[1-2]。