大鼠骨骼肌细胞培养实验指导
大鼠骨髓干细胞的培养、诱导分化为骨骼肌治疗骨骼肌缺损的动物模型的实验研究
67.6%,说明诱导后的MSCs仍具有很强的分化潜能
O.7
O.6 0.5 O.4 O.3 O.2 O.1
/
/
/广。
.∥尹/彭∥
么彩j
图15:MSCs、Mb、诱导后MSCs生长曲线
图16J左为正常组织中注射的细胞,可以看到蓝染的细胞核,和其中的大量红细胞:右图为坏死组织中注射的细胞,可以看到大片坏死肌组织,其中看不到蓝
死较多,视野因为细胞碎片而变得不清洁。lOOX
图11:5一Aza诱导MSCs后2周,细胞形态明显变化,呈三角形、纤维状等,
可见多个细胞融和在一起。lOOX
图12:诱导后3周,融和在一起的细胞形成多核的肌管,200x
图13:诱导为成肌细胞的鉴定:结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白呈阳性反应,见核呈蓝色,胞浆呈黄褐色。200X
山东大学硕士学位论文
图19:取下注射无水乙醇的胫前肌,观察坏死肌组织的
纵切面(左)和横切面(右)
图20:取下注射无菌生理盐水的胫前肌,观察注射部位肌组织的
纵切面(左)和横切面(右)
图2l:免疫组化,Desmine抗体。大鼠左下肢胫前肌(注射无水乙醇),注射3天,自左至右依次为注射培养基(可见视野中大片的肌肉坏死,没有细胞)、MSCs (可见视野中有少量散在的核蓝染的细胞)、诱导MSCs(可见视野中有较多的核蓝染的细胞)、Mb(可见视野中有较多的核蓝染的细胞)。400X
图24:免疫组化,Desmine抗体。大鼠左下肢胫前肌(注射无水乙醇),注射12天,自左至右依次为注射培养基(可见视野中大片的肌肉坏死,偶见蓝染细胞核,考虑肌卫星细胞开始代偿修复,均位于肌束边缘,但较第6天增殖不明显)、MSCs (可见视野中有少量散在的核蓝染的细胞,数量有所增多)、诱导MSCs、Mb (可见视野中有较多的核蓝染的细胞,明显较第9天为多,并可见到多个核聚在
大鼠骨骼实验报告
一、实验目的1. 探讨大鼠骨骼的结构、形态和生长发育规律；2. 分析大鼠骨骼的生理功能及影响因素；3. 为骨骼疾病的研究和预防提供理论依据。
二、实验材料与方法1. 实验动物：选用健康的Wistar大鼠，体重在180-220g之间，雌雄各半；2. 实验仪器：电子天平、解剖显微镜、切片机、显微镜、图像分析系统等；3. 实验方法：（1）骨骼标本采集：对实验大鼠进行麻醉，取其头骨、躯干骨、四肢骨等部位；（2）骨骼形态学观察：采用解剖显微镜观察大鼠骨骼的形态、大小、结构等特征；（3）骨骼生长发育规律研究：选取不同月龄的大鼠，比较其骨骼形态、大小、结构等特征；（4）骨骼生理功能研究：通过测量大鼠的骨密度、骨强度等指标，探讨骨骼的生理功能；（5）影响因素研究：研究不同环境、营养等因素对大鼠骨骼发育的影响。
三、实验结果1. 骨骼形态学观察（1）头骨：大鼠头骨呈椭圆形，分为颅骨和面骨，颅骨主要由额骨、顶骨、颞骨、枕骨等构成，面骨主要有上颌骨、鼻骨、泪骨等；（2）躯干骨：大鼠躯干骨包括颈椎、胸椎、腰椎、骶椎、尾椎等，颈椎较短，胸椎较宽，腰椎较长，骶椎和尾椎较短；（3）四肢骨：大鼠四肢骨包括肱骨、桡骨、尺骨、股骨、胫骨、腓骨等，四肢骨呈对称分布，具有明显的生长发育规律。
2. 骨骼生长发育规律研究（1）头骨：大鼠头骨的形态、大小、结构随月龄的增长而逐渐发育成熟；（2）躯干骨：大鼠躯干骨的形态、大小、结构随月龄的增长而逐渐发育成熟，其中腰椎的发育速度最快；（3）四肢骨：大鼠四肢骨的形态、大小、结构随月龄的增长而逐渐发育成熟，其中肱骨和股骨的发育速度最快。
3. 骨骼生理功能研究（1）骨密度：大鼠的骨密度随月龄的增长而逐渐增加，其中头部、上肢、大腿、躯干和肋骨部骨密度值均显著或极显著高于同月龄全身骨密度值；（2）骨强度：大鼠的骨强度随月龄的增长而逐渐增强，其中头部、上肢、大腿、躯干和肋骨部的骨强度均显著或极显著高于同月龄全身骨强度值。
细胞生物学实验步骤
冻存细胞的复苏1、于液氮罐中取出冻存管。
2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。
3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。
4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。
5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。
组织块法培养骨骼肌细胞1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。
2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。
3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。
5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。
翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。
入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
贴壁细胞的传代和冻存1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。
2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。
3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。
4、加培养液终止消化。
5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。
6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。
7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。
8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。
9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。
细胞计数血球计数板每一大方格长为1mm，宽为1mm，高为0.1mm，体积为0.1mm3，可容纳的溶液是0.1μl，那么每ml溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中数出的细胞数的10000倍。
大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性[1]
![大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/da9f5e78168884868762d68d.png)
上海交通大学学报(医学版)Vol .28No .7Jul .2008Journal of Shanghai J iaotong University (Medical Science )基金项目:上海市科委基金(044119605)(Shanghai Science and Technol ogy Comm ittee Foundati on,044119605)。
作者简介:徐 可(1975-),男,上海人,主治医师,博士;电子信箱:huashanxuke @medmail 。
通讯作者:方祖军,电子信箱:huashanfangzujun @ 。
文章编号: 0258-5898(2008)07-0775-04・论 著・大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性徐 可, 方祖军, 李映川, 郑 捷, 丁 强(复旦大学 华山医院泌尿外科,上海 200040)摘 要:目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。
方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。
免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT 法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。
结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白des m in 呈强阳性表达。
体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1～2d 的潜伏期,5～6d 进入平台期。
细胞汇合至60%～70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。
结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。
骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。
关键词:骨骼肌卫星细胞; 培养; 增殖; 分化中图分类号:Q 813.11 文献标志码:ACharacter isti cs of proli fera ti on and m yotube cell forma ti on of ra t skelet a l m uscle s a tellite cells cultured in vitroXU Ke,FANG Zu 2jun,L I Ying 2chuan,ZHENG Jie,D I N G Q iang(D epart m ent of U rology,Huashan Hospital,Fudan U niversity,Shanghai 200040,China )Abstract: O bjective To establish a method of is olation and purificati on of rat skeletal muscle satellite cells,and observe the characteristics of p r oliferati on and my otube cell for mati on of skeletal muscle satellite cells cultured in vitro . M ethods Purified skeletal muscle satellite cells were obtained by i mp r oved t wo 2step enzy matic digesti on method and p re 2p lating technique .I m munohistochem ical staining was emp l oyed t o identify the skeletal muscle satellite cells cultured in vitro .The gr owth of skeletal muscle satellite cells cultured in vitro was exam ined by MTT assay .The differentiati on of skeletal muscle satellite cells was observed by inverted m icr oscopy . Resu lts The skeletal muscle satellite cells with higher purity were obtained and confir med by the high exp ressi on of des m in .W hen cultured in vitro ,the latent phase of skeletal muscle satellite cells was the first t o the second day,and the p latfor m phase was the fifth t o the sixth day .My otube cells gradually for med when cell confluence was more than 60%t o 70%or differential medium with l ower fetal bovine serum was used .Conclusion The co mbinati on of i mp r oved t wo 2step enzy matic digesti on method and p re 2p lating technique serve as an easyand p ractical way to obtain skeletal muscle satellite cells with higher purity .Skeletal muscle satellite cells can for m myotube cells with contraction characteristics without any s pecial induction .Key words: skeletal muscle satellite cell; culture; p r oliferation; differentiation 骨骼肌卫星细胞是存在于骨骼肌肌膜和基底膜之间的一些单个核细胞,被认为是一种具有一定自我更新能力[1]及已发生某种程度定向分化的成体组织内的专能干细胞[2],因此在组织工程和基因治疗领域有着良好的应用前景。
细胞生物学实验步骤
冻存细胞的复苏1、于液氮罐中取出冻存管。
2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。
3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。
4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。
5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。
组织块法培养骨骼肌细胞1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。
2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。
3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。
5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。
翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。
入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
贴壁细胞的传代和冻存1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。
2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。
3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。
4、加培养液终止消化。
5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。
6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。
7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。
8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。
9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。
细胞计数血球计数板每一大方格长为1mm，宽为1mm，高为0.1mm，体积为0.1mm3，可容纳的溶液是0.1μl，那么每ml溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中数出的细胞数的10000倍。
大鼠原代心肌细胞培养实验的
相关记录：年月日星期天气：实验内容：C57小鼠心肌细胞培养参加人员：王朗郭源源一、培养前准备：1 器械：取心脏： wpi剪2把、显微镊弯2把、眼科镊1把取心脏后：显微剪1把、持针器2把、吉利刀片2片、眼科镊2把、400目细胞滤网2 器皿：外：烧杯1个 100ml内：盛酒精小烧杯、棉签2包，鼠板盛小鼠尸体，玻璃皿100mm 2，碎冰盆底加两个冰袋，离心管架1，6孔板，EP管，15ml离心管，50ml离心管3 试剂与配制1.培养基：DMEM/F12，添加15%FBS2.提前融化：BrdU溴脱氧尿苷 100X储藏液(10 mM)，小牛血清、II型胶原酶〔10mg/ml储藏液〕、0.25%胰酶提前融化3.D-Hanks液：二方法1 心脏取出1. 加10ml和6ml未加血清的DMEM/F12到2个100mm皿中，平皿放入冰盆预冷。
2. 将20只小鼠婴放入100mm玻璃平皿，镊取小鼠放入75%酒精中浸泡数秒，对其颈部以下消毒，抓取小鼠，固定住上肢与下肢，从颈部剪下头部，剪刀由颈部伸入胸腔沿胸骨左侧剪开，轻轻挤压胸廓，让心脏跳出，迅速用镊子取下心脏，放入盛有10ml DMEM/F12的玻璃平皿中。
3. 轻柔清洗心脏的血液后转入另一个盛有10ml DMEM/F12液的10cm培养皿中，用显微剪将心脏剪成1-2mm的碎片。
4. 以上过程应在冰上30min之内完成。
2 消化细胞1. 将剪碎的组织转入15ml离心管，吸去DMEM/F12，参加酶消化液4ml。
2. 37度水浴中轻摇，消化10min，静止数秒钟，吸取上清液，弃去。
此时消化下的细胞为不需要的红细胞、细胞碎片以与心内膜和心外膜细胞。
3. 37度水浴中轻摇，消化4-5min。
静止数秒钟，吸取上清液，放入预先放好7ml〔体积为上清液体积的2-3倍〕含20%小牛血清的DMEM/F12培养基的15ml离心管中终止消化，并置于冰上。
4. 重复3步骤，循环5-6次。
取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。
大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养的实验研究
·实验研究·大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养的实验研究夏家红 谢艾妮 徐磊 张凯伦 基金项目:国家自然科学基金资助项目(03970720);武汉市晨光计划青年基金资助项目(20035002016-17)作者单位:430022武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院心脏外科 【摘要】 目的 改进鼠肌卫星细胞体外培养方法,得到更高纯度的肌卫星细胞。
方法 采用成年Wistar 大鼠,将两步消化法加以改进,采用Ficoll 分离和差速贴壁法两步纯化得到更高纯度的肌卫星细胞。
所得细胞采用免疫组织化学方法加以鉴定。
结果 此方法肌卫星细胞纯化率可达到98%。
细胞增殖快,生长良好。
结论 本实验成功建立了卫星细胞纯化方法,适用于心外科及相关科室开展细胞移植和基因治疗方面的研究。
【关键词】 肌细胞; 细胞培养; 纯化C ulture of rat musclesatellite cell in vitro XI A Jia -hong ,X IE Ai -ni ,XU Lei ,et al .Depart ment ofCardiovascular Surgery ,Uion Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and T echnology ,Wuhan 430022,China【Abstract 】 Objective To improve the culture method of rat muscle setellite cell in vitro and ob -tain more purified muscle setellite cells .Methods T he mo re purified satellite cells w ere obtained from adult Wistar rats isolated by improved two -steps digestion metho d ,and purified by the tw o -step method of F icoll seperation and velocity sedimentation .T he cells w ere identified by immunochemical stain .Results T he purification rate of satellite cells was 98%by using this method and they showed stro ng proliferative ablity and g rew well .Conclusion T he purification technique for satellite cell was developed successfully .It w as useful for cardial surg ery department or other departments to study cell transplantion and gene therapy .【Key words 】 M uscle cell ; Cell culture ; Purificatio n 1961年Mauro [1]发现了骨骼肌卫星细胞,并证实其是骨骼肌干细胞。
大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究
的大鼠骨骼肌肌卫星 细胞 ， 行体外原代骨骼肌 和传代 骨骼肌的细胞培 养。传至第 ２ 后 ， 进 代 用分化培养基 诱导 分化 ， 骨骼肌 细胞各 观察 个阶段 的形 态特征 并拍 照。［ 结果］ 此方法分 离的 细胞成 活率较 高， 外生 长、 体 增殖 良好 。在 分化培 养基 条件 下， 细胞 分化 良好 ， 可融合 成肌 管。【 结论 ］ 实验成 功探 讨 了新生大 鼠骨骼肌卫 星细胞的分化能 力并建立 了卫 星细胞 纯化 方法 ， 该 适用于开展 细胞移植 和肌组 织工
Ｚｔ ＮＧ ｌ ｎｌ ｔａ （ｃｏｌ ｆ ｉ ｅ ｎｅ Ｎ ｎ ｎ ｎｖｒｔ， ａｔ ｇ Ｊ ｎｓ ２０ ） ＩＡ Ｃｌ － ｅ ｌ Ｓｈｏ ｆ Ｓｉ ｃ ， ａｔ ｇＵ ｉ ｓｙ Ｎ ｎ ｎ ，ｉ ｇｕ２６叽 ｅ ｍｉ ｏＬｅ ｅ ｏ ｅｉ ｏ ａ
Ａ ｓ １ ｂｃｖ Ｔ ｅｍｅ ｄ ｆｈ ｕｉｃｔｎ ｃｌｒ ｎ ｅｔ ｃｔ ｎａｄｔ ｉｏｉ ｌ ｈｒｃ ｒ ｔｓ ｆｋｌａ ｕｃ ａ ｌｔｃｌ ｉｏ ｂＩ 喇 ｅｔ ｅ ｈ ｔ ｓｏ ｅｐｒ ａｉ ，ｕｔ ｅａｄｉ ｎｆ ａｏ ｎ ｅｂｏ ｇｃ ａａｔ ｉ ｃ ｅ ｔｌ ｓｌ ｓｔｌｅ ｅｌ ｉ ｖｒ Ｏ ｉ Ｊ ｏ ｈ ｔ ｉ ｆ ｏ ｕ ｄ ｉ ｉ ｉ ｈ ｌ ａｃ ｅ ｓ ｏ ｓ ｅ ｍ ｅ ｅｉ ｓｎ ｔ ｉ ｗ Ｉ ｅｐｏ ．Ｍｅ ｏｓ ｋｌｔ ｍｓｌ ｓｅｉｅｓｈｒｅｔ ｏａｒｔｗ Ｉ ｓ ｏｐｒ ｉｕ ｕｔｅａｄⅡ ｌ ｃｌｃｌ ｒ．ｈ ｋｌａ 心 ｌ ｅ ｘｌｒ ｛ ｔ ｄ Ｓｅ ａ ｌ ｃｅ ｐｃ ｎ ａｖ ｅ ｆｒ ｓ ｅｅｕｅ ｔ ｄ ｕｅｔｓｅｃｌ ｒ ｎ 心 ｅ ｅｌ ｕｔ ｅ Ｔｅｓｅｅ ｌⅡ ｅ ｅ ｅ ｈ Ｊ ｅ ｌ１ ｍ ｓ ｄｌ ａ ｄｏ ｓ ｕ ｕ ｔ
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
大鼠骨骼肌细胞培养
骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。
肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。
肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。
肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。
体外培养大鼠骨骼肌细胞，为临床肌肉损伤的治疗提供理论依据.
一、实验前准备
实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。
按照含0.2%的XI胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的PES微孔滤膜进行过滤除菌，置于50毫升离心管中，可直接用于组织消化。
瓶口消毒后室温待用。
取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量PBS置于相应标记的培养皿中。
无菌条件下，准备好各种大小的眼科剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。
将断颈处死后浸泡于体积分数为 75%乙醇的SD大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。
二、骨骼肌提取
眼科剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。
小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有PBS的无菌培养皿中。
吸取适量消化液于相应标记的培养皿中。
将剪取的骨骼肌在无菌PBS浸泡清洗，去除脂肪组织后放置于含消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成1平方毫米不规则碎片。
轻轻摇匀，室温静置消化30分钟
收集组织悬液于50毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。
轻轻吹打混匀组织块悬浮液。
配平离心：每分钟1000转，室温离心十分钟。
三、骨骼肌悬液制备及培养
离心后小心去除上清，不要吸到底部的组织块沉淀，用含20%胎牛血清的DMEM培养基重悬，轻轻吹打混匀，制成悬液，均匀转移至六孔板中，轻轻摇匀，标记时间后放于37 ℃、体积分数为 5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。
本次实验采用差速贴壁法去除成纤维细胞,37 ℃培养1小时后，吸取上清液置于另一孔中继续培养,每隔一小时转移一次，转移3-4次。
4 天后换液, 以后每天换液1 次，直到增殖达到融合。
四、细胞观察及鉴定
差速培养后，细胞24小时后开始贴壁,96小时后完全贴壁，倒置显微镜下每天观察细胞生长及形态特征，传代培养纯化至P3代用于后续试验。
采用HE染色和a-actin染色进行骨骼肌细胞鉴定。
结果表明：本实验所用的消化液以及差速贴壁法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨骼肌细胞。
五、注意事项
1、消化液的制备及消化时间
合适的消化液以及消化时间的把握, 是实验取材的关键：
合适的消化液利于骨骼肌细胞从基膜中释放出来。
酶作用时间不足则获得细胞较少,作用时间过长则可致细胞受损、生长状态不佳。
2、肌肉组织要尽可能剔除表面的膜和脂肪组织：
肌肉组织表明的膜和脂肪组织去除利于后续细胞的纯化，减少传代次数，获得纯度高的骨骼肌细胞。
3、纤维细胞的去除:
本实验采用差速贴壁法去除成纤维细胞,37 ℃培养1小时后移至另一孔进行培养，转移两次，有效去除骨骼肌细胞中的成纤维细胞。