化学发光免疫分析技术原理简介
化学发光免疫标记分析技术基本原理
化学发光免疫标记分析技术基本原理化学发光免疫标记分析技术主要包括两个步骤：标记物制备和检测过程。
在标记物制备阶段，通常使用特定的荧光染料或荧光标记物来与待检测物质进行反应，并形成稳定的标记物-待检测物质复合物。
而在检测过程中，通过光学系统激发和采集标记物产生的化学发光信号，从而获得待检测物质的信息。
1.标记物制备：在化学发光免疫标记分析技术中，常用的标记物包括酶标记物和荧光标记物。
酶标记物的原理是将特定酶与待检测物质结合，并通过酶反应产生化学发光信号。
例如，常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
而荧光标记物的原理则是将特定荧光染料或荧光物质与待检测物质发生物理或化学反应，从而产生荧光信号。
荧光标记物具有高灵敏度、高分辨率和多颜色检测等优点。
2.检测过程：在化学发光免疫标记分析技术中，通常采用放射性同位素或者化学合成的光感受物质作为化学发光底物。
这些光感受物质在一定条件下与酶标记物或荧光标记物发生反应，产生化学发光信号。
这种化学发光反应通常是一种酶催化反应，通过酶的催化作用将底物转化为高能态的中间产物，进而使中间产物与发光底物反应产生化学发光。
1.样品制备：将待检测的样品进行适当处理和净化，以去除干扰物并保留待测物质。
2.标记物制备：选择适当的酶标记物或荧光标记物，并将其与待检测物质结合，形成稳定的复合物。
3.反应过程：将标记物与样品中的待测物质进行反应，形成标记物-待检测物质复合物。
4.分离与清洁：根据实验需求，通过特定的分离技术分离出标记物-待检测物质复合物，并清洁除去未结合的杂质。
5.光学系统激发和采集信号：将分离出的标记物-待检测物质复合物放置于化学发光仪或荧光显微镜等设备中，通过特定的光源激发标记物产生的化学发光或荧光信号，并通过相应的光学系统采集和记录信号。
6.数据分析和结果解读：通过对采集得到的化学发光或荧光信号进行数据处理和分析，根据标定曲线或标准样品，计算出待检测物质的含量或其它相关信息，并根据实验目的对结果进行解读。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理)
优化技术操作流程，降低对专业人员的依赖，提高检测的便捷性和 普及性。
开发新型标记物
研究开发更多种类的化学发光标记物，拓展该技术的应用范围，满足 更多不同检测需求。
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放射免疫标记技术
利用放射性核素标记抗体或抗原，通 过放射性信号检测，常用的有放射免 疫分析法。
化学发光免疫标记技术
利用化学发光物质标记抗体或抗原， 通过化学发光信号检测，常用的有化 学发光免疫分析法。
免疫标记技术的原理
抗原-抗体反应
信号放大
免疫标记技术的基本原理是抗原 和抗体之间的特异性结合反应。 标记物（抗体或抗原）与待测样 本中的目标抗原或抗体结合，形 成标记的抗原-抗体复合物。
02
化学发光反应原理
化学发光反应的分类
偶合反应
01
通过两个化学反应的偶合，将化学能转变为光能。
氧化还原反应
02
通过电子的得失，将化学能转变为光能。
化学发光复合反应
03
通过化学反应将能量传递给另一物质，使其激发并发出光子。
化学发光反应的机制
激发态的形成
反应物吸收能量后跃迁至激发态。
能量传递与光子的发射
抗体标记
抗体选择
选择与目标抗原特异性结合的抗体，确保抗 体的纯度和特异性。
抗体标记技术
采用荧光染料、酶、同位素等标记抗体，以 便后续检测和信号放大。
标记效率与质量控制
对标记后的抗体进行质量评估和控制，确保 标记效率和稳定性。
免疫反应
1 2
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ加样
将待测样本、标记抗体和抗原加入反应体系中， 进行免疫反应。
激发态的反应物将能量传递给另一物质，使其跃迁至激发态并释放 光子。
免疫化学发光法基本原理
免疫化学发光法基本原理免疫化学发光法是一种基于抗原-抗体反应的检测方法，通过化学发光信号对反应进行指示。
以下是该方法的基本原理：1.抗原-抗体反应抗原-抗体反应是免疫化学发光法的基础。
抗原是指能够与抗体结合并形成复合物的特定物质。
当抗原与其对应的抗体结合时，会形成抗原-抗体复合物。
这种复合物的形成是特异性的，因此可以用来检测特定抗原的存在。
在免疫化学发光法中，抗原-抗体复合物的形成是后续化学发光反应的前提。
2.化学发光化学发光是指某些化学物质在某些条件下吸收能量后，从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态时释放出光子的过程。
在免疫化学发光法中，化学发光信号被用来指示抗原-抗体反应的存在。
通常使用具有高化学发光效率的化合物作为标记物，例如吖啶酯类、荧光素类等。
这些标记物与抗体结合后，在特定条件下会被酶或化学物质催化发光。
3.信号放大为了提高化学发光信号的强度，通常会采用信号放大的方法。
信号放大可以通过增加反应体系的酶或化学物质的浓度来实现，也可以通过采用信号放大器等电子设备来实现。
例如，在免疫化学发光法中，可以将碱性磷酸酶标记在抗体上，然后将底物溶液中的荧光素磷酸酯转化为具有高化学发光效率的荧光素。
由于碱性磷酸酶可以催化荧光素的生成，从而放大了化学发光信号。
4.特异性检测免疫化学发光法的一个重要特点是能够特异性地检测目标抗原。
这得益于抗原-抗体反应的特异性。
当目标抗原存在时，只有与其对应的抗体才会与之结合并形成抗原-抗体复合物，从而引发后续的化学发光反应。
因此，通过检测化学发光信号，可以确定目标抗原的存在与否。
5.总结免疫化学发光法是一种基于抗原-抗体反应的检测方法，通过使用具有高化学发光效率的化合物作为标记物，结合信号放大技术，从而实现抗原-抗体反应的特异性检测。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理 )
吖啶酯化学发光系统
吖啶 酯化 学发 光系 统
CH3 N+
C=O O
CH3
CH3
N
OH-
H2O2
H+
N + H2O
HO C=O
HOO C=O
O
O
R 光子 + CO2 +
R CH3 N
O
R
CH3
OH
N
+
O
C=O
R
O
碱性磷酸酶化学发光系统
金钢烷（发光底物）及其衍生物的增敏化学发光系统
O
O OCH3
AP
免疫学检测
免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其 分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。它包 括：
抗原抗体的检测技术 免疫细胞的检测 细胞因子的检测 免疫相关基因分析 免疫标记技术 免疫PCR(IM-PCR)技术 杂交瘤技术与T细胞克隆技术
免疫分析标记技术的发展
放免 酶免 发光
60年代 70年代 90年代
化学发光
化学发光：由于化学反应（通常是氧化）底物从基态跃迁为激发态，激发态返回基态时， 跃迁能量以光子形式释放的现象。
吸收光谱
物质激发态
吸
放
能
能
物质基态 光谱产生过程基本原理
发射光谱
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新 型标记免疫测定技术。
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测技术线性范围的比较
化学发光免疫分析技术的优越性
试剂有效期长：有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一个月， 而酶免的底物贮存性差，都无法与化学发光相比，有效期长可以降低使用成本，利于推广应用。
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析是一种常用的生物分析技术，其原理是利用化学发光反应检测目标分析物。
该技术主要应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
化学发光免疫分析的步骤如下：
1. 样品处理：将待测样品进行处理，通常包括样品的稀释、蛋白质提取、核酸提取等步骤，以满足后续分析的要求。
2. 特异性结合：将待测样品与特异性抗体结合，这是化学发光免疫分析的关键步骤。
特异性抗体能够与目标分析物结合，形成抗原-抗体复合物。
3. 化学发光：在抗原-抗体复合物形成后，加入一种化学发光底物，底物与复合物发生化学反应，生成激发态分子或产生紫外、可见光等发光物质。
4. 光学检测：利用光学检测系统，测量发光信号的强度或荧光信号的荧光强度。
一般情况下，强度与待测样品中目标分析物的含量成正比。
化学发光免疫分析的优点是灵敏度高、特异性强，且能够同时分析多个目标分析物。
它在临床诊断中广泛应用，例如检测某些疾病标志物、药物浓度和病原微生物等。
此外，化学发光免疫分析还可用于药物研发中的蛋白质相互作用研究、基因表达分析等。
总之，化学发光免疫分析是一种重要的生物分析技术，通过特异性抗体与荧光底物的配对应用，实现对目标分析物的定量检测，具有灵敏度高、特异性强和多重分析的优势。
化学发光免疫分析技术原理及特点对比
化学发光免疫分析技术原理及特点对比一、化学发光免疫分析技术原理自从二十世纪七十年代开创化学发光技术以来，世界各国科学家在这个技术的基础上不断研究发展，以改善此技术在人体医学检验上的应用，通过不懈的努力探索，最终化学发光技术进入临床测试应用，为人类健康检验做出了重要的贡献。
时至今日，化学发光免疫分析作为一种微量物质定量检测技术，已经发展的先进且成熟，在人体疾病筛查和健康检测等方面，有着十分重要的作用。
化学发光免疫分析结合了化学发光反应和免疫学的特点，通过将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，抗原或抗体与待测物质发生特异性结合，随后加入氧化剂、化学发光底物或是电压的激发，通过氧化剂氧化发光物质，酶催化发光底物或是发光物质在电压的激发下形成高能的激发态，由于激发态不稳定，再回到基态过程中会以光的形式释放出能量，同时由于待测物浓度与发光强度在一定条件下呈线性定量关系，因此借助仪器检测发光的强度就可以确定待测物的含量。
以测定人绒毛膜促性腺激素(HCG)为例(图)，待测物HCG首先与酶标记的抗体以及发光标记物标记的抗体反应，形成双抗体夹心复合物，随后再加入与含有与发光标记物结合的磁珠，通过磁铁将复合物聚集，最后加入发光底物产生光信号进行定量。
图-人绒毛膜促性腺激素化学发光测定原理二、不同化学发光免疫分析技术特点对比根据标记物的不同，化学发光可大致分为：利用吖啶酯、鲁米诺等进行标记的直接化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)、利用如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶等标记的酶促化学发光免疫分析(Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)和利用三联吡啶钌等标记的电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)。
直接化学发光免疫分析发光过程十分快速，在几秒钟之内就可以完成，而酶在一般情况下稳定性较好，如辣根过氧化物酶处于室温下可以在几周内保持稳定，且具有较高的特异性，发光时间较直接化学发光法更长，可以持续几分钟到十几分钟，电化学发光法处于电解池介质中反应因而可以反复使用。
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析化学发光免疫分析，也称为化学发光法或发光免疫测定法，是一种高灵敏度和高特异性的生物分析技术。
它结合了免疫学、生物学和化学的原理，利用特异性抗体与其抗原（或其他生物分子）相互作用，通过化学反应使其辐射出光信号，从而定量地检测目标物质的存在和含量。
一、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析原理基于化学发光原理和免疫学原理。
化学发光原理就是将化学反应的能量通过光子的辐射转换为光的能量。
免疫学原理是利用特异性免疫反应来识别和区分不同的抗原或抗体。
化学发光免疫分析技术的基本步骤如下：1.选择特异性的抗体与目标物质的结合；2.引入辐射源激活化学发光前体（例如，过氧化物或二氧化硫酞）；3.目标物质与抗体发生结合后，释放了辐射源激活前体，使其进一步分解并产生化学发光；4.测定样品中的荧光强度，用于定量分析目标物质的存在和含量。
化学发光免疫分析发出的荧光信号对于抗原-抗体的结合非常敏感和特异。
比较常见的荧光标记物包括酶（如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、荧光染料（如荧光素和荧光素衍生物）、金纳米粒子等。
二、化学发光免疫分析的应用化学发光免疫分析的应用涉及生物分子、环境污染、中药等领域。
下面将从这些不同应用领域来介绍化学发光免疫分析技术的具体应用。
1.生物分子分析生物分子分析是化学发光免疫分析技术的主要应用领域之一。
常见的生物分子包括蛋白质、核酸、糖等。
如免疫荧光分析技术可以快速、准确地分析细胞表面分子、内部生物分子和变态反应特异性IgE。
同时，化学发光免疫分析技术可以用于患者体液中的特定免疫球蛋白或蛋白质的定量检测。
2.环境污染分析环境污染分析是化学发光免疫分析技术的另一个主要应用领域。
通过测量土壤、水、空气等样品中的污染物含量，可以快速精准地确定其存在和含量。
化学发光免疫分析技术可用于检测重金属、有机污染物、致癌物等。
该技术不仅检测灵敏，而且简便易行。
3.中药分析中药分析中常用的技术包括高效液相色谱法、气相色谱法、电化学法等。
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术（Chemiluminescence Immunoassay，简称CLIA）是一种用于检测物质浓度的生化分析技术。
该技术利用免疫反应，在荧光底物的作用下产生可见光发射，从而实现对物质的检测和定量分析。
化学发光免疫分析技术的基本原理是将待测物与对应的抗原或抗体结合，形成免疫复合物。
然后，将荧光标记的抗体或抗原加入到体系中，与免疫复合物结合。
接下来，加入荧光底物，在适当的条件下，底物被激活，产生化学反应，释放出能量，从而形成荧光。
荧光信号可以通过荧光仪进行检测和定量分析。
荧光仪通过光电倍增管等装置将荧光信号转化为电信号，经过控制和处理，最终得到物质的浓度。
化学发光免疫分析技术的优势在于其灵敏度高。
由于发光底物的特殊性质，即使在低浓度下，也能产生明显的发光信号。
此外，化学发光免疫分析技术的特异性强，能够准确识别目标物质，避免误判。
另外，与其他传统的免疫分析方法相比，化学发光免疫分析技术反应速度快，可以在较短的时间内得到结果。
此外，操作简单，无需复杂的设备和技术，具有很高的实用性。
化学发光免疫分析技术在医学诊断中有着广泛的应用。
比如，可以用于检测血清中肿瘤标志物的浓度，从而实现早期诊断和预测疾病进展的风险。
此外，化学发光免疫分析技术还可以应用于感染性疾病的快速诊断，如艾滋病、结核病等。
此外，化学发光免疫分析技术还被广泛应用于生物制药工业中的药物分析。
在食品安全领域，也可以利用化学发光免疫分析技术检测食品中的有害物质，从而保障食品的质量安全。
总之，化学发光免疫分析技术是一种灵敏、特异、操作简单的生化分析技术。
在医学诊断、药物检测、食品安全检测等领域有着广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和创新，化学发光免疫分析技术将进一步完善，并在更多的领域发挥重要的作用。
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化学发光免疫分析技术原理简介
20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。
1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。
近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。
1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。
这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。
一、化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。
在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。
免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。
将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。
亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或
抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。
发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。
试
剂货架寿命长，稳定性好，具有大规模自动化测试的功能。
这项技术发展很快，已有许多厂商生产各具特色的测定仪器与配套试剂。
目前我国仪器与试剂均需进口，测定成本较高。
其反应过程分为以下两个阶段。
(1)待测抗原(Ag) 和一定量的碱性磷酸酶标记抗原( ALP-Ag) 同时与一定量的特异性抗体(Ab) 竞争结合。
ALP-Ag-Ab 的量与Ag 的量之间存有竞争抑制的关系，即Ag 的量越多，形成的Ag-Ab 的
量就越多， ALP-Ag-Ab 的量越少。
反之亦然。
(2) 加入(羊)抗鼠IgG 包被的磁性颗粒，捕获ALP-Ag-Ab( 其中的Ab 为鼠单
克隆抗体) ，在磁场作用下将ALP-Ag-Ab 与ALP-Ag 分开，经洗涤并吸弃废液后，加入化学发光底物
( dioxetane-phosphate ,AMPPD) ，后者为带有二氧四联环稳定结构的化合物，在ALP 的作用下去掉磷酸根，生成不稳定的中间体。
中间体迅速分解并同时
释放出光子。
光子的生成量与ALP-Ag-Ab 的量成正比，由此可计算出待测抗原
( Ag) 的量。
将一系列已知浓度的标准液与待测标本同样处理，即可绘出标准曲线并据此查出标本中待测抗原的浓度。
二、电化学发光免疫分析
电化学发光免疫分析( electrochemi1uminescence
immunoassay ,ECLlA )克服了CLlA 技术中每一发光分子只能利用一次的缺
点，其基本原理是利用三联吡啶钌[ Ru ( bpy) 3 ] 2+ .和三丙胺(TPA) 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，分析过程可通过电场精确控制，因此具有特异性好、灵敏度高、线性测定范围宽、操作的自动化程度高等优点。
但目前这项技术所需的仪器以及配套试剂均需进口，测定成本较高。
ECLlA 的体系中主要有两个部分，即免疫反应系统和电化学发光系统。
免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同，因此具有较高的特异性;电化学发光系统包括电化学和化学发光两个过程。
在电极表面的电场作用下，二价的三联吡啶钌[ Ru ( bpy ) 3 ] 2
+失去一个电子，成为三价的三联吡啶钌[ Ru ( bpy) 3 ] 3+，三丙胺(TPA)也失去一个电子被氧化随即脱氢成三丙胺自由基自由基传递一个电子给三价的三联吡啶钌使还原成激发态的二价三联吡啶钌[Ru ( bpy ) 3] 2+ ，后者很不稳定，以发射一个波长为620 nm 的光子的形式释放能量而回到基态。
这个过程可反复进行，直到电场中的三丙胺耗尽。
因此测定过程中的一个抗原抗体复合物可产生许多光子信号，从而产生生物放大效应，极大地提高了方法的灵敏度。
此外测定方法还应用了链霉亲合素，生物素技术、磁性分离技术等，使其准确性、灵敏度以及自动化程度都很高。
实测技术有双抗体夹心法与竞争法，下面以双抗体夹心法为例，简述反应过程如下。
(1)待测抗原( Ag) 、一定量的生物素化抗第一位点单克隆抗体( Ab )和三联吡啶钌[ Ru( bpy) 3 ]2+. 标记的抗第二位点单克隆抗体于反应
体系中相互结合，形成相对分子质量大的抗原抗体"夹心"复合物。
Ag + Ab + [ Ru ( bpy)]2 + Ab [ Ru ( bpy) 3 ] 2 + Ab - Ag - Ab
由于上述的两种单克隆抗体在试剂中都是定量的，因此待测抗原的量与抗原抗体复合物的量成正的线性关系。
(2) 加入链霉亲合素包被的磁性微粒，通过生物素与链霉亲合素的反应使上述大分子复合物与磁性微粒紧密结合。
(3) 将上述反应体系通过蠕动泵吸入测量室中，磁性微粒被工作电极下的磁铁吸附于电极表面，未结合的游离物均被洗弃。
再通过蠕动泵加入含TPA 的缓冲液，同时给电极通电产生化学发光，并启动光电倍增管检测光子强度。
光子强度与三联吡啶钌的浓度亦即抗原抗体复合物的量呈线性相关。
检测结果由仪器自动从标准曲线上查出，此曲线由试剂条形码扫描入仪器并通过两点定标校正。