平滑肌细胞培养实验步骤
小鼠血管平滑肌细胞原代培养及体外钙化模型的制备
小鼠血管平滑肌细胞原代培养及体外钙化模型的制备徐丽华;严金川;伍超;逯朝阳;王中群;袁伟【摘要】目的:建立一种简单、高效的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)原代培养方法及体外钙化模型.方法:采用改良的组织贴块法培养小鼠VSMCs,经免疫荧光染色法鉴定后,将细胞随机分为对照组和钙化组.采用yon kossa染色及比色法检测两组细胞内钙含量.结果:培养3～5d时,可见细胞从组织块边缘爬出,7～10d后细胞融合成片;免疫荧光染色显示胞质表达特异性α-肌动蛋白;VSMCs培养至第2代细胞纯度达95％;与对照组相比,钙化组细胞的钙含量、碱性磷酸酶(ALP)活性明显增加(P均＜0.05).结论:改良的组织贴块法可获得高纯度的小鼠VSMCs;β-甘油磷酸钠在体外可有效诱导其钙化.%Objective:To establish a simple and efficient method for primary culture of mouse aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs) and calcification model in vitro.Methods:The primary VSMCs were harvested by modified tissue-piece inoculation and identified by immunocytochemistry.The established VSMCs were randomly divided into control group and calcification group.Calcification of cells was assayed by von kossa staining and colorimetry method.Results:VSMCs migrated from explants of mouse aorta tissue after 3-5 days of culture.After 7-10 days,VSMCs grew to form a fusing monolayer.Immunofluorescence staining with specific mAb against mouse α-actin demonstrated VSMCs were positive.The cell purity of the 2nd generation of VSMCs was over 95％.Compared with the control group,the calcium content and ALP activity in the calcification group were increased significantly (both P ＜0.05).Conclusion:The method of modified explant-culture successfully established a effective model for primary culture of VSMCs,of which calcification in vitro could be induced by β-glycerophosphate.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(024)002【总页数】4页(P110-113)【关键词】血管平滑肌细胞;原代培养;钙化【作者】徐丽华;严金川;伍超;逯朝阳;王中群;袁伟【作者单位】江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001【正文语种】中文【中图分类】R543血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管壁的重要组成部分，通过协调血管收缩和舒张，控制血管压力和流速。
巨噬细胞平滑肌细胞共培养
巨噬细胞平滑肌细胞共培养
巨噬细胞平滑肌细胞共培养是一种体外细胞培养技术，用于研究巨噬细胞和平滑肌细胞之间的相互作用以及相关生物学过程。
在共培养中，巨噬细胞和平滑肌细胞被培养在同一培养皿中，它们之间可以通过分泌细胞因子、细胞间接触以及其他途径相互作用。
这种相互作用可以模拟体内情况，帮助科学家更好地理解细胞间相互作用的机制。
巨噬细胞平滑肌细胞共培养可用于研究多种生物学过程，包括炎症反应、血管平滑肌细胞增生、血管收缩和松弛、血栓形成等。
该技术也被广泛用于筛选药物、评估药效和研发新的治疗方法。
总之，巨噬细胞平滑肌细胞共培养是一种有用的实验技术，可以帮助科学家更好地了解细胞间相互作用的机制，为疾病的预防和治疗提供理论基础。
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离体小肠平滑肌生理特性实验报告
离体小肠平滑肌生理特性实验报告一、实验目的1、学习哺乳动物离体器官灌流的实验方法。
2、观察和分析小肠平滑肌的生理特性，包括自动节律性、兴奋性、收缩性以及对各种刺激的反应。
二、实验原理小肠平滑肌具有自动节律性收缩的特性，其收缩活动受到神经、体液以及化学物质等多种因素的调节。
离体小肠平滑肌在适宜的环境中仍能保持其生理特性，通过给予不同的刺激，可以观察到小肠平滑肌的相应反应。
三、实验材料1、实验动物：＿____2、实验器材：恒温平滑肌槽、张力换能器、生物信号采集处理系统、手术器械、氧气袋等。
3、实验药品：台氏液、乙酰胆碱、肾上腺素、阿托品、HCl 溶液等。
四、实验步骤1、制备离体小肠平滑肌标本击昏实验动物，迅速剖开腹腔，取出一段小肠，置于盛有台氏液的培养皿中。
小心去除肠系膜和脂肪组织，将小肠剪成 2-3cm 的小段。
选取肠管平滑肌活性良好的部分，两端用线结扎，制成肠管标本。
2、安装实验装置将肠管标本一端固定在浴槽底部的固定钩上，另一端连接张力换能器，并将张力换能器与生物信号采集处理系统相连。
向浴槽中加入适量台氏液，保持恒温 37℃，并持续通入氧气。
3、观察小肠平滑肌的自动节律性收缩启动生物信号采集处理系统，记录小肠平滑肌的收缩曲线，观察其自动节律性。
4、观察小肠平滑肌对化学物质的反应向浴槽中依次滴加乙酰胆碱、肾上腺素、阿托品等药物，观察小肠平滑肌收缩曲线的变化。
5、观察小肠平滑肌对酸、碱刺激的反应向浴槽中滴加适量 HCl 溶液，观察小肠平滑肌的反应；随后用台氏液冲洗，待收缩恢复正常后，再滴加适量NaOH 溶液，观察其反应。
6、观察小肠平滑肌对温度刺激的反应升高或降低浴槽内台氏液的温度，观察小肠平滑肌收缩曲线的变化。
五、实验结果1、自动节律性收缩小肠平滑肌在台氏液中能够自发地、节律性地产生收缩和舒张活动，收缩曲线呈现一定的周期性。
2、对化学物质的反应滴加乙酰胆碱后，小肠平滑肌收缩幅度明显增大，收缩频率加快，表现为兴奋作用。
体外培养血管平滑肌细胞的同步方法
清 楚 ，但揭示 Ｖ ＭＣ增 生 或 增 殖 的信 号 通 路 具 有重 ０ ０ ｌＬＰ Ｓ ｐ ７ ２ 清洗 ５ｍｎＸ Ｓ ． １ｍｏ Ｂ （ Ｈ ． ） ／ ｉ ３次；用 ９０ｍＬ Ｌ无水 ５ ／ 要 意义 ， 增 殖信 号转 导 最 终 的共 同通 路 是 细 胞 周 乙醇室温下 固定 ２ ｉ ， 而 ０ｍ ｎ 同上清洗 ；１０ｍＬ Ｌ正常 山羊 血清 ０ ／ 期 进展 … 。 因此 ，研 究 细胞 周 期 与 Ｖ ＭＣ之 间 的 关 封闭液 ，湿盒 内温 育 ３ ｎ Ｂ 洗 ；加１ １０（ 鼠抗大 Ｓ ０ｍｉ，Ｐ Ｓ清 ：０ 小 系 ， 立有 效 的能将 Ｖ ＭＣ同步 各 个 细胞 周 期 阶段 ， 建 Ｓ 对 于揭 示动 脉 粥样 硬 化 的发病 机 制 具 有 重 要 的指 导 作 用 。 以往 一直 着力 于 Ｖ ＭＣ增 殖方 面 的研 究 ’ ， Ｓ
０／ ６孔培养板 中， 按不 同分组分别加 ２０Ｉ ０ Ｌ Ｌ 饿法 同步 Ｇ／ ０Ｇ 期 ’ ， 而对 于 Ｇ／ ｌＳ期 、Ｓ期 、Ｇ／ １ 孔 接种 细胞 于 ９ ２Ｍ
期 的 同步 效 果 尚未见 报 道 ，我 们 通 过 原 代 培 养 的 大 鼠 Ｖ ＭＣ， 用胸 苷 、秋 水仙 素 同步化 ，寻 找 同 步方 Ｓ 采 法 的最佳 条件 ，利 用 流 式 细 胞 术 （ Ｃ 测 定 其 同 步 Ｆ Ｍ） 效果 ， 分析 在不 同细 胞周 期 中 Ｖ ＭＣ的 Ｄ Ａ含 量 情 Ｓ Ｎ 况 ，为冠 状动 脉 粥 样 硬 化 的发 病 机 制 的研 究 提 供 实
体外 培 养 血管 平 滑肌 细 胞 的 同步 方 法
小肠平滑肌试验报告
小肠平滑肌试验报告一、实验目的了解小肠平滑肌的收缩和松弛机制。
二、实验原理三、实验材料和方法材料：小白鼠、显微镜、小刷子方法：1.分离小鼠小肠：将小鼠剖腹，取出小肠并放入含生理盐水的培养皿中。
2.清除黏液：用小刷子沿小肠轻轻刷去黏液。
3.选择一段小鼠小肠，用显微镜观察其平滑肌。
4.直接刺激：用细针刺激小肠平滑肌，观察其收缩和松弛情况。
5.药物作用：加入不同的药物，如乙酰胆碱、肾上腺素等，观察其对小肠平滑肌的作用。
四、实验结果1.内源性调节：(1)神经调节：刺激平滑肌可以引起其收缩或松弛。
(2)内分泌调节：刺激平滑肌可以引起其收缩或松弛。
(3)自主调节：平滑肌具有自发性收缩和松弛的能力。
2.外源性调节：(1)乙酰胆碱：加入乙酰胆碱后，小肠平滑肌明显收缩。
(2)肾上腺素：加入肾上腺素后，小肠平滑肌开始松弛。
五、实验讨论1.神经调节主要通过神经末梢释放乙酰胆碱或去甲肾上腺素等神经递质来调节小肠平滑肌的收缩和松弛。
2.内分泌调节是通过内分泌物质的分泌来调节小肠平滑肌的收缩和松弛。
3.自主调节是指小肠平滑肌具有自发性收缩和松弛的能力，与细胞内钙离子浓度的变化有关。
4.乙酰胆碱作为一种神经递质，可以通过刺激乙酰胆碱受体，引起小肠平滑肌的收缩。
5.肾上腺素作为一种神经递质，可以通过刺激肾上腺素受体，引起小肠平滑肌的松弛。
六、实验结论小肠平滑肌的收缩和松弛机制主要通过内源性和外源性调节实现。
内源性调节包括神经调节、内分泌调节和自主调节；外源性调节主要是药物的作用。
乙酰胆碱可以引起小肠平滑肌收缩，肾上腺素可以引起小肠平滑肌松弛。
这些调节机制对于小肠正常消化和排泄功能的维持具有重要意义。
七、实验心得通过本次实验，我对小肠平滑肌的调节机制有了更深入的了解。
同时，我也学会了使用显微镜观察和操作小肠平滑肌。
这个实验对我的实验技巧和实验思维能力提升有着积极的影响。
未来我将继续学习相关知识，深入研究平滑肌的调节机制，为进一步探索相关领域做好准备。
胃肠道平滑肌细胞培养及鉴定
胃肠道平滑肌细胞培养及鉴定高静;徐晓霞;陈平【摘要】胃肠道平滑肌原代细胞培养基本保留了体内生长特性,作为一种体外研究模型,在生理学、病理学、胃肠动力学和药物代谢动力学等较多研究领域显示出细胞株所不具备的优越性.本文就胃肠道平滑肌原代细胞的分离、培养、纯化和鉴定方法方面进行了综述,为研究消化系统疾病培养胃肠道平滑肌细胞方法的选择提供参考.【期刊名称】《哈尔滨医药》【年(卷),期】2017(037)002【总页数】3页(P185-187)【关键词】胃肠道平滑肌细胞;分离;培养;纯化;鉴定【作者】高静;徐晓霞;陈平【作者单位】内蒙古医科大学附属医院消化内科,内蒙古呼和浩特 010010;内蒙古医科大学附属医院消化内科,内蒙古呼和浩特 010010;内蒙古医科大学附属医院消化内科,内蒙古呼和浩特 010010【正文语种】中文【中图分类】R573胃肠道平滑肌组织在人和动物体内分布广泛，是构成人体消化道的重要空腔脏器，通过收缩蠕动来协助器官的功能发挥。
胃肠道平滑肌原代细胞由于刚刚从活体组织分离出来，生物学特性还未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，可反映出体内生长的一般性质，适合用于胃肠动力学、运动调节机制及药物研究等[1]。
但由于获得胃肠道原代细胞的过程较复杂、培养困难，使得原代细胞还不能成为实验材料的首选对象。
原代细胞是否培养成功主要与细胞的分离、培养方法有关，因此有效分离原代细胞并保持其相应的生物学特性，找到适合其生长的环境尤为重要。
胃肠道平滑肌细胞培养主要来自于SD乳鼠、小鼠、大鼠、豚鼠及家兔等，取材前务必将实验动物禁食12 h以上（未进食的可直接用于实验），分离材料时应在手术显微镜或解剖显微镜下进行，以达到分离完全的目的，分离后应用4℃含双抗（青霉素，链霉素）的PBS液反复冲洗，直至组织块发白，再用不含血清的培养基冲洗1～2遍，将洗好的组织剪成1～2mm3大小组织块，在剪碎的过程中要保持湿润，最好使用不含血清的培养基，使用的刀剪尽量锋利，预防对组织的撕拉等造成损伤，应尽量缩短取材的时间。
小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定
在 ９ 以 上 。 ８
３ 讨 论
子 宫平 滑肌 细胞 的收缩 、 舒张 、 增殖 、 纤维 化与 妇产科 疾病 密切 相关 。因此 ， 外培 养子 宫 平滑 肌 细胞 体 就成 为研究 这些疾 病及 相关 药物药 理 的一种 重要 实验材 料 。本研 究成功 运用 自制 针头 分离 器 将平 滑 肌组 织与 内膜基 层完全 分 离 ， 使用胶 原酶 和胰 酶 混合 消 化法 、 用 ２ Ｆ Ｓ ＭＥ Ｆ ２培 养 基对 小 鼠子 宫 并 采 ０ Ｃ Ｄ Ｍ／ ｏ ｓ ｓ ｌ ｔｏ ｌｕ ｅ ａ ｄ ｎ ｉ ｉ ａ ｉ ｎ ｆ Ｍ ｕ ｅ
Ｍ ｙ ｍ ｅ ｒａ ｍ ｏ ｔ ｕ ｃｅ Ｃｅｌ ｏ ｔ ｉｌＳ ｏ ｈ Ｍ ｓ ｌ ｌ
Ｆ Ｎ Ｊ ｇ ｊｎ Ａ ｉ － ｉｇ’ ｎ
用 一次 性 １ ｍＬ注射器 的针 头 （ 打弯成 ３ 。 ） 为分 离器 轻轻 将 子 宫 内膜 和基 质 部 分 刮掉 （ Ｏ角 作 分离 过 程 见 图 １ ， 内膜 和基质 去除 干净 的子宫平 滑肌 条剪 碎 至 ｌ ）将 ｍｍ。用 ３ ０２ 的胶 原酶 和 ０２ ６ 酶 混 合 消 ， ｍＩ ．５ ． ５／ ９胰 化 液 ３＂ 浴震荡 消化 ｌ ，ｍＩ有血 清 ＤＭＥ －Ｆ ２培养液 终止 消化 ， ７ Ｃ水 ｈ２ Ｍ－ １ 吹打数 次 ，０ ２０目细胞筛 过滤 吸取 悬 液 ， 通过 ４０目细胞 筛 ， 集 滤 液 １０ｒｍ／０ ｎ离 心 ， 再 ０ 收 ０ ０ｐ １ｍｉ 基础 培 养 液 洗 ２次 ， 除 细胞 碎 片 ， 种 于 去 接
ＭＯ公 司 ） 其它试 剂均 为 国产分析 纯 。实验设 备 包括 ： 通 冰箱 、 Ｏ： ， 普 Ｃ 培养 箱 （ ａ ｙ ） 解 剖显 微 镜 （ ｔ Ｓｎｏ、 Ｍｏ—
离体小肠平滑肌运动实验报告
离体小肠平滑肌运动实验报告离体小肠平滑肌生理特性实验报告人体机能学实验报告离体小肠平滑肌肌的生理特性实验结果：实验讨论：1、我们可以看到小肠从17℃转移到38℃的台氏液中，小肠平滑肌的收缩幅度、基线上移和频率增加，产生上述的主要原因是：小肠肠管的台氏液温度以38℃~40℃为宜，低于或高于这个温度，都会影响结果。
由于小肠管平滑肌对温度改变极为敏感，当温度降到30℃以下时，故代谢水平的降低，兴奋性减弱，可出现收缩曲线基线下移，频率变慢，收缩幅度变小。
2、在浴槽中加入乙酰胆碱后，可见离体肠管活动增强，幅度增加。
出现上述现象的机理，目前认为乙酰胆碱可与肌膜上的M受体结合，使得两类通道开放：一类为电位敏感性Ca2+专用通道，另一类为特异性受体活化Ca2+ 专用通道。
前一类通道对Ach敏感，小剂量Ach即引起开放；后一类通道对Ach相对不敏感，只有大剂量Ach才会引起开放。
这两类通道开放都使得肌浆中Ca2+增高，进而激活肌纤蛋白—肌凝蛋白—ATP系统，使平滑肌收缩，肌张力增加。
3、在浴槽标本管中加入阿品托溶液，2分钟后再加入乙酰胆碱（Ach ），发现小肠管张力和收缩力没有明显的变化，原因是阿托品是乙酰胆碱阻断剂，使乙酰胆碱的作用消失。
故加入乙酰胆碱后没有作用。
所以两者都加入观察到曲线无明显变化。
4、在浴槽中加入肾上腺素后，可见离体肠管活动减弱，描记曲线出现收缩频率变慢，幅度减小以及基线下移。
出现上述现象的机理，目前认为与肠肌细胞膜上存在α和β两中受体，α受体又分为α抑制型受体和α兴奋型受体有关。
肾上腺素作用于α抑制型受体，引起肠肌膜上一种特异性受体活化，使K+外流增多，细胞膜发生超极化，肠肌兴奋性降低，肌张力下降。
同时，肾上腺素还作用于β受体，①它的激活引起肠肌细胞膜中的cAMP合成增多，cAMP激活肠肌膜及肌浆网上Ca2+泵活动，使肌浆中Ca2+浓度降低，亦使肌张力降低；②β受体激活后还促使K+及Ca2+外流增加，加速膜的超极化，促进了肠肌肌张力的减低。
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原代平滑肌细胞培养Protocol
实验准备：
器材：注射器（10mL），玻璃吸管，胶头（用于细脚吸管，吹匀组织块用），枪头（蓝色、
黄色），移液器（1000μL，100μL），电动移液器，玻璃培养皿（2-3个），小烧杯（10
mL或5 mL），青霉素瓶（配鼠尾胶原），剪刀（大，小，弯）多把，镊子（大，小，
弯）多把，纱布，六孔板（真空包装），托盘（放老鼠），酒精棉球，乳胶手套
试剂：平滑肌细胞专用培养基，生理盐水，D-hank’s 液，鼠尾胶原，戊巴比妥钠（麻醉用），
75%酒精
步骤：
1. 高压灭菌实验所需器材，超净台紫外照射30mins，吹风；
2. 配制鼠尾胶原应用液，一般1:15-1:19稀释，六孔板中每孔加入1mL稀释液待用（可省去）；
3. 大鼠（200g左右，一百五六十克较好）腹腔注射一定体积戊巴比妥钠（0.5mL/100g）麻
醉，麻醉好后将大鼠全身（尤其是胸腹部）用酒精棉球擦拭干净，放入托盘置于超净台中
紫外照射15mins左右，开始试验；
4. 用已消毒的剪刀将大鼠腹部表皮剪开，充分暴露出整个胸部，再换用干净的剪刀打开胸
腔。将肝脏及肺脏等组织拨开（小心操作以避免伤到血管）。用小弯镊及小直镊分离胸主
动脉外壁贴附的结缔组织及外膜等。分离干净后，用眼科剪小心剪断血管，去除血管中的
血，置于干净玻璃培养皿中；
5. 用生理盐水多次冲洗分离出来的血管。冲洗干净后，将血管剪开，小心刮除血管内膜，
去掉内皮细胞；
6. 将处理好的血管放入平滑肌细胞专用培养基（约200μL）中，用眼科剪将组织尽量剪碎
成1mm3大小的小块，用细脚吸管吹匀后，均匀种入加了鼠尾胶原的六孔板中；
7. 用黄枪头小心吸弃多余的液体（避免将组织块吸起来），然后将六孔板盖好颠倒放在培养
箱中约2h（待组织块粘牢培养板底）后，再加入培养基；
8. 过3-4d后拿出细胞在显微镜下观察，看其是否已长出。