细胞复苏实验指导
细胞培养基础知识详解-细胞的复苏、传代和冻存
细胞培养基础知识详解细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导整理：江耀伦李美娣1 细胞复苏细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
1.1实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。
（3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
1.2 细胞复苏培养（1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。
（2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。
（4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。
吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。
（5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。
1.3 初学者易犯错误（1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。
（2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
（3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
（4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
1.4 细胞传代1.4.1 传代前准备（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
（2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。
（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
1.4.2 细胞传代（1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。
（2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
细胞复苏及存活率测定
细胞工程实验报告实验课程：细胞工程实验内容：细胞复苏及存活率测定一实验目的1、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。
2、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。
3、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。
二实验原理在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。
但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。
因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。
血球计数板：血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。
H 型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比两侧平台要低0.1 mm。
计数室：每一大方格面积为1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，（0.1ul）三、主要仪器试剂设备：血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、离心管等。
试剂： MEM+10%小牛血清液、胰蛋白酶、PE液、0.4%台盼蓝等。
四实验步骤（复苏）●从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入36～37℃恒温水浴中，不时轻轻摇动，使其在40～60秒内尽快解冻。
●用75%酒精擦拭消毒细胞冻存管，在超净工作台上打开盖，将细胞悬液倒入培养瓶中，快速加3ml MEM血清培养液，摇匀后静置，→30min后在显微镜下检查贴壁情况→大部分细胞贴壁后，从侧面轻轻吸出培养液2ml MEM血清培养液置培养箱中培养→从侧面加入新培养液，培养，一周后观察。
（细胞死活鉴定及计数）➢用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。
把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。
➢取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。
➢如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。
活力测定细胞复苏
三、实验材料
仪器、材料与试剂 1．仪器：普通显微镜、血球计数板、试管、
吸管、分光光度计。 2．材料：细胞悬液。 3．试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮
2．细胞活力测定
台盼蓝活力测定机理： 正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，
使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完 整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成 蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细
胞已经死亡。
①将一定浓度的细胞悬液与0.4%台盼兰以9:1混 合。
②染色2一3分钟。
3、复温速度 越快越好，37 ℃水浴中，1-2min完成复温。
4、冷冻保护剂 保护细胞免受冷冻损伤的物质，常用甲亚 砜（DMSO）和甘油。
三、实验材料
1．仪器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮罐，离心 机，水浴锅，微量加样器等
2．材料：冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿 瓶）、离心管、吸管等。
3．试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培 养基（即冻存液）等。
一、实验目的： 1．掌握测定细胞活力的方法。
二、实验原理
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能 生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每 毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细 胞计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞， 总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由 组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离 的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也 要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
⑤细胞浓度计算： 四大格的细胞总数除以4，得 出平均每大格的细胞数，每大格的容积为 0.1mm3，因此，不同稀释倍数细胞悬液的细胞 浓度可用下式计算：
实验报告-细胞复苏及细胞鉴别与计数
细胞生物学实验报告实验二细胞复苏及细胞鉴别与计数1引言1.1 实验目的1. 掌握无菌操作技术。
掌握细胞复苏技术。
2. 掌握用血球计数板进行细胞计数的方法。
3. 学习死活细胞鉴别的方法。
4. 了解细胞污染的判定方法。
5. 了解细胞形态的多样性。
1.2 实验原理1.细胞复苏：以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程，复苏时要快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞在1分钟内快速融化至37℃，使细胞迅速通过最易受损的温度区间-5-0℃，使冻存时细胞外的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
2.细胞计数：采用血细胞计数板法，血细胞计数板由一块长约7.5cm，宽3.5cm的厚玻璃制成，平台中部上下各有一个计数室，每个计数室分9大格，每格边长1mm，面积1mm2，盖上盖玻片后体积为0.1mm3。
四角的大格划分为16个中方格，一般用作白细胞、血小板组织培养的细胞计数。
中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格面积为0.04mm2，盖上盖玻片后体积为0.004mm3，每个中方格又分成16个小方格，用于红细胞、微生物细胞的计数。
细胞计数原则：细胞压线则计上不计下，计左不计右，镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。
对每个试样重复计数3次，取其算数平均值。
2实验仪器、试剂及操作步骤2.1 实验仪器超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒（头）、吸管筒（头）、废液缸、移液器、枪头等2.2 实验试剂DMEM培养基、血清、抗生素等2.3 实验步骤细胞复苏：1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。
2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。
3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。
4.自液氮中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，立即投入40℃水浴锅中解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化。
细胞复苏传代实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞复苏和传代的基本操作流程。
2. 了解细胞生长周期及细胞传代的意义。
3. 观察细胞在不同培养条件下的生长状态。
二、实验原理细胞复苏是指将冻存的细胞恢复到正常生长状态的过程。
细胞传代是指将培养的细胞从一个容器转移到另一个容器中，以增加细胞数量。
细胞复苏和传代是细胞培养过程中的重要环节，对于细胞生长、实验研究具有重要意义。
三、实验材料1. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、双抗、PBS、75%酒精。
2. 仪器：水浴锅、台式离心机、细胞计数仪、CO2培养箱、倒置显微镜、移液枪、移液管、细胞培养瓶。
四、实验步骤1. 细胞复苏（1）将冻存的细胞取出，放入37℃水浴锅中，边振荡边使其解冻，直至细胞悬液呈半透明状。
（2）用移液枪将细胞悬液转移至离心管中，离心5min，800rpm。
（3）弃去上清液，加入适量DMEM培养基，轻轻吹打使细胞重悬。
（4）将细胞悬液转移至培养瓶中，放入CO2培养箱中培养。
2. 细胞传代（1）待细胞贴壁生长至80%左右，用吸管轻轻吹打，使细胞脱离培养瓶壁。
（2）将细胞悬液转移至离心管中，离心5min，800rpm。
（3）弃去上清液，加入适量DMEM培养基，轻轻吹打使细胞重悬。
（4）将细胞悬液按1:2的比例转移至新的培养瓶中，放入CO2培养箱中培养。
3. 细胞观察（1）每隔24小时观察细胞生长状态，记录细胞数量、形态等。
（2）用倒置显微镜观察细胞形态，拍摄细胞照片。
五、实验结果与分析1. 细胞复苏后，细胞形态正常，生长状态良好。
2. 细胞传代过程中，细胞数量逐渐增加，生长状态稳定。
3. 观察细胞形态，细胞呈典型的上皮细胞形态，细胞质均匀，细胞核清晰。
4. 通过细胞计数仪对细胞进行计数，计算细胞生长倍数。
六、实验结论1. 本实验成功复苏和传代了细胞，为后续实验研究提供了细胞来源。
2. 通过细胞复苏和传代，可以增加细胞数量，满足实验需求。
3. 观察细胞生长状态，细胞生长稳定，为后续实验研究提供了有力保障。
细胞冷冻复苏实验报告
实验名称：细胞冷冻复苏实验实验日期：2023年11月10日实验人员：张三、李四、王五一、实验目的1. 熟悉细胞冷冻和复苏的操作步骤。
2. 掌握细胞冻存过程中的保护剂选择和浓度控制。
3. 了解不同冷冻复苏方法对细胞活力的影响。
二、实验原理细胞冷冻复苏技术是将细胞置于超低温环境中，使细胞代谢活动减缓或停止，从而实现长期保存的技术。
复苏过程是将冻存的细胞恢复到正常生理状态，使其重新生长和分裂。
三、实验材料1. 细胞：小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）2. 培养基：DMEM培养基3. 保护剂：二甲基亚砜（DMSO）4. 冻存管：无菌冻存管5. 液氮：液氮罐6. 移液器：移液器、枪头7. 培养箱：细胞培养箱8. 显微镜：倒置显微镜9. 台盼蓝染色液四、实验方法1. 细胞培养：将MEF细胞接种于培养皿中，置于培养箱中培养至对数生长期。
2. 细胞冻存：（1）将细胞用DMEM培养基洗涤2次，收集细胞。
（2）用移液器将细胞重悬于含有10% DMSO的DMEM培养基中，使细胞浓度为1×10^6个/mL。
（3）将细胞悬液转移至无菌冻存管中，每管1.5 mL。
（4）将冻存管置于-80℃冰箱中过夜。
（5）将冻存管转移至液氮罐中，长期保存。
3. 细胞复苏：（1）将冻存管从液氮罐中取出，置于37℃水浴中快速融化。
（2）将细胞悬液转移至培养皿中，加入适量DMEM培养基，置于培养箱中培养。
4. 细胞计数：用血球计数板对复苏后的细胞进行计数。
5. 细胞活力检测：用台盼蓝染色法检测细胞活力。
五、实验结果1. 细胞冻存：冻存后细胞形态正常，无死亡。
2. 细胞复苏：复苏后细胞形态正常，生长良好。
3. 细胞计数：复苏后细胞数量为1.2×10^6个。
4. 细胞活力检测：台盼蓝染色结果显示，复苏后细胞活力为95%。
六、实验讨论1. 细胞冻存过程中，选择合适的保护剂和浓度对细胞活力至关重要。
本实验中，使用10% DMSO作为保护剂，可有效保护细胞免受冷冻损伤。
细胞的复苏实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞复苏的基本原理和操作步骤。
2. 学习如何将冻存的细胞恢复到适宜的生长状态。
3. 观察复苏细胞的形态变化，评估复苏效果。
二、实验原理细胞复苏是指将冻存的细胞从超低温状态恢复到正常生长状态的过程。
冻存细胞在超低温下，其代谢活动几乎停止，细胞膜和细胞器结构保持稳定。
复苏过程中，细胞需经历快速复温和缓慢复温两个阶段，以避免细胞结构和功能的损伤。
三、实验材料1. 冻存细胞（如人胚胎干细胞、小鼠成纤维细胞等）2. DMEM培养基（含10%胎牛血清）3. 灭菌的0.25%胰蛋白酶4. 灭菌的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）5. 灭菌的75%酒精6. 灭菌的移液器、吸管、培养皿、培养瓶等四、实验步骤1. 准备工作：将DMEM培养基预热至37℃，将胰蛋白酶、PBS、75%酒精等实验试剂准备齐全。
2. 复苏细胞：a. 将冻存管置于37℃水浴中预热5分钟。
b. 将冻存管取出，用无菌移液器吸取适量预热的DMEM培养基，加入冻存管中，轻摇使细胞与培养基混合。
c. 将冻存管置于37℃水浴中，待细胞完全融化后取出。
d. 将细胞悬液用无菌移液器转移至培养皿中，轻轻吹打使细胞分散。
3. 计数：取适量细胞悬液，用血细胞计数板进行细胞计数，计算细胞浓度。
4. 传代：a. 将细胞悬液用胰蛋白酶消化后，用PBS清洗，重新计数。
b. 根据细胞浓度，按1:2或1:10的比例传代至新的培养瓶中。
5. 培养：将传代后的细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，观察细胞生长情况。
五、实验结果1. 细胞复苏成功，细胞活力较高。
2. 细胞形态正常，呈典型的纺锤形。
3. 细胞生长旺盛，分裂速度较快。
六、实验分析1. 冻存细胞在复苏过程中，需注意以下几点：a. 快速复温：避免细胞在复苏过程中受冻害。
b. 轻轻吹打：避免细胞在吹打过程中受到损伤。
c. 适量传代：避免细胞过度拥挤，影响生长。
2. 冻存细胞的复苏效果与冻存时间、冻存方法等因素有关。
细胞复苏及培养实验方法
细胞复苏及培养实验方法
一、准备细胞复苏所需物品
1.离心管
2.细胞计数板
3.移液管
4.细胞培养瓶
5.细胞冻存管
6.液氮
7.37℃水浴
8.培养基
9.血清
10.抗生素
二、细胞复苏步骤
1.从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中快速复苏。
2.待细胞冻存管外表面融化后，打开管盖，用移液管吸出细胞悬液，放入离心管中。
3.将离心管中的细胞悬液以适当的转速和时间离心，去除上清液。
4.离心后，用含有一定比例血清和抗生素的培养基重悬细胞，制成细胞悬液。
5.将细胞悬液均匀分装到细胞培养瓶中，放入培养箱中进行培养。
三、细胞培养步骤
1.将细胞培养瓶放入培养箱中进行培养，保持适宜的温度和湿度。
2.根据需要更换培养基，保持细胞生长所需的营养和生长因子。
3.根据细胞的生长情况，适时进行传代培养，保持细胞的生长活力和数量。
4.在培养过程中进行必要的细胞鉴定和表型检测，确保细胞质量和实验结果
的可靠性。
5.记录细胞的生长情况、传代次数和鉴定结果等信息，建立完整的细胞系档案。
注意事项：
1.在操作过程中要保持无菌操作，避免污染。
2.根据不同的细胞类型和实验需求，选择适宜的培养基、血清和生长因子。
3.定期检查细胞的形态、生长情况和传代情况，及时发现异常并进行处理。
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细胞复苏
细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。
细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。
一、实验前准备
实验开始前，将无菌培养瓶，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。
然后，采用通风机通风3min。
以75%酒精擦拭操作台和双手。
准备好冰盒。
将离心机调节至800rpm，5min。
水浴箱调节至37度恒温。
取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。
消毒双手和超净台。
取约10ml细胞完全培养基放于15ml离心管中。
实验前备冰盒，快速由液氮中取出冻存的细胞，置于冰盒内。
然后迅速将冻存管投入到已经预热到37度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。
整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。
二、制备细胞悬液
以无菌枪头吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO的浓度，减轻细胞损伤。
以封口膜封好管口。
配平离心：采用天平配平两端，800rpm，室温离心5min。
三、细胞计数
采用罗氏CASY-DT快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。
加入10ml CASY-ton至以标记viable的管子中，加入100ul细胞悬液，颠倒混匀三次，可进行细胞计数。
可见每毫升悬液中有活细胞2乘10的5次方.
四、细胞培养
离心后，吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。
根据计数结果，向离心管内的细胞沉淀加入10ml细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液，吹打过程中尽量不要产生气泡。
符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，左右轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱中培养，2-4小时或者24-48小时后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定，一般以大部分细胞状态良好时换液为宜，比如超过半数的细胞贴壁，即可换液。
五、注意事项
1、取冻存管要做好保护措施
取细胞的过程中未带好防冻手套，护目镜。
此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸,当然，选择好的冻存管此状况一般不会发生。
2、解冻速度要快
在常温下，冻存液中的DMSO对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。
如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。
3、细胞贴壁少
一般冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15ml培养液，培养基加入过多，造成细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁，所以进行细胞的计数尤为重要。
4、一次复苏细胞不宜过多
细胞在解冻时，水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
正规来说，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
并且一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。