体外标记免疫分析
体外分析技术
Ag
25
50
100
200
400
800
*Ag
Ab
分离B、F
B1%
B2%
B3%
B4%
B5%
B6%
1
2
3
4
5
6
B%
？
B%
F%
B/F
Calibration Curve
优缺点比较
1、放射免疫分析技术
放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）——以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。 免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）——以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。
不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上 在肿瘤细胞株中CA199,CA50和CA242共同表达于 MUC-1和诞腺蛋白中。（Baeckstrom et al, 1992）
肿瘤的发展及诊断期
肿瘤标志物在全球的应用情况
肿瘤标志物的分类（化学特性）
癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物 酶类标志物 激素类标志物 癌基因 其他
肿瘤与肿瘤标记物
相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物 相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上 CA19-9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定: MUC-1,MUC-3。（Baeckstrom et al, 1992和1995） 涎腺蛋白。（Baeckstrom et al,1995） 颌下腺粘蛋白 支气管肺泡粘蛋白
1、放射免疫分析技术
优点：超微量分析技术，具有很高的精密度、灵敏度和准确度 缺点：反应条件要求一般，但该技术所用试剂具有放射性，对人体有一定的危害，实验人员应加强防护。同时试剂存在半衰期，试剂必须在半衰期内用完，否则试剂会作废，这需要科学地做好试剂计划。另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素，使灵敏度受到限制。
体外免疫分析的质量控制
核医学体外免疫分析的质量控制一、室内质量控制（IQC）（一）体外免疫分析的室内质量控制内部质量控制（internal quality control， IQC）是实验室内控制各种因素造成的误差，监督测定结果以保证准确地测定样品中某种物质含量的办法。
1、目的通过对结果的分析，对每次测定的质量作出评价，并按照规定的指标决定结果的取舍（个别测定数据的取舍，或整个实验结果的取舍），以保证测定结果的质量，最终目的为提高及保证测定结果的可信性，发现及消除误差的原因。
2、要求（1）标本的正确采集、处理与保存。
①密切与临床科室联系，指导其正确采集及送检各种标本；②及时、正确地处理送检标本，包括选择分离方法及合适的贮存条件。
（2）试剂与仪器的稳定性保证：试剂与测定方法应相对稳定，妥善保存各种试剂。
如更换试剂来源，应由主管质量的主任认可。
①放射免疫分析a.试剂盒不任意更换；b.γ免疫计数器：仪器效率每年测定一次125I效率应≥55%），本底每日测定一次（本底应<80cpm），多探头仪器每月校正一次（CV应≤5%）；c.标准曲线应做复管，不可任意取舍各标准点（包括T及NSB管）；d.每批实验必须带做质控备清（试剂盒或室内的参考血清2～3个）。
②全自动分析仪a.应按仪器操作规定按时或按批进行标准曲线校正；b.每周做质控血清（试剂盒或室内的参考血清2～3个）。
3、指标应有详细记录。
（1）批内质量控制主要参数为：①最大结合率（Bo）应控制在一定范围（30%～50%）；②ED20、ED50、ED75及斜率；③非特殊异结合（NSB）；④标记品用量（T）；⑤最小可测值（灵敏度）；⑥取代比：Bo0Bi应>30%，取代比=Bmax/Bmin 应≥2.5。
（2）批间质量控制主要有以下指标：①RER或平均变异系数（ABCV）的变化；②QC血清的偏差值；按WHO要求在一批实验中有下述情况应整批舍去：a.3个质控血清中有一个测定值超过3SD；b.3个质控血清中有两个测定值在同一个方面超过2SD；c.3个质控血清的测定值在同一个方向超过1SD。
免疫学检验的方法和特点
免疫学检验的方法和特点免疫学检验是一种通过检测和分析机体免疫系统相关指标来评估机体免疫功能的方法。
它可以用于疾病的诊断、预防和治疗过程中，对于研究免疫系统的功能和疾病的免疫机制也具有重要意义。
免疫学检验的方法主要包括体外诊断试验、免疫组化技术和流式细胞术等。
下面将逐一介绍这些方法的特点和应用。
1. 体外诊断试验：体外诊断试验是最常用的免疫学检验方法之一，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、免疫印迹（Western Blot）等。
这些试验通过检测血清中的抗体或抗原来评估机体的免疫状态。
其特点是操作简单、结果准确可靠、样本来源广泛，可以用于检测多种疾病，如感染病、自身免疫病等。
体外诊断试验的优势在于可以进行大规模筛查，对于人群健康状况的监测和疾病的早期诊断具有重要意义。
2. 免疫组化技术：免疫组化技术是利用抗体与组织或细胞中特定分子的结合反应来检测和定位这些分子的方法。
常用的免疫组化技术包括免疫组织化学（IHC）和免疫荧光染色（IF）等。
这些技术可以用于检测和定位肿瘤标志物、炎症细胞因子、免疫细胞表面标志物等，对于疾病的诊断和治疗有重要的指导意义。
免疫组化技术的优势在于可以直接观察到分子的表达和分布情况，具有较高的灵敏度和特异性。
3. 流式细胞术：流式细胞术是一种通过检测和分析细胞表面标志物来鉴定和分类细胞的方法。
通过标记细胞表面的抗原或抗体，结合流式细胞仪的高速流式分析技术，可以对单个细胞进行高通量的检测和分析。
流式细胞术可以用于检测和鉴定免疫细胞亚群、肿瘤细胞、干细胞等，对于疾病的诊断和治疗选择有重要的指导作用。
流式细胞术的优势在于可以同时检测多个指标，对于复杂的样本分析有较高的效率和准确性。
免疫学检验的特点包括以下几个方面：1. 高度特异性：免疫学检验方法可以通过特异的抗体-抗原反应来检测和定量分析特定的分子或细胞，具有较高的特异性。
这使得免疫学检验方法在疾病的诊断和治疗中具有重要的优势，可以准确地鉴定和区分不同的疾病类型。
标记免疫分析临床
标记免疫分析临床标记免疫分析（Immunoassay）是一种基于免疫学原理的生物分析方法，广泛应用于临床诊断和研究领域。
通过标记特定抗原或抗体，结合其与靶分子的特异性相互作用，标记免疫分析能够准确检测和定量分析目标分子的存在和浓度。
在标记免疫分析中，通常使用荧光、酶、金颗粒等标记物作为信号发生器。
这些标记物能与目标分子或抗体发生特异性结合，并通过其特性来输出检测结果。
标记免疫分析的灵敏度高、专一性强，且具有高通量性和自动化程度高的优势，因此在临床应用中得到了广泛的应用。
一、标记免疫分析在临床诊断中的应用1. 临床生化指标检测标记免疫分析在临床生化指标检测中具有广泛的应用，如血糖、血脂、肝肾功能、心脏标志物等。
通过检测相关指标的浓度变化，可以快速准确地评估患者的健康状况以及疾病的进展情况，提供临床决策的依据。
2. 肿瘤标志物检测标记免疫分析在肿瘤标志物检测中扮演重要角色。
通过检测特定肿瘤标志物的浓度变化，可以帮助医生判断肿瘤的存在与否、疗效评估及预后预测等。
例如，CA125在卵巢癌的早期筛查和监测中具有重要意义。
3. 传染病诊断标记免疫分析对于传染病的诊断与监测也有着重要的作用。
例如，HIV、乙肝病毒等病原体的抗体检测，用于早期发现感染，以采取相应的预防和治疗措施。
标记免疫分析可以提供高灵敏度和高特异性的检测结果，有助于及早干预和控制传染病的传播。
二、标记免疫分析在疾病研究中的应用1. 免疫相关疾病的研究标记免疫分析在免疫相关疾病的研究中发挥着重要作用。
例如，自身免疫病的发病机制研究、药物治疗的监测和疗效评估等都离不开标记免疫分析。
通过检测某些自身抗体或免疫相关因子的变化，可以深入了解疾病的发生和发展过程，为新药研发和治疗提供理论依据。
2. 药物代谢及药物监测在药物研究和临床应用中，标记免疫分析可以用于检测药物及其代谢产物的浓度。
通过测定药物浓度的定量变化，可以评估药物的吸收、分布、代谢和排泄过程，进而调整药物剂量、制定个体化治疗方案，提高疗效、减少副作用。
核医学课件：体外分析技术
标准曲线
目前已普遍采用计算机进行数据处 理，自动绘制标准曲线，自动换算 样品中被测物质的浓度
实验操作基本步骤
1.加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境 也要一致。
2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间 不同，一般是37℃。
3.分离：选择好的分离方法分离游离抗原和 抗原－抗体复合物。 4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。 5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算
* Ag
基本反应式
Ag-Ab
*Ag:标记抗原，Ag 非标记抗原 Ab：抗体 *Ag- Ab 标记抗原抗体复合物 Ag- Ab 非标记抗原抗体复合物
Ag-Ab+Ag
条件：1.*Ag与Ag 免疫活性相同
2. *Ag与Ab 恒量
*Ag-Ab+*Ag
理
*Ag与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争 性与Ab结合，当*Ag和Ab的量保持恒定， *Ag与Ag之和大于Ab时，则*Ag-Ab复合物的 形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关 系 ， 即 Ag 量 越 大 ， *Ag-Ab 量 越 小 ； Ag 量 越 小，*Ag-Ab量越大；测定*Ag-Ab或*Ag量即 可推算出被测Ag量
量B、F的cpm
*Ag
B%=B/(B+F)
Ag 1
2
3
4
5 6？
25 50 100 200 400 800
B%
B% 标准曲线
常 用 的 反 应 参 数 有 B%，B/F，F/B、 F%等这些反应变量都可以用作纵坐标来对 应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应 变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这 些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗 原浓度变化而变化的函数关系。
体外分析技术
Berson & Yalow
History review
1960年美国的Berson和 Yalow 将核技术与免疫学 技术结合建立了放射免疫 分析法。 首先用于测定血浆胰岛素 浓度，由于该法对医学的 巨大贡献，1977年Yalow 获得了Nobel Prize。
Yalow
Berson
Radioimmunoassay
3.经过一定时间的温竞争结合反应；4.待竞争结合反应平衡后，分离结合B（Bond）部分和游离F(Free)部分；
5.用放射性探测器测得*Ag-Ab放射性为B或游离*Ag的放射性为F；
6.计算出结合率B%[B/（B+F）×100]，或B/B0%；B0为不含Ag的结合率，因Ag为“0”， 故B0 *Ag-Ab的结合率为最大结合率； 7.以B%或B/B0为纵坐标，标准抗原浓度为横坐标，绘制出B%或B/B0随Ag量变化的曲线即 为标准曲线（图4-2）。
免疫放射分析法（Immunoradiometric assay, IRMA） 是1968年由Miles 和Hiles应用125I标记牛血清胰岛 素获得成功而建立的，到70年代中期单克隆抗体 (McAb)的制备技术问世以来，免疫放射分析法的分 析技术得到突破性的发展，使体外放射分析的灵敏 度和精确度不断提高，应用迅速推广。
Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点，二者 通过竞争方式与Ab 结合；随着Ag增加，Ag* 与Ab结合形成Ag*Ab复合 物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。
抗原抗体反应
Ag*
反应条件 体积 温度 时间 pH Ab 平衡 非平衡 一步法 二步法
Ag
(标准Ag/样品Ag)
检验核医学放射免疫分析和免疫放射分析
3 标记Ag 常用125I和3H标记化合物 要求： (1)适当高的放射性比活度 影响方法的灵敏度和 精密度，标记Ag化学量≤被测Ag的最小量 (2)放射化学纯度>95% 影响方法的灵敏度 (3)免疫活性与未标记Ag基本保持一致 (4)稳定性好，在一定条件下，稳定期1-3月
标记Ag与Ab的用量对 测定的影响
实验室内部质量控制方法
1对实验数据进行审核剔除“坏点” 2剂量反应曲线拟合及质量审核 3精密度评价 (1)反应误差关系RER
从多批实验资料求出直线方程式 SDR = a + bR
a反映分离误差 b反映加样误差
(2)精密度图(P-P图) (用剂量反应曲线)
通过RER将SDR转换SDD(CVD%) 作SDD (CVD%) - lgD曲线 CVD%≤10%
[Q0]
1
[Q0]
B2 – B (1 + ——— + ——— ) + ——— = 0 (4)
[P0] K [P0]
[P0]
将B = 1 - F代入(3)
[Q0]
1
1
F2 – F (1 - ——— - ——— ) + ——— = 0 (5)
[P0]
K [P0] K [P0]
定义R = B / F，由B + F = 1得B = R / (1+R)代入(3)
偏差分析 2实验室外部质量控制(1)对某种分析方法的试剂
或试剂盒进行综合评价 (2)对不同实验室的分析工作
质量进行比较
质量控制样品 质控的“标准系统”－质控血清(QC) 要求：1 QC样品与待测样品性质相同
2 QC样品与待测样品中待测物相同，免疫活性一致 3 QC样品中待测物量已知，分高、中、低三档浓度 4足量制备，分装，低温存放，分批使用 制备方法：1按三档浓度收集多余病人血清，测定标示值
核医学：体外标记免疫分析的临床应用
（3）中枢型对甲状腺激素不敏感。为遗传病。
（4）异源性TSH分泌过多引起的甲亢。
（二）抗甲状腺药物（ATD）治疗中甲状腺 功能监测：
• 次序：TT4→ TT3 →FT4→FT3→sTSH
• 判断ATD过量，TT4尤其是FT4是最灵敏可
体检中心专用
体外标记免疫分析的临床应用
1.下丘脑-垂体-甲状腺轴激素测定
甲亢、甲减等甲状 腺疾病诊断、疗效评估 和用药量调整的指标。
T3、T4、sTSH、 FT3、FT4、TRAb、 TG-Ab、TM-Ab、 TPOAb等
30
2.下丘脑-垂体-生殖腺轴激素（性激素）测定 垂体疾病、月经异常、不育不孕、先天性
（一）甲减的诊断 原发性甲减最常见的病因是由慢性淋巴细胞性甲
状腺炎所引起。 次序：sTSH>FT4>TT4>FT3>TT3
1. sTSH↑、FT3↓、TT3↓、FT4↓、TT4↓，
较为严重的甲减。
2. sTSH↑、FT4↓、TT4↓，FT3、TT3正常，
轻度甲减。
3. sTSH↑、FT4、TT4，FT3、TT3正常，亚临床甲 减。亚临床甲减主要是由慢性淋巴细胞性甲状腺 炎引起的。特殊的有：
（1）TSHR基因突变引起的，本病为常染色体隐性 遗传，病儿无甲状腺肿大，体格和智力发育正常。 用甲状腺激素(T4）治疗可使增高在TSH下降。
（2）先天性甲状腺激素有机合成障碍。本病为常染 色体遗传，如碘有机化缺陷，Pendred’s综合征、 碘化罗氨酸偶联障碍、甲状腺球蛋白合成障碍或 结构异常。体格发育正常，有明显的甲状腺肿大， 成年人多数伴有多发性结节。甲状腺素治疗对甲 肿和结节有明显疗效，不宜手术治疗，不恰当的 手术，甲状腺肿很快复发如初。
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固相分离法
微孔滤膜法
分离方法
双抗体法
盐析法
磁化颗粒法
活性炭吸附法
第三节 体外标记免疫分析的类型
体外标记免疫分析的类型
体外标记免疫分析
放射性核素标记 免疫分析
(RIA、 IRMA)
酶标记 免疫分析
时间分辩荧光 免疫分析
发光标记 免疫分析
(化学发光标记免疫分析 化学发光酶免疫分析 电化学发光免疫分析)
依所测得的复合物的放射性计数(CPM)，对比标准品剂量反应曲线，求知待测品的含量
免疫放射分析(IRMA)原理
单位点： Ag + *Ab (Ag-*Ab) + *Ab
抗原（待测） 标记抗体 抗原标记抗体复合物
双位点： Ad-Ag + *Ab Ad-Ag-*Ab
固体抗体-抗原（待测） 标记抗体 固体抗体-抗原-标记抗体复合物
体外标记免疫分析
概念： 是利用放射分析方法或其派生的相关
非放射分析技术测定生物样品中微量生物 活性物质含量的一类分析方法。
体外标记免疫分析
特点：
利用抗原－抗体结合反应的特异性，加上 各种标记物（标记抗原或抗体）的可测量性来 达到方便敏感地检测各种体内微量生物活性物 质，包括内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、 神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、 肿瘤标志物、血药浓度等。
放射性核素标记免疫分析
概念： 一种将放射性核素测量的高灵敏性、高精确
性和抗原抗体反应的高特异性相结合的体外测定 超微量（10-9～10-15g）物质的新技术。
放射性核素标记免疫分析
分类:
放 射 性 核 素 标 记
竞争性(标记抗原,抗体限量) RIA
非竞争性(标记抗体,抗体过量) IRMA
放射性核素标记免疫分析
Ag １. *Ag:定量、足量 ２. Ab:限量、特异 ３. *Ag和Ag具有相同的免疫活性 ４. Ag+ *Ag>Ab的有效结合位点 ５. *Ag和Ag通过竞争的方式与Ab 结合，随着Ag增加， *Ag与Ab结合 形成的*AgAb复合物的量减少
Ag* Ab
C
FAg* B F B/F
放射免疫分析（RIA）
体外标记免疫分析
鼻祖:
(Yalow,July 19, 1921 –)
美国科学家Yalow和Berson。 于1956年创建的放射免疫分析(RIA)，测定人血浆胰岛素 获得成功。树立了超微量物质体外标记免疫分析的里程碑。 1968年，Miles和Hales建立了免疫放射分析(IRMA)。
体外标记免疫分析
获奖:
在1977年Yalow和Berson因创建了放射免疫 分析，使微量物质的测定成为可能，而荣获诺贝 尔生物医学奖 。
体外标记免疫分析Biblioteka ❖ 贡献: 随着基础医学和相关技术的发展，在RIA标记
抗原竞争性抑制结合、IRMA标记抗体非竞争性结 合的理论基础上，相继派生出许多其它的标记免 疫分析方法，如酶标记免疫分析、时间分辨荧光 免疫分析、化学发光免疫分析、电化学发光免疫 分析等多种形式、多种反应模式的综合性标记免 疫分析体系，并广泛应用于基础医学、临床医学 、教学及科研诸多领域，有力地推动了医学科学 的发展。
IRMA(非竟争结合)反应原理
IRMA(非竟争结合)剂量反应曲线
RIA ＆ IRMA 的区别
第二节 体外标记免疫分析的基本试剂和 基本技术
基本试剂和基本技术
１. 标准品、质控品 ２. 特异性抗体 ３. 示踪剂(标记品) ４. 分离技术
１. 标准品
(1)化学结构: 应与待测物具有相同的化学结构 (2)化学纯度：高度纯化 (3)化学度量： 准确 (4)稳定性：不易变质、不易降解
体外标记免疫分析
发展:
电化学发光免疫分析 化学发光酶免疫分析
化学发光标记免疫分析
时间分辨荧光免疫分析
酶标记免疫分析
放射受体分析
免疫放射分析
放射免疫分析
体外标记免疫分析
分类
竞争放射结合分析：标记抗原，抗体限量 非竞争放射结合分析：标记抗体，抗体过量
第一节 体外标记免疫分析的基本原理
体外标记免疫分析
实验操作步骤： 加样（Ag，*Ag，Ab) →混匀，温育（反应达到平
衡）→分离→测量→数据处理，质量控制
测量复合物计数示意图：
测量
光子(射线能)与闪烁体的作用 ↓
闪烁体(光脉冲、光能) ↓
光电倍增管(电能) ↓
前置放大器(电脉冲) ↓
电子探测仪
（计数单位是探测器输出的电脉冲数，CPM或CPS）
RIA(竞争性结合)标准品剂量反应曲线
Ag
待测抗原
+ *Ag + Ab *AgAb + *Ag
(标记抗原) (特异性抗体) (标记抗原抗体复合物) (游离的标记抗原)
AgAb + Ag
抗原抗体复合物
标记抗原(*Ag)和非标记原(Ag)与限量抗体(Ab)竞争结合。 *Ag和Ag具有相同的与 Ab结合的能力
RIA(竞争结合反应)原理示意图
核医学
核医学
第六章 体外标记免疫分析
体外标记在核医学中的地位
体内诊断：脏器显像
功能测定
诊断 体外诊断：放射分析
临床核医学 治疗：131I治疗甲亢
核医学
实验核医学：利用核技术探索生命现象的本质和物
质变化规律
体外标记免疫分析
体外标记免疫分析是一门综合性学科，也是一 门边缘学科。是集基础医学、实验医学及临床应用 于一体的学科。在当前的各种免疫诊断技术中，标 记免疫分析是最活跃、发展最快的一个领域。
基本原理:
体 外 标 记 免 疫 分 析
竞争性(标记抗原) RIA
非竞争性(标记抗体) IRMA
放射免疫分析（RIA）原理
❖ 放射免疫技术是标记抗原与未标抗原竞争有限量 的抗体，然后通过测定标记抗原抗体复合物中放 射性强度的改变，测定出未标记抗原量。
放射免疫分析（RIA）原理 放射免疫分析（RIA）原理
优缺点： 自1959年Yalow和Berson创建的放射免疫分析（RIA）具
有灵敏度高、特异性强、简便实用、成本低廉等优点。为生 物医学的微量物质分析开创了新的领域。发展到目前为止由 此衍生出了各种各样的标记免疫分析技术。
２. 特异性抗体
(1)亲和力大 (2)高滴度 (3)特异性强 (4)可长期保存
３. 示踪剂（标记品）
（1）高比活度 （2）生物活性与免疫活性与标记前一致 （3）化学纯度>95% （4）稳定性好：标记品不易脱落
４. 分离技术---要求
(1)结合部分与游离部分尽可能完全分开 (2)非特异性结合率（NSB%）低，小于5% (3)分离的成分便于测量 (4)分离效果不受外界环境影响 (5)分离试剂操作简便、价廉易得