小鼠早期胚胎移植技术的研究
应用小鼠早期胚胎活性因子诱导小鼠成纤维细胞再程序化为多能干细胞的实验研究
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・
实 验 研 究 ・
应 用小 鼠 早 期 胚 胎 活 性 因 子 诱 导 小 鼠 成 纤 维 细 胞 再 程 序 化 为 多能 干 细胞 的 实验 研 究
刘 婷， 王立斌 ， 朱永 朝 ， 金毅然 ， 李玉奎 ， 魏 军 （ 宁夏医科大学总医院宁夏人类干细胞研究所 ， 宁夏 银川 ７ ５ ０ ０ ０ ４ ）
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胚胎移植
2.4 胚胎的采集
采集时间的确定：发育时程 采集方法： 手术法采集：适应范围广 非手术法采集：牛、马
2.5 胚胎的检查和鉴定
A级：发育阶段与胚龄一致；胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球 大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无游离的细胞和液泡 B级：发育阶段与胚龄基本一致；胚胎形态完整，轮廓清晰，分裂球大小 基本一致，可见到少量游离的细胞和液泡 C级：轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多 D级：胚胎细胞无组织结构，碎片占主要成分；
2.胚胎移植技术程序及操作
供体和受体的选择 超数排卵处理 供体母畜的配种 胚胎的收集 胚胎的检查 胚胎的保存与培养 胚胎的移植 供体和受体的术后观察
胚胎移植程序示意图
同 期 发 情
×
胚胎收集 质量检查 ET
受体母牛
体外受精-胚胎移植（IVF-ET）技术流程图
2.1供体和受体的选择
早期胚胎的游离状态 子宫对早期胚胎的免疫耐受性 胚胎遗传物质的稳定性
Morula
solid ball of cells
Zygote Blastocyst
with blastocoele cavity
1.3.2 胚胎移植的基本原则
1.胚胎移植前后所处的环境的同一性
（1）供体和受体在分类学上属于同一物种 （2）胚胎发育阶段与受体发情时间上的一致性 （3）胚胎发育阶段与受体生殖道解剖位置的一 致性
12
13
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抗 血 清 配 种
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配 种
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18 检 查 黄 体
19
20
冲胚
12:00 PMSG 2500IU
高中生物课件3.2 体外受精和早期胚胎培养
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5.胚胎移植的时间是( )。 A.在桑椹胚阶段 B.在囊胚阶段 C.在 8~16 个细胞阶段 D.不同动物进行的时间不同 解析:不同动物胚胎移植的时间不同,例如,牛、羊一般要培养到桑椹胚 阶段或囊胚阶段才进行移植,小鼠和家兔等实验动物可在更早的阶段 移植,人的体外受精胚胎,即试管胚胎,可在 8~16 个细胞阶段移植。 答案:D
(3)体外早期胚胎的培养 元素、糖、促生长因子、血浆 (4)桑椹胚阶段前
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(1)不同动物其胚胎移植的时间不同: ①牛、羊一般要培养到桑椹胚阶段或囊胚阶段。 ②小鼠、家兔在桑椹胚阶段前。 ③人的试管胚胎可在 8~16 个细胞阶段移植。 几乎所有的动物都不能到原肠胚阶段移植,因为此时分化程度高, 移植成功率很低。 (2)动物胚胎培养液与动物细胞培养液成分的比较
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课堂合作探究
问题导学
一、体外受精技术
活动与探究 1.哺乳动物的体外受精技术有哪些主要步骤? 提示:体外受精技术主要包括卵母细胞的采集和培养、精子的采集 和获能、受精等几个主要步骤。
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2.卵母细胞采集的方法有哪些?各适用于哪些动物?采集的卵母细 胞能直接与获能的精子进行受精吗? 提示:方法一:先用促性腺激素处理,使其超数排卵;然后在适当的时 间从输卵管冲卵;获得的卵子可直接与获能的精子在体外受精。适用于 实验动物如小鼠、兔和家畜猪、羊等。 方法二:从已屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞。 方法三:借助超声波探测仪、 内窥镜或腹腔镜等工具,直接从活体动 物的卵巢中吸取卵母细胞。这种方法称活体采卵。 方法二和方法三适用于大家畜或大型动物。采集的卵母细胞需在 体外培养成熟后才能与获能的精子受精。
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4.受精:获能的精子和培养成熟的卵子,一般情况下都可以在获能 溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。
胚胎移植技术
考向一 以非选择题的形式考查胚胎移植的过程 1.下图为培育“转基因试管牛”的基本过程示意图,请据图回答下列问 题:
(1)A过程一般用 激素处理供体母牛,使其超数排卵,此前需用激 处理。 处理,采集的卵母 素对供体母牛和代孕母牛进行 (2)采集到的精子在进行体外受精前必须进行 细胞也需要培养至 期才能受精。
成熟后,才能与获能精子受精。
(5)体外受精:获能的精子和培养成熟的卵子可以在专用的
受精溶液
中完成受精过程。
2.胚胎移植技术 (1)概念:胚胎移植技术是指将良种母畜配种后,从其生殖道取出
早期胚胎
或通过体外受精及其他方式(如转基因、核移植)得到的胚胎
,再移植到 同种 的、生理状态相同的其他雌性动物体内,使它们进一 步发育为新个体的技术。 (2)应用:提高优良品种家畜的
2.胚胎干细胞的来源:胚胎干细胞是一类未分化细胞,可从早期胚胎 的囊胚期分离获取或从胎儿的原始性腺中分离获取。 3.干细胞的种类:
类别 全能干细胞 来源或举例 胚胎干细胞(囊胚期之前的细胞及内 细胞团细胞) 特点 能发育成完整个体
多能干能,
但无发育成完整个体的能力
(2)该过程中两次检查:第一次对收集的胚胎进行检查;第二次对受
体母牛是否妊娠进行检查。 (3)产下的犊牛性状取决于所用公牛和供体牛,性别取决于公牛提 供何种类型的精子,二者与受体牛没有关系,受体牛提供营养和胚 胎发育的场所。
2.胚胎移植和胚胎分割移植的比较
胚胎移植 概念 将胚胎移植到同种的、生理状态相同 的其他雌性动物的体内,使之继续发 育为新个体的技术 移植前 的处理 生殖方式 用促性腺激素对供体和受体进行同期 发情处理;对供体进行超数排卵处理 通过核移植技术获得胚胎,属于无性 生殖;通过体、内外受精获得胚胎,则 属于有性生殖 操作对象 作用及 意义 早期胚胎 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力,大大缩短了供体本身的繁殖周期,提高了 繁殖率 胚胎分割移植 采用机械方法将早期胚胎切割成2等 份、4等份或8等份,经移植获得同卵 双胎或多胎的技术 对囊胚阶段的胚胎分割时,要将内细 胞团均等分割 分割后的胚胎具有相同的遗传物质, 可看作是无性生殖
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
小鼠体外受精代孕鼠体重和饲料对其生产的影响
体外受精（In vitro fertilization ，IVF ）和胚胎移植是一项重要的辅助生殖技术。
生物净化是利用受精卵透明带的屏障作用，结合体外受精和胚胎移植技术，可以去除目的品系小鼠所感染的细菌、病毒、体内外寄生虫等病原体，将小鼠微生物等级提升至SPF 级及以上，并有效减少或阻止病原体通过一个活体小鼠传染给饲养在屏障设施内的其他小鼠［1，2］。
因此，科研人员坚持不懈研究可以提高体外受精率、胚胎发育率以及高产仔率的方法。
洪胜辉等［3］研究发现在小鼠体外受精液（HTF ）中添加GSH 1mmol/L 时，体外受精效果最好。
张景锋等［4］研究发现带颗粒的卵母细胞和不带颗粒的卵母细胞的最佳精卵孵育时间不同。
张长勇等［5］研究发现妊娠期母鼠添加营养补充剂能够增加仔鼠的体质量，利于仔鼠的生长发育。
也有研究表明母鼠年龄也会影响其妊娠结果和仔鼠行为学［6］。
但是对于胚胎移植时，代孕母鼠自身体重和营养状态对后续妊娠率和产仔率的影响却少有研究。
本研究通过比较在移植相同数量同等质量胚胎的情况下，不同体重范围代孕母鼠的妊娠率、产仔率的差异来探寻最佳状态的代孕母鼠；并比较移植后给孕鼠喂食不同饲料对其产崽造成的影响，以期为优化小鼠生物净化和扩繁提供理论依据。
1材料与方法1.1试验动物本研究所使用试验动物为6~10周SPF 级ICR雌性小鼠，体重分为22~27g 、28~33g 、34~39g 三组。
3~4周C57BL/6J 雌性小鼠和三月龄C57BL/6J 雄性小鼠。
以上小鼠均购于上海集萃药康生物有限公司。
动物饲养在华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物中心SPF 级屏障环境中，小鼠生长环境维持在温度23~26℃，湿度40%~70%，自动光控（白昼黑夜各12h ），小鼠自由饮食饮水。
小鼠在到达该中心后均喂养繁殖饲料，代孕ICR 母鼠在接受移植胚胎手术之后再进行分组饲养，一组进行繁殖饲料喂养，一组进行维持饲料喂养。
小鼠的胚胎移植过程及2-细胞的冲取与培养
小鼠的胚胎移植过程及2-细胞的冲取与培养
房俊芳;钟秀会
【期刊名称】《河北畜牧兽医》
【年(卷),期】2003(019)002
【总页数】4页(P26-29)
【作者】房俊芳;钟秀会
【作者单位】河北农业大学动物科技学院，保定071001
【正文语种】中文
【中图分类】S865.133
【相关文献】
1.邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯对体外培养小鼠附睾上皮细胞的影响 [J], 张超;张德迎;魏光辉;刘官信;张晓萍
2.中药成分小檗碱对小鼠2-细胞胚胎体外培养及移植效果的研究 [J], 高建明;傅文栋;陈武;穆祥;索占伟
3.短期培养对玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎低渗抵抗力的修复作用 [J], 崔成;郭希萍;刘长松
4.2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠小胶质细胞活化及氧化应激的影响 [J], 林福虹;李炳尧;赵伟丽;王洪权;郑浏璞;王沛;郑荣远
5.邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯对原代培养小鼠胚胎睾丸Leydig细胞功能影响研究[J], 宋晓峰;魏光辉;邓永继;陈璇;刘星;张德迎
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同源重组敲除基因步骤
同源重组敲除基因步骤第一步：设计构建同源重组敲除基因的构建体1.选择目标基因：确定要敲除的目标基因，通常选择对细胞或个体生存具有重要作用的基因。
2.设计修饰子：通过设计修饰子使目标基因发生敲除。
常用的修饰子包括启动子，转录终止子，脱氧核苷酸连接位点和选择标记等。
3.构建构建体的载体：选择合适的载体，将修饰子和选择标记序列连接在一起，构建构建体的载体，通常为质粒或病毒载体。
第二步：构建构建体的DNA片段1.文库筛选：根据目标基因的序列，选择合适的文库进行筛选，以获取包含目标基因首尾序列的克隆。
2.PCR扩增：使用目标基因的首尾序列为引物，进行PCR扩增，得到目标基因的DNA片段。
3.克隆目标基因：将PCR扩增的目标基因的DNA片段连接到构建体的载体上。
第三步：构建转基因动物胚胎干细胞库1.培养胚胎干细胞：从小鼠或其他动物的胚胎中分离胚胎干细胞，并在适宜培养基中进行培养。
2.转染构建体：使用适当的转染技术将构建体转染到胚胎干细胞中。
3.筛选转染细胞：通过筛选选择已经内含构建体的胚胎干细胞进行下一步的实验操作。
第四步：构建敲除基因小鼠模型1.筛选胚胎干细胞：将筛选出的含有构建体的胚胎干细胞注入到小鼠的早期胚胎中。
2.基因敲除小鼠的获取：将经过注射的早期小鼠胚胎移植到代孕母鼠的子宫中，等待小鼠的出生。
出生后通过PCR检测小鼠的基因是否被敲除。
第五步：分析敲除基因小鼠1.分离小鼠基因组DNA：从小鼠的组织或细胞中分离基因组DNA。
2. 使用PCR或Southern blotting等方法检测是否敲除基因：利用PCR或Southern blotting等分子生物学方法检测小鼠组织或细胞中目标基因是否被敲除。
3.表型分析：通过对敲除基因小鼠进行行为学、生理学、病理学或其他实验方法的分析，评估目标基因对小鼠表型的影响。
以上是同源重组敲除基因的主要步骤。
通过这些步骤可以对目标基因进行敲除，进而研究其功能以及生成相应的基因敲除动物模型，从而更深入地了解基因的生物学功能与作用机制。
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遗传ＨＥＲＥＤＩＴＡＳ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） ２（５）： ４２－４３ １９８０
小鼠早期胚胎移植技术的研究
王培生杨秀琴荣瑞章
（中国科学院遗传研究所，北京）
哺乳动物胚胎移植技术是实验胚胎学、遗传学、发育生物学研究中的一项重要技术。在卵母细胞的体外培养、卵的体外受精及对早期胚胎进行显微手术等研究中，往往是通过观察卵在体外培养中的卵裂情况来鉴定实验效果。但是更理想的方法就是将有发育能力的胚胎移入受体子宫或输卵管内，以观察胚胎能否继续发育直至胎儿出生。为此，我们对小鼠早期胚胎进行了外科、非外科手术移植的研究。集桑堪胚和胚泡。将收集到表面皿内的胚胎放
在解剖镜下检查，选择形态正常的胚胎给受体
移植，由受体产仔情况衡量移植效果。
选择的受体是假孕２天的雌鼠。移植前腹
腔注射１多戊巴比妥钠０．２－０．２５毫升，５分钟
之后受体便处于完全昏迷状态，麻醉可持续１
小时以上。
材料和方法
移植的胚胎是用黑色Ｃ５７／ＢＬ，棕色Ｌ６１５，
野灰色ＣＨＢＥ及Ｃ５７／ＢＬ／ＬＣＲ雄鼠分别与昆
白品系雌鼠杂交所得的杂种胚胎。外科手术移
植９１个胚胎，非外科手术移植１４４个胚胎。受
体均为昆白品系的处女鼠，外科手术受体１５
只，非外科手术受体２３只。
在供体母鼠接受交配后的第３天，用２毫
升ＴＣＭ－１９９液分别冲洗两侧子宫角（图１），采
图２小鼠胚胎外科手术移植示意图
１．外径２毫米医用聚乙烯管；２．微管：３。子宫角；
４．斜视勾；５．微管放大示意图。
图１子宫冲胚胎示意图
ｌ．吸有冲卵液注射器；２．卵奥；３．子宫角：
４．冲卵管：弓．表面皿。
我们采用Ｍａｒｓｋ和Ｌａｒｓｓｏｎ［ｓ」研制的移植
器移植。移植器中的注射器及聚乙烯管内充满
液体石蜡，聚乙烯管的前端连接吸胚胎用的聚
乙烯微管。微管外径０．９毫米，管内由２个小
气泡将液体分为三部分，前端液体防止胚胎丢
失，末端液体保证胚胎进入子宫。手术移植时
为了使微管容易穿透子宫壁，微管顶部需成斜
面（图２）。非手术移植时为了不损伤子宫颈口、
。４２
Ｗａｎｇ Ｐｅｉｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．： Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ
Ｅｍｂｒｙｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｅａｒｉｙ Ｓｔａｇｅ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ
图３小鼠胚胎非外科手术移植示意图
１．外径２毫米医用聚乙烯管；２微管；３，开膛器；
４．子宫颈口；，．子宫角；６．微管放大示意图。
微管顶部需成平面（图３）０
外科手术移植时，在鼠后腹部作一个１厘
米的切口，用斜视勾牵引出两侧子宫角，用４号
针头在子宫角壁上刺一小孔，将微管经小孔插
人，然后旋转微量推进器，把５一１０个胚胎分别
注入两侧子宫角（图２），
非外科手术移植时，用镊子夹住阴蒂的前
部将鼠提起，用直径４毫米长１０毫米的医用聚
乙烯管做开朦器。将吸有胚胎的微管插人阴道，
向阴道底部细心地寻找到子宫颈口，然后将微
管缓慢地推进，当微管插人大约１５毫米时，旋
转微量推进器，将微管内的５－１０个胚胎注入
子宫角（图３）ａ结果如表１所示，９１个杂种胚胎（桑堪胚或胚抱）经外科手术移人１５只昆白品系雌鼠子宫内，１１只受体产幼鼠５４只，受体产仔率为７３多，胚胎成活率为５９．３多。１４４个杂种胚胎（桑堪胚或胚泡）经非外科手术移人２３只昆白品系雌鼠子宫内，１２只受体产幼鼠３６只，受体产仔率为５２多，胚胎成活率为２５外。以上幼鼠均为有色的杂种鼠。表１小鼠胚胎外科、非外科手术移植结果翻９ ｝｝ ２３ １４１２圈５９３２５．０讨论１． ＬｉｔｔｌｅＥ１３１９３５年用外科手术方法首先取得小鼠胚胎移植成功，以后Ｆｅｋｅｔ。和Ｌｉｔｔｌｅ（１９４２），Ｍｃｌａｒｅｎ和Ｍｉｃｈｉｅ＂＇２ｌ等１９５６年和１９５９年相继进行了这方面的试验。在这一时期，Ｇａｔｅｓ ［３１取得较好的结果：１６０个胚泡被移入４０只受体中，受体受胎率为５０多，胚胎成活率为３８．７５多。在上述的研究中，由于移植胚胎一直采用手或注射器进行操作，因此失误机会较多。我们采用移植器移植就较为可靠，不致丢失胚胎。２． Ｂｅａｔ甲４，最先采用非外科手术方法，将”个桑棋胚或胚泡移入３０只受体，获得５只幼鼠，胚胎成活率为１０多。以后Ｍａｒｓｋ和Ｌａｒｓｓｏｎ［５１采用机械控制的方法，将５２１个Ａ／Ｊ３二品系小鼠的胚泡移人７９只ＣＢＡ品系雌鼠中，在移植的第１４天剖检，收集到活胚胎２６２个，受胎率为，０ ０％ｏ。我们在采用上述方法移植操作中认为须注意以下几点：（１）必须选择直径适宜的微管，过细容易刺伤子宫内膜或穿透子宫角，过粗则损伤子宫颈口。（２）当微管穿过子宫颈口后，受刺激的子宫颈口会肿胀，并使子宫收缩产生排液现象。此时移植的胚胎有可能被排出体外而造成移植失败，在麻醉持续的时间内，胚胎
在子宫内可沉积下来，冲卵液将被子宫逐渐吸
收；（３）移植结束拔出微管时，微管中需保留一
部分液体，避免多量气体进入子宫。
参考文献
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４３