纤维素酶的基因克隆研究进展

纤维素酶的基因克隆研究进展

摘要：纤维素酶是一种高活性生物催化剂，具有广阔的开发和应用前景。本文对纤维素酶的特性、研究进展、应用以及纤维素酶基因克隆等方面进行了综述，并对今后的研究趋势作了预测和展望。

关键词：纤维素酶；分子生物学；基因克隆；前景展望

前言

纤维素是植物细胞壁的主要成分，约占植物干重的1/3—1/2，它是地球上分布最广、含量最丰富、生成量最高的有机化合物。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。利用纤维素酶将纤维素彻底水解是纤维素的有效利用途径。纤维素酶(cellulase)是指能水解纤维素β—l，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。近年来对纤维素酶的基础研究，包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能以及酶蛋白的基因调控等诸多方面，并且均取得了显著进展。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。

1.1 纤维素酶的组成

纤维素酶是由许多高协同作用的水解酶组成的，根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4,即C1酶），来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen、外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex) 和β-葡聚糖苷酶（β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。

(1)外切葡聚糖酶，这类酶作用于纤维素分子的末端，一次从纤维素分子中切下纤维二糖，它可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲基纤维素。对于外切纤维素酶，传统上认为是从纤维素链的非还原端切下纤维二糖。可是，从一些微生物的外切酶的研究中发现了另一种纤维素酶，它们优先从纤维素分子的还原末端切下纤维二糖。这些研究说明存在两种不同功能的外切酶，它们分别从还原端和非还原端水解纤维素分子[ 1 ]。

（2）内切葡聚糖酶，这类酶是纤维素酶中最重要的酶，可作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量的小分子纤维素，即纤维素末端。

内切型纤维素酶可为外切酶提供大量的反应末端，同时它也能水解小分子的纤维素寡糖。

（3）葡聚糖苷酶，这类酶的作用是将纤维二糖水解为葡萄糖。纤维二糖酶在水解过程中可以大大减小低聚糖对外切酶和内切酶的产物抑制。纤维二糖是一种非专一性酶，可以水解多种糖苷键，也能水解纤维三糖、纤维六糖等。

内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区,产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端,释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。真菌纤维素酶产量高、活性大，在畜牧业和饲料工作中主要应用真菌来源的纤维素酶[ 2 ]。

纤维素和几丁质分子结构图示

1.2纤维素酶的分类与分布

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木酶属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium）。

纤维素酶种类繁多，来源很广。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。由于真菌纤维素酶产量高、活性大，故在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

1.3 纤维素酶降解纤维素的机理研究

纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。1950年，Reese等提出了C1 - C x 假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖[ 3 ]。协同作用一般认为是内切葡聚糖酶( C1 酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成C x 所需的新的游离末端，然后由C X 酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和β-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。若先用C1酶作用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结晶纤维素水解。

研究发现，反刍动物瘤胃中的厌氧型真菌分泌到胞外的纤维素酶和木聚糖酶对降解木质纤维素有重要的作用。这些真菌分别属于5个属：Neocallimastix，Cacomyces，Orpinomyces，Piromyces和Rurainoraycesl361。Neocallimastixfrontalis研究得最多。M frontalis分泌的纤维素酶是多组分的复合酶称之为结晶纤维素溶解因子(crystalline cellulose solubili zingfactor，CCSF)1371，其分子量为700 KDa，由许多分子量在68．135 KDa的亚基组成[ 4 ]。将这些亚基分开会使纤维素酶降解结晶纤维素的活力降低p81。这种复合酶水解结晶纤维素的机制与厌氧型细菌C thermoceUum中的纤维小体相似。Ⅳ．frontalis(RK21)是迄今为止最为有效降解结晶纤维素的微生物，因此，对这种真菌的纤维素降解机制的研究非常有意义。

1.4 纤维素酶的分子结构

纤维素酶分子是由球状的催化结构（Catalytic Domain,CD)通过一个富含脯氨酸或羟基氨基酸的连接桥（Linker)和没有催化作用纤维素合成结构域（carbohydrate-binding modules,CBM)三部分组成。只有少数微生物和高等植物产生的纤维素酶没有这类结构域[ 5 ]。

纤维素酶分子的催化结构域（CD），主要体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。Juy采用X光衍射的方法对热纤梭菌的CelDde 催化域进行了结晶和解析。结果表明，内切酶的活性位点位于一个开放的裂口中，它可结合在纤维素链的任何部位并切断纤维素链。外切酶的活性位点位于一个长“环”所形成的“内部通道”里面，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。Meinke.A利用蛋白质工程的方法将粪碱纤维单胞菌的外切酶CBHA分子的“环”删除后，发现该酶的内切酶活性提高[6]。应用定点突变和酶专一性抑制剂的大量研究结果，证明Glu位于细菌的内切酶、外切酶、葡萄糖苷酶的活性位点。在异头碳原子位通过构型的保留或构型的转化完成催化反应，其中两个保守的羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂，从而证明了细菌纤维素酶降解纤维素的水解双置换机制[7]。

迄今为止，所有已知的纤维素酶的催化结构域根据其氨基酸序列的相似性可分为70

个家族，在同一个家族内具有相似的分子折叠模式和保守的活性位点。因此，Tomme.P通过比较15种来自己3个家族的纤维素酶的酶解试验认为在同一家族内，纤维素酶的反应机制和对底物的特异性都可能相同[8]。

纤维素结合结构域（CBM）在纤维素酶中位于肽链的氨基端或羧基端，通过连接桥与催化结构域相连[9]。纤维素结合结构域提高了酶在纤维素上的亲和力，也提高了酶的溶解性。纤维素结合结构域不具备水解纤维素的功能，但有助于纤维素酶与底物的结合。CBM可能通过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由CBM上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链从纤维素表面脱离开来，以利于催化区的水解作用。但有一些纤维素酶并没有CBM，如热纤梭菌是依靠纤维素酶系中的纤维小体(celluosome)吸附纤维素的。

真菌和细菌产生的纤维素酶分子差别很大，但它们的催化区在一级结构上氨基酸数星和三维结构上的大小却基本一致。但它们的Linker和CBM却存在明显的差异。真菌和细菌来源的纤维素酶的CBM的三维结构也得到了解析，真菌来源的纤维素酶的CBM由33—36

个氨基酸组成，且具有高度的同源，而细菌来源的纤维素酶的CBM由63--240个氨基酸组成，同源性较低。一些细菌的CBM顺序有一定的共同特点：带电荷氨基酸含量很低，羟基氨基酸含量很高，都含有Vrp、Asn和Gly，而且两个Cys在N、C末端的位置完全相同[10]。粪碱纤维单胞菌的CcnA或Ccx单独的CBM不具备对纤维素的水解活力，但能破坏棉纤维，形成短纤维，具有疏解结晶纤维素的能力。因此，细菌纤维素酶中的CBD对酶的催化活力是非必需的，但它们具有调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用。

真菌的外切酶的CBM的结构形状呈“楔型”，一面亲水，另一面疏水；结构中芳香族氨基酸只有3个Tyr，它们位于平坦的亲水面，执行吸附纤维素的功能；细菌外切酶的cBM

很大，且包含很多芳香族氨基酸，它们中的Trp54和Trp72暴露于蛋白分子表面，执行吸附功能。这种楔形结构，能插入和分开纤维素的结晶区，在其吸附于纤维素分子链表面后，酶分子连接到纤维素上，可能提高了底物表面有效酶的浓度，或者可能促进了纤维素表面单个葡聚糖链的增溶溶解，具有疏解纤维素链的作用[11]。不同的CBM以不同的拓扑学结构与结晶纤维素结合，都具有相似的刚性支柱结构，以便进行识别和结合所需的侧链能正确定位。

连接桥(Linker)是一段相当长、高度糖基化的连接肽，此区大多富含脯氨酸和羟脯氨酸，它的作用可能是保持CD和CBM之间的距离，有助于同酶分子间形成较为稳定的聚集体。这一段肽链由于易暴露于水相，对蛋白酶非常敏感，为了防止被蛋白酶水解，这一肽链常常被O-glycosilated糖基化。细菌纤维素酶linker富含Pro和Thr，完全FhPro．Thr这样的重复顺序组成，而真菌的纤维素酶linker富含Gly，Ser和Thr。不同纤维素酶linker的糖基化

程度和糖链也不同，糖化不是纤维素酶活力所必需的[12]。

在高级结构的分子形状上，细菌纤维素酶CD与CBD夹角为135；真菌纤维素酶CD 与CBD夹角为180。有限酶切时，真菌纤维素酶只具有一个酶切位点，在靠近CD与连接桥边结区，酶切时可将CBD与连接桥一并切去；而细菌的外切酶具有两个酶切位点，有限酶切时，可将CBD和连接桥分别切去。

1.5 纤维素酶的研究进展

1.5.1国外主要研究概况

1906年，Seilliere在蜗牛的消化液中发现有纤维素酶，能分解天然纤维素。1933年，Grassman等研究了一种真菌的纤维素酶系，分辨出2个组分。20世纪40-50年代，人们对产纤维素酶的微生物进行了大量的分离筛选工作，建立起较为完整的分离筛选方法。20世纪60年代后期，由于分离技术的发展，推动了纤维素酶的分离纯化工作，加快了纤维素酶的组分、作用方式及诱导作用等方面的研究进展，实现了纤维素酶制剂的工业生产，并在应用上取得了一定成绩。20 世纪70 年代，有些学者就提出纤维素酶的作用必须由多种酶协同作用才能表现出很强的活性，还提取了这种协同作用的3种酶。1985年，采用腐殖根霉发酵的方法，制得了世界上第1 个洗涤剂用的纤维素酶。1987 年，又推出了一种细菌纤维素酶，并成功地用于At2tack洗衣粉。1997年，韩国和美国学者研究了里氏木霉及5株温度突变菌株所产生纤维素酶的最佳条件，指出由于多种酶的协同作用，葡萄糖的产率比单独的纤维素酶作用的总和高1.5-8倍。1998 年，用从里氏木霉中提取的纤维二糖水解酶和内葡聚糖纤维素酶对微晶纤维素的水解试验表明，在40℃时复合酶作用所产生的可溶性糖比2种酶单独作用时产糖的总和多27％-45％。

1.5.2 国内主要研究概况

我国纤维素酶的研究开始于20世纪60年代初，并且选育出一批纤维素酶菌种。1968年，北京选育出一批纤维素酶菌种。1970年，中国科学院上海植物生理研究所等单位利用诱变方法获得了产酶能力较高的变异株，并进行了生产试验。1975年，广东省微生物研究所分离筛选出纤维素酶产生菌株———长梗木霉；20世纪90年代，中国科学院微生物研究所获得一株突变株康宁木霉。20 世纪90 年代中期，我国上海市就生产出纤维素酶。20世纪初，黑龙江省海林市万力达集团公司首条年产纤维素酶生产线投产，我国成为继美国、日本、丹麦之后第4能生产纤维素酶的国家。

1.6 纤维素酶的基因克隆

利用纤维素酶实现纤维素的转化与利用对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污

染等问题具有非常重要的意义。纤维素酶基因克隆的研究始于20世纪70年代末，自1982年Whittle等人首次报道Cellulomonas fimi的纤维素酶基因被克隆以来，人们不断从细菌、真菌、线虫中发现并分离纤维素酶系。现已分离的纤维素酶基因（主要内切纤维素酶及外切纤维素酶、β-葡萄糖苷酶）在糖苷水解酶家族（90多个家族）中占据了13个家族（第3、5、6、7、8、9、10、12、44、45、48、61、74家族），其中真菌产生的纤维素酶主要分布在第3、5、6、7、12、45、61、74家族。真菌内切纤维素酶主要在第5、12家族，外切纤维素酶主要在第6、7家族(李亚玲，2007)，真菌内切纤维素酶45家族的研究较少。表1-3为植物病原真菌中已克隆的部分纤维素酶基因及其基因登录号。

目前纤维素酶基因克隆主要集中在酸性纤维素酶方面，起始于20 世纪70 年代，发展非常迅速，也有一些研究者对产纤维素酶细菌进行研究（蔡勇等，2006）。但产酸性纤维素酶的主要是真菌，由于丝状真菌木霉属能产生大量的胞外纤维素酶，且酶系较完全，酶活力较高，并且对结晶纤维素有较好的酶解活性。近十几年来对真菌木霉属纤维素酶基因做了大量研究，其中对里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶基因研究比较透彻，克隆了CBHⅠ、CBHⅡ、CBHⅢ、CBHⅣ、EGⅠ、EGⅢ、EGⅤ、BG 共8 个基因，都在E.coli 中得到了表达，并测定了这些基因的核苷酸序列（徐天鹏，2007），但是对Rhizoctonia solani AG-1-IA 中纤维素酶基因的研究还比较少。

参考文献：

1.李燕红，赵辅昆．纤维素酶的研究进展[J].生命科学，2005， 17(5)：392—397

2.侯爱华，吴斌辉．细菌纤维小体的结构和功能[J]．纤维素科学与技术，2002，10(1)：

50—57．

3.孙毅，金湘，毛培宏．细菌纤维素酶的结构和功能及菌种改良研究[J]．生物技术，

2005．15(3)：87．89．

4.高培基，曲音波，汪天虹．微生物降解纤维素机制的分子生物学研究进展．纤维素科学

与技术，1995，3(2)：16—19．

5.王春卉，汪天虹，高培基．纤维素酶分子的纤维素吸附区的研究进展[J]．纤维素科学

与技术，1997，5(4)：1．10．

6.阎伯旭，曲音波，高培基，等．真菌和细菌纤维素酶的差异及内，外切酶的底物专一性

[J]．生命科学，1999，11(增)：6I．64．

7.张鸿雁，陈锡时．微生物纤维素酶分子生物学研究进展．生物技术，2003，13(3)：41.42．

8.吴显荣，穆小民．纤维素酶分子生物学研究进展及趋向．生物工程进展，1994，14(4)：

25.27．

9.吕东海，周岩民，李如治．饲用纤维素酶应用研究．中国饲料，2004，10：25．27．

10.吴创之，马隆挖．生物质能现代化利用技术[M]．北京：化学工舭出版社，2004．111．147．

11.阎伯旭，高培纂，纤维素酶分子结构国功能研究进展．生命科学，1995，7(5)：22，25．

12.高沽，汤烈贵．纤维素科学[M]．北京：科学出版社，1999．

13.汪维云，朱金肇．纤维素瓣学及纤维素酶瓣磷究进展．1998，19(3)：20．28．

14.魏述众，土编．嫩物化学[M]，北京：中阑轻上业出版社，2002．26．27．

15.郭德宪，曹健，鲍字茹．利用生物技术降解纤维素的研究进展们．郑州工程学院学报，

2001，(3)：84—88．

16.刘春芬，贺稚非，蒲海燕，等．纤维素酶及应用现状[J]．粮食与油脂。2004，(1)：15

—18．