化学发光免疫标记分析技术(基本原理 )
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化学发光按化学反应类型分为：
直接化学发光（非酶促化学发光）
吖啶酯系统 异鲁米诺系统
间接化学发光（酶促化学发光）
辣根过氧化物酶—鲁米诺系统（HRP系统） 碱性磷酸酶—金刚烷系统（AP系统） 电化学发光
其它
直接化学发光
直接化学发光：以化学物 质,如异鲁米诺、吖啶酯 等直接标记抗原或抗体， 免疫反应后，直接引发化 学发光反应进行检测。
免疫学检测
免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、 抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子 生物学技术在免疫学研究中的应用。它包括：
抗原抗体的检测技术 免疫细胞的检测 细胞因子的检测 免疫相关基因分析 免疫标记技术 免疫PCR(IM-PCR)技术 杂交瘤技术与T细胞克隆技术
提高发光强度，快速达到稳定发光。
管式化学发光大多用磁微粒，板式化学发光使用微孔板载体。
Y
化学发光免疫分析技术的优越性
灵敏度高：CLIA灵敏度可达10-16/-21mol/L（RIA为10-12mol/L）。又如化学发光 底物（如AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏50万倍。
免疫分析标记技术的发展
60年代
放免
酶免
70年代
发光
90年代
化学发光
化学发光：由于化学反应（通常是氧化）底物从基态跃迁为激 发态，激发态返回基态时，跃迁能量以光子形式释放的现象。
物质激发态
吸收光谱
吸 能
放 能
发射光谱
物质基态
光谱产生过程基本原理
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测 微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。 美国临床化学会议规定：凡是通过测量光子计数的方法都是化学发光， 包括通过酶促luminol发光。 化学发光免疫分析1980’s进入体外诊断领域，第一台全自动检测仪1993 年诞生。
发光免疫分析基本操作步骤(一步法)
待测样品 标记抗体或抗原
包被抗体或抗原的磁珠或反应管 反应15-60分钟 洗涤去除未结合的反应物
反应0-5分钟 发光底物 （或发光剂）
仪器检测
鲁米诺化学发光系统
鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统 O
H2O2+
NH
NH NH2 O
HRP
CO2+Photon (425nm) N2 CO2-
可以随到随测，适用于医院急诊； 定量检测的标准曲线存储在试剂条形码中， 可在2-4周内直接使用。
国外厂家全部是管式化学发光系统
磁微粒分离技术
磁微粒示意图
磁微粒分离技术特点： 较微孔板扩大抗原抗体结合表面积，增加抗原或抗体的结合量， 提高检测灵敏度。 加快反应速度，迅速捕获抗原抗体。
易于结合相、游离相的分离，提高检测准确性。
抗原抗体免疫反应特点
高特异性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗 原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系， 所以抗原抗体反应具有高度的特异性。抗原抗体反应的高特异性是 免疫学检测的基础。
高亲和性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其 反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决 定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。
灵敏度(mol/L)
10-18 10-15 10-12 10-9
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测技术灵敏度的比较
化学发光免疫分析技术的优越性
线性范围宽：发光强度在4～6个数量级之间，与测定物质浓度间呈线性关系。 这与显色的酶免疫分析吸光度（OD值）为2.0的范围相比，优势明显。也优于 放射免疫分析技术。
直接标记：吖叮酯标记 间接标记：碱性磷酸酶-金刚烷系统
电化学发光：三联砒啶钌
国际主流免疫诊断公司均采用第二代化学发光标记物： 吖啶酯（雅培、西门子）、碱性磷酸酶-金刚烷（贝克曼、西门子）、三 联砒啶钌（罗氏）。
化学发光的检测方式
化学发光按检测方式分为：
随机处理模式：管式化学发光（磁微粒分离） 批处理模式： 板式化学发光（物理吸附）
电化学发光
电化学发光：一种在电极 表面由电化学引发的特异 性化学发光反应，直接由 三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+ 标记抗体，反应时标记物 直接发光。
产品：
Roche：Elecsys2010、COBAS e411、COBAS e601
化学发光的发展史
第一代：鲁米诺及其衍生物 第二代：
板式化学发光
适合流行病调查、疾病预防与控制、 体检中心，以及医院血站等大样本检 测项目的使用（比如HIV、TP、HCV和
乙肝两对半等）。
通常采用96孔白色不透明微孔板进行包 被，不方便随到随测和医院急诊；
对于定量检测需要做标准曲线。
国内厂家主要是板式化学发光系统
管式化学发光
采用管式或微粒子发光，测定快速、准确；
高通量和高度自动化 无放射性危险
OH-
NH2 增强剂（Enhancer）
OH R B OH R OH R
N OH S
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物
吖啶酯化学发光系统
CH3 N+ 吖 啶 酯 化 学 发 光 系 统 OHH+ CH3 N H2O2 CH3 N + H2O HOO C=O O
C=O O
HO C=O O
化学发光免疫分析技术的应用
甲状腺激素 生殖激素 肾上腺/垂体激素 贫血因子 肿瘤标志
糖尿病 心血管系统 病毒标志 骨代谢 过敏性疾病
感染性疾病
治疗药物监测
结论
化学发光免疫技术是理想的体外诊断技术：
高灵敏性、特异性和稳定性 宽线性范围
使用范围广
两大反应体系：
辣根过氧化物酶（HRP）系统：氧化还原反应，稳定性差
源德、科美、安图
碱性磷酸酶（AP）系统：水解反应，灵敏度较高
贝克曼：Access 1、Access 2，DXI600、DXI800 西门子：Immulite1000 , Immulite 2000 达成生物：AULIN200
产品：
吖啶酯标记 : 西门子Siemens Centaur XP CP 雅培Abbott Architect i2000 异鲁米诺标记 ：索林DiaSoin Liaison 新产业
间接化学发光
以碱性磷酸酶系统为例
间接化学发光：用参与发 光反应的酶来标记抗原或 抗体，免疫反应后，加入 发光底物，测定发光体系 的发光强度来进行抗原或 抗体的检测。
线性范围
105
104 103 102
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测技术线性范围的比较
化学发光免疫分析技术的优越性
试剂有效期长：有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的 衰变，一般有效期只有一个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化学发光 相比，有效期长可以降低使用成本，利于推广应用。
有效期（月） 18 15 12 9 6 3
免疫分析
免疫反应： 抗原进入机体，刺激机体的免疫系统，使之产生免疫应 答，这种反应叫免疫反应。免疫反应应答包括对抗原物质的 感应、反应、效应三个连续的阶段。
免疫分析（immunoassay，IA）： 在临床检验中，基于抗原与其配对抗体能够发生特异反 应，用已知的抗原或抗体检测分析体液中的抗体或抗原性物 质。
0
酶标 荧光 放免 发光
几种标记/检测试剂的有效期比较
化学发光免疫分析技术的优越性
安全性好：彻底消除了放射性危害，环保、安全。到目前为止，还未发现CLIA的 危害性。 光信号持续时间长：辉光型（glow type）的CLIA产生的光信号持续时间可达数小 时甚至一天。简化了实验操作及测量。容易实现连续、动态、重复测定。 分析方法简便快速：绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂） 的一步法，容易实现自动化。 结果稳定、误差小：样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种 可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析 结果灵敏稳定可靠。
R
Leabharlann Baidu
R
CH3 N 光子 + CO2 +
R
CH3 N + C=O O
OH
O
O
R
碱性磷酸酶化学发光系统
金钢烷（发光底物）及其衍生物的增敏化学发光系统 O O OCH 3 O O OCH 3
AP
OPO32-
OOCH3 * 光子(477nm) O-
碱性磷酸酶及其衍生物的化 学发光系统
O +
O
化学发光的检测类型
1977年诺贝尔生理学或医学奖得主雅洛 Yalow
雅洛1921年出生于纽约， 1945年获得核物理学博士学位， 1975年当选美国科学院院士。因 为发明了放射性免疫分析法，雅 洛获得1976年的拉斯克基础医学 奖，成为历史上第一位获得该奖 的女性科学家。次年，她因为与 同事合作开发了“针对多肽类激 素的放射性免疫分析法”而成为 诺贝尔生理学或医学奖史上第二 位女性获奖者。
直接化学发光（非酶促化学发光）
吖啶酯系统 异鲁米诺系统
间接化学发光（酶促化学发光）
辣根过氧化物酶—鲁米诺系统（HRP系统） 碱性磷酸酶—金刚烷系统（AP系统） 电化学发光
其它
直接化学发光
直接化学发光：以化学物 质,如异鲁米诺、吖啶酯 等直接标记抗原或抗体， 免疫反应后，直接引发化 学发光反应进行检测。
免疫学检测
免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、 抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子 生物学技术在免疫学研究中的应用。它包括：
抗原抗体的检测技术 免疫细胞的检测 细胞因子的检测 免疫相关基因分析 免疫标记技术 免疫PCR(IM-PCR)技术 杂交瘤技术与T细胞克隆技术
提高发光强度，快速达到稳定发光。
管式化学发光大多用磁微粒，板式化学发光使用微孔板载体。
Y
化学发光免疫分析技术的优越性
灵敏度高：CLIA灵敏度可达10-16/-21mol/L（RIA为10-12mol/L）。又如化学发光 底物（如AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏50万倍。
免疫分析标记技术的发展
60年代
放免
酶免
70年代
发光
90年代
化学发光
化学发光：由于化学反应（通常是氧化）底物从基态跃迁为激 发态，激发态返回基态时，跃迁能量以光子形式释放的现象。
物质激发态
吸收光谱
吸 能
放 能
发射光谱
物质基态
光谱产生过程基本原理
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测 微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。 美国临床化学会议规定：凡是通过测量光子计数的方法都是化学发光， 包括通过酶促luminol发光。 化学发光免疫分析1980’s进入体外诊断领域，第一台全自动检测仪1993 年诞生。
发光免疫分析基本操作步骤(一步法)
待测样品 标记抗体或抗原
包被抗体或抗原的磁珠或反应管 反应15-60分钟 洗涤去除未结合的反应物
反应0-5分钟 发光底物 （或发光剂）
仪器检测
鲁米诺化学发光系统
鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统 O
H2O2+
NH
NH NH2 O
HRP
CO2+Photon (425nm) N2 CO2-
可以随到随测，适用于医院急诊； 定量检测的标准曲线存储在试剂条形码中， 可在2-4周内直接使用。
国外厂家全部是管式化学发光系统
磁微粒分离技术
磁微粒示意图
磁微粒分离技术特点： 较微孔板扩大抗原抗体结合表面积，增加抗原或抗体的结合量， 提高检测灵敏度。 加快反应速度，迅速捕获抗原抗体。
易于结合相、游离相的分离，提高检测准确性。
抗原抗体免疫反应特点
高特异性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗 原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系， 所以抗原抗体反应具有高度的特异性。抗原抗体反应的高特异性是 免疫学检测的基础。
高亲和性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其 反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决 定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。
灵敏度(mol/L)
10-18 10-15 10-12 10-9
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测技术灵敏度的比较
化学发光免疫分析技术的优越性
线性范围宽：发光强度在4～6个数量级之间，与测定物质浓度间呈线性关系。 这与显色的酶免疫分析吸光度（OD值）为2.0的范围相比，优势明显。也优于 放射免疫分析技术。
直接标记：吖叮酯标记 间接标记：碱性磷酸酶-金刚烷系统
电化学发光：三联砒啶钌
国际主流免疫诊断公司均采用第二代化学发光标记物： 吖啶酯（雅培、西门子）、碱性磷酸酶-金刚烷（贝克曼、西门子）、三 联砒啶钌（罗氏）。
化学发光的检测方式
化学发光按检测方式分为：
随机处理模式：管式化学发光（磁微粒分离） 批处理模式： 板式化学发光（物理吸附）
电化学发光
电化学发光：一种在电极 表面由电化学引发的特异 性化学发光反应，直接由 三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+ 标记抗体，反应时标记物 直接发光。
产品：
Roche：Elecsys2010、COBAS e411、COBAS e601
化学发光的发展史
第一代：鲁米诺及其衍生物 第二代：
板式化学发光
适合流行病调查、疾病预防与控制、 体检中心，以及医院血站等大样本检 测项目的使用（比如HIV、TP、HCV和
乙肝两对半等）。
通常采用96孔白色不透明微孔板进行包 被，不方便随到随测和医院急诊；
对于定量检测需要做标准曲线。
国内厂家主要是板式化学发光系统
管式化学发光
采用管式或微粒子发光，测定快速、准确；
高通量和高度自动化 无放射性危险
OH-
NH2 增强剂（Enhancer）
OH R B OH R OH R
N OH S
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物
吖啶酯化学发光系统
CH3 N+ 吖 啶 酯 化 学 发 光 系 统 OHH+ CH3 N H2O2 CH3 N + H2O HOO C=O O
C=O O
HO C=O O
化学发光免疫分析技术的应用
甲状腺激素 生殖激素 肾上腺/垂体激素 贫血因子 肿瘤标志
糖尿病 心血管系统 病毒标志 骨代谢 过敏性疾病
感染性疾病
治疗药物监测
结论
化学发光免疫技术是理想的体外诊断技术：
高灵敏性、特异性和稳定性 宽线性范围
使用范围广
两大反应体系：
辣根过氧化物酶（HRP）系统：氧化还原反应，稳定性差
源德、科美、安图
碱性磷酸酶（AP）系统：水解反应，灵敏度较高
贝克曼：Access 1、Access 2，DXI600、DXI800 西门子：Immulite1000 , Immulite 2000 达成生物：AULIN200
产品：
吖啶酯标记 : 西门子Siemens Centaur XP CP 雅培Abbott Architect i2000 异鲁米诺标记 ：索林DiaSoin Liaison 新产业
间接化学发光
以碱性磷酸酶系统为例
间接化学发光：用参与发 光反应的酶来标记抗原或 抗体，免疫反应后，加入 发光底物，测定发光体系 的发光强度来进行抗原或 抗体的检测。
线性范围
105
104 103 102
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测技术线性范围的比较
化学发光免疫分析技术的优越性
试剂有效期长：有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的 衰变，一般有效期只有一个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化学发光 相比，有效期长可以降低使用成本，利于推广应用。
有效期（月） 18 15 12 9 6 3
免疫分析
免疫反应： 抗原进入机体，刺激机体的免疫系统，使之产生免疫应 答，这种反应叫免疫反应。免疫反应应答包括对抗原物质的 感应、反应、效应三个连续的阶段。
免疫分析（immunoassay，IA）： 在临床检验中，基于抗原与其配对抗体能够发生特异反 应，用已知的抗原或抗体检测分析体液中的抗体或抗原性物 质。
0
酶标 荧光 放免 发光
几种标记/检测试剂的有效期比较
化学发光免疫分析技术的优越性
安全性好：彻底消除了放射性危害，环保、安全。到目前为止，还未发现CLIA的 危害性。 光信号持续时间长：辉光型（glow type）的CLIA产生的光信号持续时间可达数小 时甚至一天。简化了实验操作及测量。容易实现连续、动态、重复测定。 分析方法简便快速：绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂） 的一步法，容易实现自动化。 结果稳定、误差小：样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种 可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析 结果灵敏稳定可靠。
R
Leabharlann Baidu
R
CH3 N 光子 + CO2 +
R
CH3 N + C=O O
OH
O
O
R
碱性磷酸酶化学发光系统
金钢烷（发光底物）及其衍生物的增敏化学发光系统 O O OCH 3 O O OCH 3
AP
OPO32-
OOCH3 * 光子(477nm) O-
碱性磷酸酶及其衍生物的化 学发光系统
O +
O
化学发光的检测类型
1977年诺贝尔生理学或医学奖得主雅洛 Yalow
雅洛1921年出生于纽约， 1945年获得核物理学博士学位， 1975年当选美国科学院院士。因 为发明了放射性免疫分析法，雅 洛获得1976年的拉斯克基础医学 奖，成为历史上第一位获得该奖 的女性科学家。次年，她因为与 同事合作开发了“针对多肽类激 素的放射性免疫分析法”而成为 诺贝尔生理学或医学奖史上第二 位女性获奖者。