细胞穿膜肽;结构特点;内化机制
细胞生物学 第四章 细胞膜与物质的穿膜运输
第四章细胞膜与物质的穿膜运输细胞膜：是包围在细胞质表面的一层薄膜，又称质膜。
内膜系统：除质膜外，细胞内还有丰富的膜结构，它们形成了细胞内各种膜性细胞器，如内质网、高尔基复合体、溶酶体、各种膜泡等，称为细胞的内膜系统。
生物膜：质膜和细胞内膜系统的总称。
单位膜：生物膜因在电子显微镜下呈“两暗夹一明”的形态结构，又称为生物膜。
脂质体：脂质分子在水环境中排列呈双层，两层分子的疏水尾部被亲水头部夹在中间，为了避免双分子层两端疏水尾部与水接触，其游离端往往能自动闭合形成充满液体的球状小泡。
孔蛋白：有些穿膜蛋白以β-折叠片层构象穿膜，在脂双层中围成筒状结构，称β筒，有些β筒在质膜上起运输蛋白的作用，称为孔蛋白，主要存在于线粒体、叶绿体和一些细菌的外膜。
膜内在蛋白（穿膜蛋白、整合蛋白）：占膜蛋白总量70-80%，两亲性分子，分为单次穿膜、多次穿膜和多亚基穿膜蛋白三种类型。
膜外在蛋白（周边蛋白）：占膜蛋白总量20-30%，是一类与细胞膜结合比较松散的不插入脂双层的蛋白质，分布在质膜的胞质侧或胞外侧。
如红细胞的血影蛋白和锚蛋白。
脂锚定蛋白（脂连接蛋白）：可位于膜两侧，以共价键与脂双层内的脂分子结合。
糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（GPI）：位于质膜外的表面的一些蛋白质，通过与脂双层外层中磷脂酰肌醇分子相连的寡糖链共价键结合而锚定到质膜上，这些蛋白称为GPI细胞外被（糖萼）：大多数真核细胞表面富含糖类的周缘区，现一般用来指与质膜相连接的糖类物质，即质膜中糖蛋白和糖脂向外表面延伸出的寡糖链部分，所以细胞外被实质上是质膜结构的一部分，基本功能是保护细胞抵御各种物理、化学性损伤。
（不与质膜相连的细胞外覆盖物称为细胞外物质或胞外结构）膜的不对称性：细胞膜中各种成分如膜脂，膜蛋白，膜糖，分布是不均匀的，包括种类和数量上都有很大差异。
（如红细胞外层鞘磷脂SM最多，内层磷脂酰乙醇胺PE即脑磷脂最多）脂双层的液晶态：脂双层作为生物膜的主体，它的组分既有固体分子排列的有序性，又有液体的流动性，这一两种特性兼有的居于晶态和液态之间的状态即液晶态。
细胞穿膜肽的治疗应用
细胞穿膜肽的治疗应用刘金华【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2011(017)001【摘要】Cell-penetrating peptides(CPPs)are some small peptide molecules with cell membrane penetrating capability, which can bring protein, polypeptides, nucleic acid into cells without any significant side effects on host cells.Although the mechanisms of membrane penetration is not clear and even controversial, CPPs are still widely used in life science research fields,including basic and clinical researches.CPPs have shown their roles in tumor,cardiomyopathy and immunotherapy studies, with a wide range of applications.%细胞穿膜肽(CPPs)是具有细胞膜穿透能力的小分子多肽,能将蛋白质、多肽、核酸片段等以多种方式导入哺乳动物细胞内,其转导效率高且不会造成细胞损伤.CPPs的具体穿膜机制尚不清楚,甚至互相矛盾,但并不影响其在生命科学研究领域,包括基础研究和临床研究中的应用.CPPs已经在肿瘤、心肌病、免疫治疗等临床领域展现出很大的研究价值,并且已经取得了不少新的进展,具有广泛的应用前景.【总页数】3页(P10-12)【作者】刘金华【作者单位】广西医科大学基础医学院免疫学教研室,南宁,530021【正文语种】中文【中图分类】R341【相关文献】1.基于小热休克蛋白-细胞穿膜肽蛋白纳米粒的siRNA递送系统 [J], 王浩;刘宁;陈丽;崔梅英;王冬梅;刘宇轩;关新刚2.细胞穿膜肽与人表皮生长因子在大肠杆菌中的重组融合表达 [J], 李风;柯博文;孙中伟;韩双艳3.细胞穿膜肽S4(13)与质膜相互作用的分子动力学模拟 [J], 高金爱;崔巍4.细胞穿膜肽的分类和穿膜机制研究进展 [J], 王红梅;王春玲;邹艳;杨海莲5.细胞穿膜肽作为载体的研究进展 [J], 闫可心;闫宗斌;韩金成;张雪梅;薛书江;许应天因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞穿膜肽的研究进展与前景展望
用过 于 复 杂 和 难 于控 制 ， 在 靶 细 胞摄 取 效 率低 及 体 内吸 收 、 布 、 存 分 生物 利 用 度 和毒 性 等 方 面 问题 ， 给其 进 一 步研 究和 应
用 带 来挑 战 。 【 键 词 】 穿膜 肽 ；药 物 运 输 ；治 疗 应 用 关
【 图分 类 号】 Ｒ ３ ９ ２ 中 ２． 【 文献 标 识码 】 Ａ 【 章编 号】 【 ）：Ｏ ３ ６ ／．ｓｎ １ ７ — ５ １ ２ １ ． ７ ０ ９ 文 ） Ｉ１ ． ９ ９ ｊｉ ． ６ ２３ ｌ ． ０ ２ ０ ． ７ （ ｓ
其它 病 变 组 织 的 血 管 外 识 可
别 间 质肿 瘤 ， 显著 提 高肿 瘤 治 疗 效 果 ］ 。
１２ 线 粒体 穿 透 肽 目前 对 Ｃ Ｐ ． Ｐ ｓ的研 究 主 要 集 中 于 如 何 跨
越 细胞 膜 而 不 是 细 胞 器 膜 ， 对 其 特 异 性 靶 向 亚 细 胞 器 的 研 究 而 并 不 多 ， 生 物 大 分子 能 在 细 胞 的 特 定 超 微 结 构 发 挥 作 用 ， 若 将 有助于 Ｃ Ｐ Ｐ ｓ靶 向 胞 内 细 胞 器 在 生 物 医 学 领 域 中 的 应 用 。
应 用 。在 穿膜 肽 研 究 的基 础 上 ， 们 发 现 了 包括 肿 瘤 归 巢肽 ， 粒 体 穿 透 肽 ， 活 化 细 胞 穿膜 肽 ． 合 肽 ， 微 生 物 肽 等 人 线 可 嵌 抗
具 有 高 效 穿 膜 活性 多肽 片段 ， 作 用 更加 广 泛 ， 其 他们 给 药 物 载 体研 究 带 来 了机 遇 。 然 而 ， 于 Ｃ Ｐ 作 为 药 物 栽 体 的 应 由 Ｐ ｓ
在过 去 的 几 十 年 里 ， 们 发 现 一 种 小 于 ３ 个 氨 基 酸 的 短 人 Ｏ 肽 ， 些 肽 和 蛋 白质 构 成 一 种 新 的 很 有 潜 力 的 药 物 运 输 载 体 ， 这
细胞选择性穿膜肽的穿膜效果研究
细胞选择性穿膜肽的穿膜效果研究作者：谭拥军王坤余雳黄小芹陈燕谭桂湘来源：《湖南大学学报·自然科学版》2019年第06期摘; ;要：细胞穿膜肽是一类能够穿透细胞膜并且不损坏细胞膜结构的小分子多肽，该多肽一般由不多于30个氨基酸组成. 针对FITC标记的具有肺癌或肝癌细胞选择性的两种穿膜肽，设置不同浓度梯度，分别处理多种肿瘤细胞，荧光显微镜下观察不同作用浓度下细胞中绿色荧光的强弱，并通过流式细胞仪检测含有荧光的细胞数. 结果表明：两种细胞穿膜肽具有不同的细胞选择性. CPP33在作用浓度为10 μmol/L时能观察到较强的荧光选择性，流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于50%，CPP44在作用浓度为10 μmol/L时能观察到较强的荧光选择性，流式细胞仪检测含有荧光的细胞数约大于60%. 并且随着作用浓度的增加，两种细胞中含有荧光的细胞数不断上升. 因此这种针对肿瘤细胞的选择性穿膜肽可能为小分子药物在体内的精确递送提供一种新的方法.关键词：肿瘤选择性穿膜肽;肺癌;肝癌;浓度梯度;小分子药物中图分类号：Q784; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; 文献标志码：AStudy on Transmembrane Delivery ofTumour Lineage-homing Cell-penetrating PeptidesTAN Yongjun，WANG Kun，YU Li，HUANG Xiaoqin，CHEN Yan，TAN Guixiang（College of Biology，Hunan University，Changsha 410082，China）Abstract： Cell penetrating peptides are small molecular peptides that can penetrate cell membranes without damaging the structure of cell membranes. These peptides are generally composed of no more than 30 amino acids. Two tumor lineage-homing cell-penetrating peptides labeled with FITC for lung cancer and liver cancer were synthesized and added to different kinds of tumor cells with different concentration gradients. The number of cells containing fluorescence was detected. The results approved that the two kinds of cell-penetrating peptides showed different cell selectivity. The fluorescence specificity of CPP33 was strong at the concentration of 10 μmol/L. The number of cells containing fluorescence was about 50% by Flow cytometer. The fluorescence specificity of CPP44 was strong at the concentration of 10 μmol/L. The number of cells containing fluorescence was about 60% by Flow cytometer. Moreover， the number of cells containing fluorescence increased with the increase of concentration， respectively. In conclusion， these tumor lineage-homing cell-penetrating peptides may provide a new method for precise delivery of anticancer molecules in vivo.Key words： tumor lineage-homing cell-penetrating peptides;lung cancer;livercancer;concentration gradient;anticancer molecules细胞穿膜肽（cell penetrating peptides，CPPs）是一类由氨基酸组成具有穿透细胞膜能力的小分子多肽，其中氨基酸的个数一般不多于30[1-2].CPPs最早从人HIV-Ⅰ的TAT蛋白中发现，该蛋白中包含具有穿膜能力的特殊肽段区域蛋白转导域（protein transduction domains，PTD），该区域是一个包含13个氨基酸可溶性肽段[3-4]. 随着研究的深入，细胞穿膜肽的数量不断增加.CPPs的分类有多种，可以根据其来源或序列的不同分为不同的亞类[5]，还可以依据肽链所含脯氨酸的多少分为富含脯氨酸和多脯氨酸两种[6]，如SAP，该多肽中的脯氨酸含量高达50%. 除此之外，由于不同穿膜肽进入细胞后，会引起细胞内Ca2+的不同变化，可以将细胞穿膜肽分为两亲性和非两亲性，两亲性细胞穿膜肽会引起细胞内Ca2+不同程度的提高，而非两亲性细胞穿膜肽在转运过程中几乎不会对细胞内Ca2+产生影响[7]. 不同于普通的分类，还有一种特殊类型的细胞穿膜肽，该类穿膜肽由两条及以上的肽链组成，如转运蛋白、PEVEC、MAP和PEP-1[8].近年来，CPPs作为分子载体用于药物递送系统的应用已经越来越广泛.通过融合的方法可以携带核酸[9]、蛋白[10]、小分子化合物[11-12]、核磁共振成像载体[13]等进入细胞. Meyer-Losic等[14]将人工合成的一种功能肽DPV1047 Vectocell与SN38通过物理混合的方式制成复合物，通过对溶解性、毒性、稳定性的研究证明其具有很好的抗肿瘤作用，并且在动物实验上取得明显的效果.由于大部分细胞穿膜肽没有选择性，因此针对特定细胞的靶向治疗还停留在初级阶段.并且现有的肿瘤细胞选择性穿膜肽也是建立通过把已知非选择性穿膜肽与识别细胞表面抗原的抗体[15]连接或者与其他针对某种细胞的选择性分子形成复合物产生的，这种连接不仅受到所连分子理化性质的限制，对所针对的肿瘤细胞也具有一定的局限性. 近期Kondo等人[16]通过mRNA展示技术构建多肽文库，成功获得了肿瘤选择性细胞穿膜肽，并利用合成的肿瘤选择性穿膜肽对比多种不同肿瘤验证了其选择性效果.本文分别研究了肺癌细胞选择性穿膜肽CPP33、肝癌细胞选择性穿膜肽CPP44，经FITC 标记后，不同作用浓度下，在肿瘤细胞A549和HepG2等5种不同细胞中的细胞选择性，观察了不同浓度下细胞内的荧光强弱，通过流式细胞仪分析了不同肿瘤细胞中含有绿色荧光的细胞数目，确认了CPP33、CPP44两种细胞穿膜肽具有明显的细胞选择性.1; ;材料与方法1.1; ;材; ;料乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa、骨肉瘤细胞U2OS来源于American Type Culture Collection（ATCC）;DMEM培养基、1640培养基以及血清均为GIBCO公司产品;Flow Cytometer由BECKMAN COULTER公司提供;FITC标记多肽由上海淘普生物科技有限公司合成，序列信息如下：CPP33： RLWMRWYSPRTRAYGCPP44： KRPTMRFRYTWNPMK1.2; ;方; ;法1.2.1; ;不同浓度肿瘤细胞选择性穿膜肽显微观察在含有MCF-7、HepG2、A549、HeLa、U2OS 5种肿瘤细胞的10 cm培养盘中加入含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）的DMEM培养液后将培养盘放入37 ℃ 5%CO2培养箱中培养，待细胞密度长至90%时，吸出培养液，用1X无菌PBS漂洗两次，每盘加入1 mL 1X胰酶放入培养箱中消化2 min，待细胞变圆脱落时，加入1 mL含10% FBS的DMEM培养液轻轻吹打数次至单个细胞，并用培养液配成单个细胞悬液，以每孔1.2×106个细胞接种到6孔板中，每孔总体积为2 mL，放入培养箱中培养.在超净工作台中分别向CPP33、CPP44合成的多肽中分别加入4.22 mL、4.16 mL无菌ddH2O将其稀释至400 μmol/L.待6孔板中的细胞密度长至70%时，吸出培养液，用无菌PBS 漂洗两次，按终浓度分别为2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L设置浓度梯度，用含FBS培养液按照上述浓度梯度稀释多肽加入到培养板中. 剩余2孔只加2 mL培养液用作对照，放入培养箱中培养，6 h后观察细胞的荧光强度，并以穿膜数超过50%为有效穿膜肽统计穿膜率.1.2.2; ;流式细胞仪检测细胞荧光按照上述方法培养细胞，待细胞密度长至90%时，每盘加入1 mL 1X胰酶放入培养箱中消化2 min，待细胞变圆脱落时，加入1 mL含10% FBS的DMEM完全培养基轻轻吹打数次至单个细胞，并用培养液配成单个细胞悬液，以每孔7 × 106个细胞接种到10 cm培养盘中，每种细胞按照终浓度10 μmol/L加入FITC标记的穿膜肽，6 h后收集细胞.吸去培养皿中的培养液，用无菌PBS漂洗两次，加入1 mL lX胰酶，置于培养箱中消化2 min，待细胞变圆脱落时，加入1 mL含10% FBS的DMEM完全培养基轻轻吹打数次至单个细胞.将细胞收集在2 mL Eppendorf管中，4 ℃条件下1 000 r/min离心5 min，去除上清胰酶培养基混合物. 加入PBS漂洗两次，4 ℃，1 000 r/min离心5 min. 加入1 mL无菌PBS，使其细胞密度为1 × 106/mL，冰上存放用于流式检测，并取相同培养条件下，未加穿膜肽的细胞作对照.流式分析，创建Forward Scatter（FSC）vs. Side Scatter（SSC）峰图，将对照样品放入“test”管，调节FSC和SSC电压使细胞集中于FSC vs.SSC 峰图内. 创建一个门（R1）包括所有的细胞，基于门（R1）创建Fluorescence Channel 1（FL1）vs. SSC 峰图，调节FL1 PMT电压值以便DEAB“control”样品峰分布在102内. 取下对照样品，换上待检测样品，保持参数不变，出现在102以外的Polt即为含绿色荧光的细胞，分析约100 000个细胞，记录每种细胞中含绿色荧光的细胞比例.2; ;实验结果2.1; ;不同浓度肿瘤细胞选择性穿膜肽显微分析2.1.1; ;不同浓度肿瘤细胞选择性穿膜肽显微观察对比两种肿瘤细胞选择性穿膜肽在5种不同肿瘤中绿色荧光的强弱. 当肿瘤细胞浓度为2 μmol/L时，CPP33和CPP44在5种细胞中几乎没有荧光;当肿瘤细胞浓度为5 μmol/L时，5种细胞的绿色荧光亮度有所提高，加有CPP33的細胞中，A549细胞中的绿色荧光亮度最高;加有CPP44的细胞中，HepG2细胞中的绿色荧光亮度最高，两种穿膜肽在两种细胞开始出现明显的选择性. 当肿瘤细胞浓度为10 μmol/L时，CPP33、CPP44两种穿膜肽在两种细胞中的绿色荧光亮度提高明显，而在其他细胞中的绿色荧光亮度仍然很低;当肿瘤细胞浓度增大到20 μmol/L 时，CPP33、CPP44两种穿膜肽在A549、HepG2两种细胞中的绿色荧光亮度有所增加，但增加幅度较10 μmol/L时有所减少，并且其他细胞中的绿色荧光亮度也有不同幅度提高. 如图1所示.2.1.2; ;不同浓度肿瘤细胞选择性穿膜肽荧光细胞计数当肿瘤细胞浓度为2 μmol/L时，除A549细胞，CPP33在其余4种细胞中产生荧光的细胞数均低于5%;当肿瘤细胞浓度为5 μmol/L时，加有CPP33的细胞中，A549细胞中产生荧光的细胞数最高，大于20%;当肿瘤细胞浓度为10 μmol/L时，CPP33在A549细胞中产生荧光的细胞数大于50%;当肿瘤细胞浓度增大到20 μmol/L时，CPP33在A549细胞中产生荧光的细胞数约为60%. 如图2（a）（b）（c）（d）所示. 当肿瘤细胞浓度为2 μmol/L时，CPP44在5种细胞中产生荧光的细胞数均不超过2.4%;当肿瘤细胞浓度为5 μmol/L时，加有CPP44的细胞中，HepG2细胞中产生荧光的细胞数最高，大于7.5%;当肿瘤细胞浓度为10 μmol/L时，CPP44在HepG2细胞中产生荧光的细胞数大于50%;当肿瘤细胞浓度增大到20 μmol/L时，CPP33、CPP44两种穿膜肽在A549、HepG2两种细胞中产生荧光的细胞数大于60%. 如图2（e）（f）（g）（h）所示.2.2; ;流式细胞仪检测细胞荧光百分比图3为不同肿瘤细胞中波长超过102 nm的细胞数与细胞总数的百分比.在绿色荧光通道（FL1）中，流式分析10 μmol/L CPP33处理6 h后，5种细胞中A549细胞中含荧光细胞百分比最高，见图3（b），大约分别是其他4种细胞（HeLa、MCF-7、U2OS、HepG2）荧光数目的兩倍，分别如图3（a）（c）（d）（e）所示. 同样，流式分析10 μmol/L CPP44处理6 h后，5种细胞中HepG2细胞中含荧光细胞百分比最高，见图3（j），大约分别是其他4种细胞（HeLa、A549、MCF-7、U2OS）荧光数目的两倍，分别如图3（f）（g）（h）（i）所示.3; ;结; ;论本实验对两种不同肿瘤细胞选择性穿膜肽进行研究，运用不同细胞对比，发现CPP33穿膜肽能够有效穿过肺癌细胞A549的细胞膜进入细胞. 同样，CPP44穿膜肽能够有效穿过肝癌细胞HepG2的细胞膜进入细胞.两种穿膜肽均有较高肿瘤细胞选择性.细胞穿膜肽作为有效的药物运输载体已经在临床有所运用，但由于细胞种类的多样性和每种细胞的复杂性，目前针对特定细胞的选择性穿膜肽只有少数被发现和应用，对于特殊细胞的穿膜肽的开发还处于初级阶段.相对于非选择性细胞穿膜肽，CPP33、CPP44具有良好的细胞选择性，因此CPP33、CPP44可能成为有效的肿瘤选择性药物运输载体，这也为实现肿瘤细胞的靶向治疗提供了广阔的前景.参考文献[1]; ; ZHANG D，WANG J，XU D. Cell-penetrating peptides as noninvasive transmembrane vectors for the development of novel multifunctional drug-delivery systems[J]. Journal of Controlled Release，2016，229：130—139.[2]; ; BOLHASSANI A. Potential efficacy of cell-penetrating peptides for nucleic acid and drug delivery in cancer [J]. Biochimca et Biophysica Acta，2011，1816（2）：232—246.[3]; ; VIVES E，BRODIN P，LEBLEU B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus [J]. The Journal of Biological Chemistry，1997，272（25）：16010—16017.[4]; ;GUIDOTTI G，BRAMBILLA L，ROSSI D. Cell-penetrating peptides：from basic research to clinics [J]. Trends in Pharmacological Sciences，2017，38（4）：406—424.[5]; ; KOREN E，TORCHILIN V P. Cell-penetrating peptides：breaking through to the other side[J]. Trends in Molecular Medicine，2012，18（7）：385—393.[6]; ; PUJALS S，SABIDO E，TARRAGO T，et al. All-D proline-rich cell-penetrating peptides：a preliminary in vivo internalization study[J]. Biochemical Society Transactions，2007，35（4）：794—796.[7]; ; LORENTS A，KODAVALI P K，OSKOLKOV N，et al. Cell-penetrating peptides split into two groups based on modulation of intracellular calcium concentration[J]. The Journal of Biological Chemistry，2012，287（20）：16880—16889.[8]; ; PETRESCU A D，VESPA A，HUANG H，et al. Fluorescent sterols monitor cell penetrating peptide Pep-1 mediated uptake and intracellular targeting of cargo protein in living cells [J]. Biochimica et Biophysica Acta，2009，1788（2）：425—441.[9]; ; BOISGUERIN P，DESHAYES S，GAIT M J，et al. Delivery of therapeutic oligonucleotides with cell penetrating peptides[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2015，87：52—67.[10]; LIU J，GAJ T，PATTERSON J T，et al. Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering [J]. PLOS One，2014，9（1）：e85755.[11]; LINDGREN M，ROSENTHAL-AIZMAN K，SAAR K，et al. Overcoming methotrexate resistance in breast cancer tumour cells by the use of a new cell-penetrating peptide [J]. Biochemical Pharmacology，2006，71（4）：416-425.[12]; WANG F，WANG Y，ZHANG X，et al. Recent progress of cell-penetrating peptides as new carriers for intracellular cargo delivery [J]. Journal of Controlled Release，2014，174：126—136.[13]; LEWIN M，CARLESSO N，TUNG C H，et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells[J]. Nature Biotechnology，2000，18（4）：410—414.[14]; MEYER-LOSIC F，NICOLAZZI C，QUINONERO J，et al. DTS-108，a novel peptidic prodrug of SN38：in vivo efficacy and toxicokinetic studies[J]. Clinical Cancer Research，2008，14（7）：2145—2153.[15]; TURCHICK A，HEGAN D C，JENSEN R B，et al. A cell-penetrating antibody inhibits human RAD51 via direct binding [J]. Nucleic Acids Research，2017，45（20）：11782—11799.[16]; KONDO E，SAITO K，TASHIRO Y，et al. Tumour lineage-homing cell-penetrating peptides as anticancer molecular delivery systems [J]. Nature Communications，2012（951）：1—13.。
穿膜肽TAT和R9的生物学效应的体内体外研究
穿膜肽TAT和R9的生物学效应的体内体外研究徐咏婷; 陈燕; 余雳; 谭桂湘; 谭拥军; 黄明敏【期刊名称】《《激光生物学报》》【年(卷),期】2019(028)004【总页数】7页(P323-329)【关键词】细胞穿膜肽; 穿膜效率; 活体穿膜【作者】徐咏婷; 陈燕; 余雳; 谭桂湘; 谭拥军; 黄明敏【作者单位】湖南大学生物学院长沙410082【正文语种】中文【中图分类】Q784细胞穿膜肽也称为蛋白转导域，它是一类能携带蛋白质、多肽等一些其他的生物大分子穿过哺乳动物细胞膜的短肽[1]，直接将这些起治疗作用的蛋白质、多肽等穿过细胞膜进入细胞发挥生物作用并保持生物活性[2-5]。
蛋白质转导现象最初是在对来源于HIV1的反式激活蛋白(HIV-1-transactivatorprotein，TAT)的研究中发现的[6,7]，该蛋白是具有穿膜能力的特殊肽段区域[8]，其核心序列是由11个氨基酸组成，序列为YGRKKRRQRRR[9]。
自从TAT发现以来,许多肽被添加到CPP(cell penetrating peptide)家族中,其中包括人工合成的多聚精氨酸R9[10],多聚精氨酸R9通过融合9个精氨酸组成细胞穿膜肽[11]。
细胞穿膜肽TAT和R9有着的不同序列，因此在穿膜的过程中它们的效率和穿膜机制等均不相同；在利用细胞穿膜肽成药时，会根据细胞穿膜肽的特性选择相应的穿膜肽。
除了考虑穿膜肽的特性之外，同时还需考虑其毒性，在应用到细胞中时，浓度过高常常会导致细胞毒性增加，细胞将受到影响，同样在应用到小鼠体内时，也会产生和细胞同样的结果，在不断提高注射浓度时，容易增加细胞毒性[12]。
本试验通过构建细胞穿膜肽TAT-EGFP(HIV-1-transactivator-green fluorescent protein)的原核表达体系，采用His-Tag亲和纯化的方法对融合蛋白进行纯化，比较两种融合蛋白在乳腺癌细胞231中不同浓度梯度下对细胞的影响，并通过腹腔注射到小鼠体内，观察两种融合蛋白在不同器官中的分布，为如何选择细胞穿膜肽进行试验提供依据。
细胞膜通透性的机制与调节
细胞膜通透性的机制与调节细胞膜是细胞内与外环境的界面，它具有一定的选择性通透性，让细胞能够吸收必需物质和排泄代谢产物。
细胞膜通透性是细胞生命活动的关键之一，因此其机制与调节十分重要。
一、细胞膜通透性的机制1.膜结构细胞膜主要由磷脂双层、蛋白质和胆固醇组成。
在磷脂双层中，磷脂头部富含亲水基团，而脂尾部则由非极性疏水的脂肪酸构成，这种组合让磷脂双层具有一定的选择性通透性，只有小分子、非极性或弱极性的物质可以通过。
2.扩散扩散是指物质由高浓度区域自发性地向低浓度区域运动的过程。
在细胞膜中，扩散是一种主要的非载体转运方式。
小分子可溶于脂质的物质（如氧气、二氧化碳等）可以通过弥散进入细胞内。
3.载体转运载体转运是指利用特定的载体蛋白帮助物质跨过膜的过程。
多数极性化合物和大分子物质通过膜扩散很困难，只能由此途径通过。
这种方式又可分为被动运输和主动运输两种形式。
被动运输即物质顺浓度梯度通过膜，不需耗费能量；而主动运输则需耗费能量（如ATP）才能完成物质跨越膜的过程。
二、细胞膜通透性的调节1.膜蛋白细胞膜通透性的调节与其组成的膜蛋白的活性有关。
不同类型的膜蛋白具有不同的通透性。
部分膜蛋白负责特定物质的传输和选择性吸收，例如葡萄糖转运蛋白。
2.膜电位膜电位也是细胞膜通透性的重要调节因素。
细胞膜内外分别带正负电荷，在静息状态下保持一定电位差，称为静止电位。
静息电位能够影响膜上的离子通道开闭状态，从而调节细胞膜通透性。
3.细胞内信号分子细胞内信号分子可以作用于细胞膜上的离子通道，调节其开闭状态。
例如，胆碱能够作用于乙酰胆碱受体，引起离子通道的打开，从而增加细胞膜的通透性。
4.渗透压细胞内外的渗透压也能够影响细胞膜通透性。
当细胞外环境渗透压高于细胞内时，水分子从细胞内向外扩散，从而使细胞容积变小，甚至发生溶解。
而当细胞外环境渗透压低于细胞内时，水分子则会扩散进入细胞内，导致细胞膨胀。
总之，细胞膜通透性的机制和调节非常复杂，涉及多种因素的相互作用。
带vec穿膜肽的超氧化物歧化酶重组质粒、融合蛋白及构建方法
带vec穿膜肽的超氧化物歧化酶重组质粒、融合蛋白及构建方法1.引言1.1 概述超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，在生物体内可以将有害的超氧自由基转化为无害的氧气和过氧化氢。
然而，由于其本身的不稳定性和低效性，应用范围有限。
因此，加强对超氧化物歧化酶的研究，寻找新的改进方法具有重要意义。
在本文中，我们提出了一种新的改进方法，即通过引入vec穿膜肽来构建超氧化物歧化酶重组质粒和融合蛋白。
vec穿膜肽是一种具有细胞穿透能力的多肽，能够有效地将外源基因导入到靶细胞内。
通过引入vec穿膜肽，可以提高超氧化物歧化酶在细胞内的表达效率和稳定性。
本文的主要目的是探索使用vec穿膜肽来改善超氧化物歧化酶的表达和功能。
首先，我们将详细介绍超氧化物歧化酶重组质粒的构建方法，包括选择适当的表达载体、设计合适的引物和连接酶。
然后，我们将介绍如何构建融合蛋白，将超氧化物歧化酶与vec穿膜肽融合在一起，以提高细胞内的表达效率和稳定性。
通过本文的研究，我们期望能够提供一种新的改进方法，用于增强超氧化物歧化酶的抗氧化能力，并为相关领域的研究和应用提供有价值的参考。
此外，我们还将探讨可能的拓展方向，进一步开发和优化超氧化物歧化酶的改良策略，以满足不同领域的需求。
在接下来的章节中，我们将详细介绍超氧化物歧化酶重组质粒的构建方法和融合蛋白的构建过程，并总结本研究的主要结果和意义。
通过本文的研究，我们希望能够为超氧化物歧化酶的改进提供新的思路和方法，并为相关领域的研究和应用做出贡献。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以描述为以下内容：在本文中，将介绍带有vec穿膜肽的超氧化物歧化酶重组质粒以及融合蛋白的构建方法。
文章将按照以下结构进行组织和阐述：第一部分是引言。
概述了文章要研究的问题和背景，并对文章的结构和目的进行了概述。
第二部分是正文。
首先介绍了超氧化物歧化酶重组质粒的构建方法，包括质粒的构建、转染和筛选等步骤。
然后详细阐述了如何将vec穿膜肽引入质粒中，以便提高质粒在细胞内的转染效率和稳定性。
细胞穿膜肽pep-1与vMIP-Ⅱ的融合表达与纯化
ｐ Ｔ１ ｂ ｐ ｐ １ ｖ Ｐ Ｉ ｓｎ ｈ ｓｓｆｏ ｃ ｌｐ ｒ ｅ ｂｅｐ ｐ ｉｅｐ ｐ １ａ ｄ ｖｒｌ ｃｏ ｈ ｇ ｆ ｍｍａｏ ｒ — Ｅ － ｅ 一 一 ＭＩ —Ｉ ， ｙ ｔｅ ｉ ｒ ｍ ｅｌ ｅ ５ ｍ ａ ｌ ｅ ｔ ｅ 一 ｎ ｉａ ｍａ ｒｐ ａ ｅｉｌ ｄ ｎ ａ ｔ ｒ ｐ ｏ ｙ
Ⅱ） 的融 合表 达质 粒 ｐ Ｔ１ｂｐｐ １ｖ Ｐ Ⅱ， 将其 转 化大肠 杆 菌 Ｂ ２ （ Ｅ ） ｌｓ Ｅ ５ ．ｅ一一ＭＩ一 并 Ｌ １ Ｄ ３ ｐｙＳ中经 ＩＴ 诱 导表达 ， ＰＧ
经 Ｓ ．Ａ Ｅ和 Ｗｅｔｍ．ｌｔ 定 出可溶性 的融合 蛋 白 ｐ ｐ １ｖ Ｐ ｌ。通过 对 ＩＴ ＤＳＰ Ｇ ｓ ｂｏ 鉴 ｅ ｅ 一 一 ＭＩ —Ｉ Ｐ Ｇ浓 度 、 温度 等诱 导表 达 条 件 进 行 优 化 ， 确 定 在 ＩＴ 浓 度 为 ０ ＰＧ ． ｍｍｏ／ 、 ８ ２ ｌ ２ ℃下 诱 导 ７ｈ可 溶 性 蛋 白的表 达 量 相 对 较 高 ， Ｌ 经 Ｎｉ Ａ亲 和层 析 ， 滤 除盐 纯化 获得 高纯 度 的融 合 蛋 白 ｐｐ １ｖ Ｐ １ 将 该 蛋 白作用 于 Ｈ ｌ ＮＴ 超 ｅ 一 一 ＭＩ一Ｉ， ｅａ细胞 ， 光 激 共聚 焦显微 镜观 察结果 显示 该融合 蛋 白能够携 带 目的基 因穿透 细胞膜 。本文 结果 将为进 一 步研究 ｖ Ｐ １ ＭＩ一１ 的功 能和细 胞穿膜 肽技 术 的应 用奠 定基础 。 关键 词 ｖ Ｐ １， ｅ 一 ， Ｍ１一 Ｉ ｐ ｐ １ 细胞 穿 膜肽 ， 核表 达 原
Ｍ ａ ａ ｅ ｎ ， ｎ ｚ ｏ ｒ ａ ｉ ｅ ｓｔ ， ｎ ｚ ｏ ， １ ０ ６ ｎ ｇ ｍｅ ｔ Ｈａ ｇ ｈ ｕ Ｎｏ ｍ ｌ Ｕｎ ｖ ｒ ｉ Ｈａ ｇ ｈ ｕ ３ ０ ３ ｙ