体外放射分析技术
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体外分析技术
Ag
25
50
100
200
400
800
*Ag
Ab
分离B、F
B1%
B2%
B3%
B4%
B5%
B6%
1
2
3
4
5
6
B%
？
B%
F%
B/F
Calibration Curve
优缺点比较
1、放射免疫分析技术
放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）——以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。 免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）——以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。
不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上 在肿瘤细胞株中CA199,CA50和CA242共同表达于 MUC-1和诞腺蛋白中。（Baeckstrom et al, 1992）
肿瘤的发展及诊断期
肿瘤标志物在全球的应用情况
肿瘤标志物的分类（化学特性）
癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物 酶类标志物 激素类标志物 癌基因 其他
肿瘤与肿瘤标记物
相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物 相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上 CA19-9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定: MUC-1,MUC-3。（Baeckstrom et al, 1992和1995） 涎腺蛋白。（Baeckstrom et al,1995） 颌下腺粘蛋白 支气管肺泡粘蛋白
1、放射免疫分析技术
优点：超微量分析技术，具有很高的精密度、灵敏度和准确度 缺点：反应条件要求一般，但该技术所用试剂具有放射性，对人体有一定的危害，实验人员应加强防护。同时试剂存在半衰期，试剂必须在半衰期内用完，否则试剂会作废，这需要科学地做好试剂计划。另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素，使灵敏度受到限制。
第五章 体外分析技术
2
第一节 放射免疫分析法 radioimmunoassay， RIA
1959年，美国的两位科学家Berson和 Yalow首次将示踪技术的高度灵敏性和免 疫学抗原-抗体结合的高度特异性结合起 来，创立了放射免疫分析技术，开创了 生物活性物质微量测定技术的新时代。 RIA 的特点：灵敏度高、特异性强、准 确度高、稳定性好。经不断改进，现在 广泛应用于临床检测和科学研究的很多 领域。
15
3）高滴度Fra bibliotek滴度 是抗体实际应用时的稀释倍数 抗体的滴度越高，其中的干扰物质 的影响就越小。 滴度的测定：以一定浓度的*Ag与稀释 度不同的抗体进行反应，当*Ag的结合 率为50%时对应的抗体的稀释度即为 该抗体的滴度。这时的抗体浓度就是 实际使用时的浓度。
16
（二）分离技术
22
4、特异性（specificity）是指该反应体 系不受干扰物质物质影响的程度。常用 的指标是交叉反应率。 5、稳定性（stability）是指测定试剂在 合理保存和正确使用条件下，在规定的 有效期内，保持其全部原有性能不变的 能力。常用指标有：零标准管结合率 （B0%≥20%）、非特异性结合率 （NSB%≤5%）、标准曲线上的质控指 标等。 6、有效性（effectivity）主要指临床诊 断符合率及临床使用评价，检测结果在 正常和异常之间有良好的区分，得出可 信的结论。 23
21
1、精密度（precision）是指在相同条件 下对某一样品多次检测所得结果的符合 程度，即复管的重复性，它是最重要的 质量参数。 常用精密度图来评价实验室 内部的精密度水平。 2、准确度（accuracy）是指测定值与真 值的接近程度，用回收率来评价，回收 率是反应测定值偏差的质控指标。 3、灵敏度（sensitivity）是指检测能与 零剂量区分的最小检测量。 累计10次测定结果，计算出零标准 管的结合率为X—2SD时对应的剂量值， 即为灵敏度。
第一节 放射免疫分析法 radioimmunoassay， RIA
1959年，美国的两位科学家Berson和 Yalow首次将示踪技术的高度灵敏性和免 疫学抗原-抗体结合的高度特异性结合起 来，创立了放射免疫分析技术，开创了 生物活性物质微量测定技术的新时代。 RIA 的特点：灵敏度高、特异性强、准 确度高、稳定性好。经不断改进，现在 广泛应用于临床检测和科学研究的很多 领域。
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3）高滴度Fra bibliotek滴度 是抗体实际应用时的稀释倍数 抗体的滴度越高，其中的干扰物质 的影响就越小。 滴度的测定：以一定浓度的*Ag与稀释 度不同的抗体进行反应，当*Ag的结合 率为50%时对应的抗体的稀释度即为 该抗体的滴度。这时的抗体浓度就是 实际使用时的浓度。
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（二）分离技术
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4、特异性（specificity）是指该反应体 系不受干扰物质物质影响的程度。常用 的指标是交叉反应率。 5、稳定性（stability）是指测定试剂在 合理保存和正确使用条件下，在规定的 有效期内，保持其全部原有性能不变的 能力。常用指标有：零标准管结合率 （B0%≥20%）、非特异性结合率 （NSB%≤5%）、标准曲线上的质控指 标等。 6、有效性（effectivity）主要指临床诊 断符合率及临床使用评价，检测结果在 正常和异常之间有良好的区分，得出可 信的结论。 23
21
1、精密度（precision）是指在相同条件 下对某一样品多次检测所得结果的符合 程度，即复管的重复性，它是最重要的 质量参数。 常用精密度图来评价实验室 内部的精密度水平。 2、准确度（accuracy）是指测定值与真 值的接近程度，用回收率来评价，回收 率是反应测定值偏差的质控指标。 3、灵敏度（sensitivity）是指检测能与 零剂量区分的最小检测量。 累计10次测定结果，计算出零标准 管的结合率为X—2SD时对应的剂量值， 即为灵敏度。
核医学体外放射分析技术课件
有效地排除非特异性物质对结合反应的干 扰。
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统
第五章体外分析技术
（3）分离方法主要是使大分子和小分子物质分离。
双抗体法(测量B)： 用抗原免疫动物而产生的抗体称为第一抗体，用第一抗 体再免疫另一种动物所产生的抗体称为第二抗体。
当RIA反应完成后，于反应液中加入第二抗体，第二抗 体则与含有第一抗体的免疫复合物B相结合形成第二抗体复 合物，其分子量比第一抗体复合物大，可用离心方法分离 出来，称为双抗体法（double antibody method）。
(一)实验室内质量控制： 是一个实验室内部实验方法的质量控制，以便在一个人 的同一批或不同批实验中，不同操作者和不同方法之间有 可比性。 零标准管结合率（B0%）：即最大结合率，指不加非标记抗 原时，标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30%～50%，该 指标主要用来反映标记物与抗体的质量是否稳定。 非特异性结合率（NSB%）：指不加抗体时标记抗原与非特 异物质的结合率，一般要求＜5%～10%。 最低浓度管与最高浓度管的结合率之差：＞30%。
标准曲线直线回归的参数：包括截距a、斜率b和相关系数r， 要求a、b值稳定，r ＞ 0.99。 ED25、ED50与 ED75：指标准曲线的结合率在25%、50%和75%时 对应的抗原浓度值，它反映标准曲线的稳定性，有助于批间 结果的比较。 质控图：连续测定10批以上高、中、低三种已知浓度的质控 血清的均数±标准差（x±s），画出均数线与两个标准差的 范围，将以后每次实验测定的高、中、低值标在图上，即为 质控图。 WHO要求在一次实验中有下列情况之一者，其结果应舍弃： ① 三种QCS中有一个测定值＞3s； ② 三种QCS中在同一方向上有两种＞2s；
2．反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争 性的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比RIA快。
3．灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的 10～100倍。
第8章 体外放射分析技术新版
抗体包被分离法
特点：试管包被第二抗体 原理：SP－Ab2－Ab1－*Ag
Ab2
优点：固相包被具有简便、快速、稳定、不需离心等， 有逐渐取代液相法的趋势。
固相吸附分离法
吸附分离剂是固相颗粒，它可以从反应液中吸附游离抗原。活性 炭是常用的吸附剂，多用于小分子游离抗原和抗原－抗体复合物的分 离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合 物，这样在活性炭的表面形成一定大小的孔洞，在反应液中加入这种 特殊颗粒时，小分子的游离抗原就会被活性炭吸附，从而达到分离B 与F的目的。
逐个代入上式，即可求得各样品的含量 X。 优点：操作简单，用计算器也可拟合。
缺点：①由于Log 0无解，拟合时丢掉0剂量点，降低了灵敏度②
如有突出值，整条拟合线会偏离；③在顺序加样法中不是 直线不可用。
2. 四参数Logistic模型 本法从Logit-Log法演化而来，其函数式如下： Y=（a-d）/「1+（X/C）b」+d 式中Y是标记抗原在各实验点的结合率（包括NSB），X 是各点的剂量。a、b、c、d是四个参数。a代表0剂量时
1、系统误差（systematic error）这种误差常表现为检测结果呈 倾向性的偏高或偏低，是一些可以确定的因素导致的。（1）方法 误差，如标准品稀释体积不正确；抗体过浓或过稀，分离效果不 好；不适当的曲线拟合模型等。（2）仪器和试剂误差，如仪器状
态不佳；量器不准；试剂不纯等。（3）操作误差，如不正确的操
作习惯、错加样品等。系统误差是可以通过努力消除的。 2、随机误差（random error）这种误差是由难以确定且无法控
制的原因（偶然因素）引起，误差的出现是随机的，与真值的偏
实验核医学-体外分析技术
实验核医学
Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人：
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术 二、非放射免疫分析技术 三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析（RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA)
一、基本原理：
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。 在体外，以放射性核素标记抗原和非标记抗原，同时 与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤：
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲 线，查找待测物 浓度
b值稳定，r＞0.99。
4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50％及75％时对应的抗原浓度值，
它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
5．反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标，RER应＜0.04。
6．质控图
WHO要求在一次实验中，有下列情 况之一者，其结果应予舍弃：
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的 可靠性。
（一）、质量控制
1．最高结合率(B0％) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30～50％。
2．非特异性结合率(NSB％) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。
Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人：
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术 二、非放射免疫分析技术 三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析（RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA)
一、基本原理：
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。 在体外，以放射性核素标记抗原和非标记抗原，同时 与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤：
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲 线，查找待测物 浓度
b值稳定，r＞0.99。
4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50％及75％时对应的抗原浓度值，
它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
5．反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标，RER应＜0.04。
6．质控图
WHO要求在一次实验中，有下列情 况之一者，其结果应予舍弃：
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的 可靠性。
（一）、质量控制
1．最高结合率(B0％) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30～50％。
2．非特异性结合率(NSB％) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。
体外放射分析【40页】
者为竞争性，后者为饱和分析。
以酶与底物间的酶促反 应为基础的分析方法
主要有两类方法
放射酶分析法：以酶为结合剂，测量配 体的含量；
酶的放射化学测定：以放射性标记的底 物为配体，测定酶的活性。
竞争性蛋白质结合分析
基本技术
标准品
质的要求 与待测配体属同类物质 与待测配体有同等的活性和亲和能力 纯度高，不含其它杂质、稳定性好
半对数坐标系制图法
制图方法简便，但易导致主观误差。
B/F (%)
Log X
质量控制
Bo％、NSB％、ED50、RER、CV、 精密度图、质控样品等。
主要方法
放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析、 受体放射分析、蛋白质竞争结合分析等。
其中以放射免疫分析和免疫放射分的测量，而且可用于具有生物活性的小 分子物质的检测，如血药浓度测定等。
基本原理
竞争性结合分析 放射免疫分析是体外放射分析最有代表性的一
反应原理
Ligand + Receptor + L*
L.R L*.R
受体放射分析
受体放射分析(receptor radioassay) 是以分析受体的数量和性质为目的 一定量受体只能与一定量的标记配体（受体激
动剂和阻断剂）结合，受体具有一定的饱和度 根据复合物的最大放射性及所用标记配体的比
已知Ag浓度
非竞争性分析
免疫放射分析是典型的非竞争性体外放 射分析。它应用标记抗体作为示踪剂， 在反应系统中加入过量的标记抗体、待 测物（或标准品）进行全量反应，未结 合的标记抗体通过加入免疫吸附剂而去 掉，因此，溶液中放射性与待测物的浓 度呈正相关。
基本类型
以抗原抗体间的免疫反应为基础的分析技术
以酶与底物间的酶促反 应为基础的分析方法
主要有两类方法
放射酶分析法：以酶为结合剂，测量配 体的含量；
酶的放射化学测定：以放射性标记的底 物为配体，测定酶的活性。
竞争性蛋白质结合分析
基本技术
标准品
质的要求 与待测配体属同类物质 与待测配体有同等的活性和亲和能力 纯度高，不含其它杂质、稳定性好
半对数坐标系制图法
制图方法简便，但易导致主观误差。
B/F (%)
Log X
质量控制
Bo％、NSB％、ED50、RER、CV、 精密度图、质控样品等。
主要方法
放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析、 受体放射分析、蛋白质竞争结合分析等。
其中以放射免疫分析和免疫放射分的测量，而且可用于具有生物活性的小 分子物质的检测，如血药浓度测定等。
基本原理
竞争性结合分析 放射免疫分析是体外放射分析最有代表性的一
反应原理
Ligand + Receptor + L*
L.R L*.R
受体放射分析
受体放射分析(receptor radioassay) 是以分析受体的数量和性质为目的 一定量受体只能与一定量的标记配体（受体激
动剂和阻断剂）结合，受体具有一定的饱和度 根据复合物的最大放射性及所用标记配体的比
已知Ag浓度
非竞争性分析
免疫放射分析是典型的非竞争性体外放 射分析。它应用标记抗体作为示踪剂， 在反应系统中加入过量的标记抗体、待 测物（或标准品）进行全量反应，未结 合的标记抗体通过加入免疫吸附剂而去 掉，因此，溶液中放射性与待测物的浓 度呈正相关。
基本类型
以抗原抗体间的免疫反应为基础的分析技术
体外分析技术核医学
通过核医学技术可以检测和定位肿瘤，为早期诊断和治疗提供准确信息。
2
心脏疾病评估
核心医学可以评估心脏功能、血液供应情况以及冠状动脉梗塞的程度。
3
神经精神疾病研究
利用核医学技术，研究人类的脑部功能，了解神经精神疾病的病理生理机制。
未来展望
随着科技的不断进步，体外分析技术核医学将继续发展，并在疾病诊断、治疗和疗效评估方面发挥越来越重要 的作用。
PET显像技术
正电子发射计算机断层显像（PET）利用放射性同位素的正电子发射特性，提供高分辨率、高敏感度的全身代 谢和功能成像。
SPECT显像技术
单光子发射计算机断层显像（SPECT）使用放射性同位素的单光子发射特性，提供三维的功能和代谢成像，广 泛用于心脏和脑部疾病诊断。
临床应用实例
1
癌症筛查
结束语
体外分析技术核医学为医学研究和临床实践带来了革命性的进展，将为人类 健康的未来带来更多希望和机遇。
Байду номын сангаас
体外分析技术核医学
体外分析技术核医学是一门研究放射性同位素用于医学诊断和治疗的技术。 本次演讲将带您了解该领域的原理、技术和应用实例，并展望未来发展。
原理介绍
体外分析技术核医学利用放射性同位素的特性，通过探测其发出的放射线来 获取有关人体内部结构和功能的信息。
体外标记法
体外标记法是使用放射性同位素标记生物分子，如蛋白质和抗体，以便在体 内观察特定细胞、器官或病变的存在和活动。
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IRMA主要缺点： 需要二种McAb 抗体用量大
非放射标记的免疫分析法 化学发光分析 时间分辨荧光分析 酶免疫分析
电化学发光（ECL）： ECL是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫之 后的新一代标记免疫测定技术 ECL是一种在电极表面由电化学引发的化学反应，实际上 包括了电、化学发光两个过程，故是化学发光的一种发展， 电化学反应在电极表面周而复始的进行，光信号明显增强， 因而ECL与CL的差异在于： ECL是电启动发光反应，CL是通过化合物简单的混合启 动的发光反应。 ECL反应更易精确控制，更具灵活性。 ECL反应原理： 化学发光反应导致光的发射是来自钌（Ru）化合物的电的 激发，而不是化学的激发。
Ag-Ab + Ag
Ag
+
*
Ag
+
Ab
*
AgAb
+
AgAb
+
free Ag
*
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Ag*与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争性
与Ab结合，当Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*与Ag
之和大于Ab时，则Ag*-Ab复合物的形成受Ag含 量的制约，二者之间存在竟争抑制的函数关系， 即随着Ag浓度的增加，Ag*-Ab复合物就减少， 因为Ag*对Ab的结合被Ag竞争性抑制。根据这
三、质量控制(Quality Control):
目的：为了获得准确可靠的测定结果
室间：某一地区/全国性机构就一些分析项目 对各实验室所得结果进行统计比较 室内：实验室内部对每次分析结果的质量进 行检查和控制 误差： A. 随机误差(Random Error)： 放射性测量的统计误差
实验操作的实验误差 试剂配制等
第六章 体外放射分析技术
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
In vitro radioassay
山西医科大学第二临床医学院
体外分析发展史
Yalow
Berson
一、定义
以放射性核素或其他非放射性物 质标记的配体(Ligand)为示踪剂， 以配体和结合体的结合反应为基 础，在试管内进行的微量生物活 性物质的检测技术。
二、分类:
体外放射分析
操作简便：所需试剂少，测量及数据处理易于实 现自动化 主要缺点：
生物制剂，稳定性受多种因素影响，需有质量控 制措施（Quality Control)
灵敏度很难超过10-15g水平
非竞争性放射免疫分析
(免疫放射分析 IRMA)
一.基本原理： 放射核素标记在抗体上，与待测抗原结合后，用一 定手段将多余抗体除去，测定复合物的放射性，其 活度与待测抗原呈正相关
NSB主要影响低剂 量反应
RIA: + 非标记 抗原 IRMA: + 标记 抗原 + 抗体
或
抗原抗体 复合物
非标记 抗原
标记 抗原
抗体
抗原抗体 复合物
IRMA主要优点：
温育时间短： 37℃温育23小时即可
灵敏度高： 是RIA的10 100倍 测量范围宽：标准曲线工作范围宽,RIA 为2个 数量级，IRMA可达3个数量级 特异性强： 应用针对某一抗原决定簇的单抗,不 易发生交叉反应
二.时间分辨荧光免疫 （time-resolved fluorescence immunossay —TRFIA）
稀土族中的镧系元素（Eu、Tb、Sm、Dy等）以离子价态时， 受到紫外光或激光等激发后，会以荧光的形式发射光谱，其 激发光光谱的波长和发射荧光的强度因离子不同而有差异， 而且具有相当长的衰减时间，这样就为时间分辨荧光 (TRF) 所发射的信号采集和多标记的应用提供了条件。 TRFIA是一种以镧系元素 螯合物标记抗体或抗原， 利用时间分辨荧光光度 计测量法排除检品中非 特异性荧光干扰的测量 技术。 铕： （Eu—europium） 铽： （Tb—terbium） 钐： （Sm—samarium） 镝： （Dy—dysprosium）
质控
不可避免，呈高斯分
布，以精密度评价
B.系统误差(Systematic Error)：
由某一固定因素引起，仪器、试剂、
通过努力可以 消除
操作程序、试验方法等
主要优点：
灵敏度高：可达10-9―10-12 g(mol) 特异性强：抗原抗体结合具有很高的特异性
应用范围广：凡能制备相应抗体的生物活性物质， 只要含量不低于RIA探测极限，都可建立
标 准 曲 线
二、RIA的基本步骤：
实验由两部分组成：
1.标准曲线：用一系列浓度递增的标准品（oAg），在 严格相同的条件下同*Ag竞争与Ab结合反应，以oAg的 剂量为横坐标， *Ag.Ab结合率（B%）为纵坐标制得 刻度曲线（Calibration curve）； 2.样本测定：同等条件下，待测样本可获得一定的B%， 由此可从标准曲线上求得待测物（oAg）的含量。
几种免疫法检测血清中甲状腺素的精度： 免疫分析 方法
时间分辨荧光免疫法 增强酶发光免疫法 免疫放射法 酶联免疫法 放射免疫法
测量极限 （mIU/L）
0.008 0.08 0.02---0.023 0.1 0.7
一、RIA的基本原理
（一）竞争抑制结合反应： 放射免疫分析是在体外条件下，由足 量的非标记抗原（Ag）与定量的标记抗原 （*Ag）对限量的特异性抗体（Ab）的竞 争抑制结合反应。
分析原理
*Ag + Ab + Ag *Ag-Ab + *Ag
条件：
1. *Ag与Ag免疫 活性相同
2. *Ag与Ab恒量 3. *Ag与Ag总量 大于Ab有效结 合位点
Ag + *Ab
(过量）
Ag.*Ab + *Ab
(B) (F)
IRMA与RIA的主要区别： RIA 1. 竞争性结合分析 2. 三种主要反应试剂 IRMA 非竞争性结合分析 两种主要反应试剂
3. 标记抗原
4. 复合物放射活度与 待测抗原呈负相关
标记抗体
复合物放射活度与 待测抗原呈正相关
5. NSB主要影响高剂 量反应
一函数关系的标准曲线，可求出被测抗原的含
量
（二）剂量反应曲线：标准曲线
标记物与被测物之间的函数关系可以用剂 量反应曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列 标准抗原反应而绘制出来的，所以又叫标准曲 线。
标准抗原(标准品)是厂家在试剂盒中提供的已知剂量 的非标记抗原。
标准曲线的绘制方法
用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在 一定条件下同限量的特异性抗体进行反应； 在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和F； 分别测量B和F的放射性； 用反应变量（如B/F）作为纵坐标，反应剂量作为横 坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同 浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是 剂量反应曲线。
原理：
TRFIA的标记物由镧系元素螯合物与Ab或Ag组成。待测物 通过免疫反应形成的复合物上，标有镧系元素（ Eu3+），经 紫外线激发后会发出荧光。但连接在复合物上的Eu发射的荧光 很弱，需要将其游离出来再形成一个能发射强荧光的络合物。 因此在免疫反应结束后，需向体系中加入一种“荧光增强剂”， 大大增加信号，所以该技术有时也称为解离增强镧系荧光免疫 分析（DELFIA）。 所谓时间分辨是指Eu3+受激活后产生寿命较长的荧光，而 一般干扰荧光寿命较短，固可用仪器把测量时间定在每次激发 后的数百s之后才开始，干扰荧光已衰减到很低水平，所取 荧光信号是荧光衰减过程的中间一段。 螯合剂：异硫氰酸苯基-EDTA（ICB-EDTA）、对异硫氰酸苯 基-二乙基三氨基四乙酸（p-ICB-DTTA） 增强剂： -萘酰三氟丙酮（ - NTA）
放射性竞争
结合分析
放射免疫分析 (radioimmunoassay, RIA) 免疫放射分析 (immunoradiometric assay, IRMA)
体 外 分 析 技 术
放射性非竞
争结合分析
酶免疫分析(EIA)
体外非放射分析
化学发光免疫分析
(CLIA)
荧光免疫分析(FIA)
放射免疫分析
radioimmunoassay, RIA
非放射标记的免疫分析法 化学发光分析 时间分辨荧光分析 酶免疫分析
电化学发光（ECL）： ECL是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫之 后的新一代标记免疫测定技术 ECL是一种在电极表面由电化学引发的化学反应，实际上 包括了电、化学发光两个过程，故是化学发光的一种发展， 电化学反应在电极表面周而复始的进行，光信号明显增强， 因而ECL与CL的差异在于： ECL是电启动发光反应，CL是通过化合物简单的混合启 动的发光反应。 ECL反应更易精确控制，更具灵活性。 ECL反应原理： 化学发光反应导致光的发射是来自钌（Ru）化合物的电的 激发，而不是化学的激发。
Ag-Ab + Ag
Ag
+
*
Ag
+
Ab
*
AgAb
+
AgAb
+
free Ag
*
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Ag*与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争性
与Ab结合，当Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*与Ag
之和大于Ab时，则Ag*-Ab复合物的形成受Ag含 量的制约，二者之间存在竟争抑制的函数关系， 即随着Ag浓度的增加，Ag*-Ab复合物就减少， 因为Ag*对Ab的结合被Ag竞争性抑制。根据这
三、质量控制(Quality Control):
目的：为了获得准确可靠的测定结果
室间：某一地区/全国性机构就一些分析项目 对各实验室所得结果进行统计比较 室内：实验室内部对每次分析结果的质量进 行检查和控制 误差： A. 随机误差(Random Error)： 放射性测量的统计误差
实验操作的实验误差 试剂配制等
第六章 体外放射分析技术
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
In vitro radioassay
山西医科大学第二临床医学院
体外分析发展史
Yalow
Berson
一、定义
以放射性核素或其他非放射性物 质标记的配体(Ligand)为示踪剂， 以配体和结合体的结合反应为基 础，在试管内进行的微量生物活 性物质的检测技术。
二、分类:
体外放射分析
操作简便：所需试剂少，测量及数据处理易于实 现自动化 主要缺点：
生物制剂，稳定性受多种因素影响，需有质量控 制措施（Quality Control)
灵敏度很难超过10-15g水平
非竞争性放射免疫分析
(免疫放射分析 IRMA)
一.基本原理： 放射核素标记在抗体上，与待测抗原结合后，用一 定手段将多余抗体除去，测定复合物的放射性，其 活度与待测抗原呈正相关
NSB主要影响低剂 量反应
RIA: + 非标记 抗原 IRMA: + 标记 抗原 + 抗体
或
抗原抗体 复合物
非标记 抗原
标记 抗原
抗体
抗原抗体 复合物
IRMA主要优点：
温育时间短： 37℃温育23小时即可
灵敏度高： 是RIA的10 100倍 测量范围宽：标准曲线工作范围宽,RIA 为2个 数量级，IRMA可达3个数量级 特异性强： 应用针对某一抗原决定簇的单抗,不 易发生交叉反应
二.时间分辨荧光免疫 （time-resolved fluorescence immunossay —TRFIA）
稀土族中的镧系元素（Eu、Tb、Sm、Dy等）以离子价态时， 受到紫外光或激光等激发后，会以荧光的形式发射光谱，其 激发光光谱的波长和发射荧光的强度因离子不同而有差异， 而且具有相当长的衰减时间，这样就为时间分辨荧光 (TRF) 所发射的信号采集和多标记的应用提供了条件。 TRFIA是一种以镧系元素 螯合物标记抗体或抗原， 利用时间分辨荧光光度 计测量法排除检品中非 特异性荧光干扰的测量 技术。 铕： （Eu—europium） 铽： （Tb—terbium） 钐： （Sm—samarium） 镝： （Dy—dysprosium）
质控
不可避免，呈高斯分
布，以精密度评价
B.系统误差(Systematic Error)：
由某一固定因素引起，仪器、试剂、
通过努力可以 消除
操作程序、试验方法等
主要优点：
灵敏度高：可达10-9―10-12 g(mol) 特异性强：抗原抗体结合具有很高的特异性
应用范围广：凡能制备相应抗体的生物活性物质， 只要含量不低于RIA探测极限，都可建立
标 准 曲 线
二、RIA的基本步骤：
实验由两部分组成：
1.标准曲线：用一系列浓度递增的标准品（oAg），在 严格相同的条件下同*Ag竞争与Ab结合反应，以oAg的 剂量为横坐标， *Ag.Ab结合率（B%）为纵坐标制得 刻度曲线（Calibration curve）； 2.样本测定：同等条件下，待测样本可获得一定的B%， 由此可从标准曲线上求得待测物（oAg）的含量。
几种免疫法检测血清中甲状腺素的精度： 免疫分析 方法
时间分辨荧光免疫法 增强酶发光免疫法 免疫放射法 酶联免疫法 放射免疫法
测量极限 （mIU/L）
0.008 0.08 0.02---0.023 0.1 0.7
一、RIA的基本原理
（一）竞争抑制结合反应： 放射免疫分析是在体外条件下，由足 量的非标记抗原（Ag）与定量的标记抗原 （*Ag）对限量的特异性抗体（Ab）的竞 争抑制结合反应。
分析原理
*Ag + Ab + Ag *Ag-Ab + *Ag
条件：
1. *Ag与Ag免疫 活性相同
2. *Ag与Ab恒量 3. *Ag与Ag总量 大于Ab有效结 合位点
Ag + *Ab
(过量）
Ag.*Ab + *Ab
(B) (F)
IRMA与RIA的主要区别： RIA 1. 竞争性结合分析 2. 三种主要反应试剂 IRMA 非竞争性结合分析 两种主要反应试剂
3. 标记抗原
4. 复合物放射活度与 待测抗原呈负相关
标记抗体
复合物放射活度与 待测抗原呈正相关
5. NSB主要影响高剂 量反应
一函数关系的标准曲线，可求出被测抗原的含
量
（二）剂量反应曲线：标准曲线
标记物与被测物之间的函数关系可以用剂 量反应曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列 标准抗原反应而绘制出来的，所以又叫标准曲 线。
标准抗原(标准品)是厂家在试剂盒中提供的已知剂量 的非标记抗原。
标准曲线的绘制方法
用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在 一定条件下同限量的特异性抗体进行反应； 在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和F； 分别测量B和F的放射性； 用反应变量（如B/F）作为纵坐标，反应剂量作为横 坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同 浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是 剂量反应曲线。
原理：
TRFIA的标记物由镧系元素螯合物与Ab或Ag组成。待测物 通过免疫反应形成的复合物上，标有镧系元素（ Eu3+），经 紫外线激发后会发出荧光。但连接在复合物上的Eu发射的荧光 很弱，需要将其游离出来再形成一个能发射强荧光的络合物。 因此在免疫反应结束后，需向体系中加入一种“荧光增强剂”， 大大增加信号，所以该技术有时也称为解离增强镧系荧光免疫 分析（DELFIA）。 所谓时间分辨是指Eu3+受激活后产生寿命较长的荧光，而 一般干扰荧光寿命较短，固可用仪器把测量时间定在每次激发 后的数百s之后才开始，干扰荧光已衰减到很低水平，所取 荧光信号是荧光衰减过程的中间一段。 螯合剂：异硫氰酸苯基-EDTA（ICB-EDTA）、对异硫氰酸苯 基-二乙基三氨基四乙酸（p-ICB-DTTA） 增强剂： -萘酰三氟丙酮（ - NTA）
放射性竞争
结合分析
放射免疫分析 (radioimmunoassay, RIA) 免疫放射分析 (immunoradiometric assay, IRMA)
体 外 分 析 技 术
放射性非竞
争结合分析
酶免疫分析(EIA)
体外非放射分析
化学发光免疫分析
(CLIA)
荧光免疫分析(FIA)
放射免疫分析
radioimmunoassay, RIA