化学发光免疫分析
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是一种基于化学发光原理的免疫分析技术，它结合了免疫学和化学发光技术的优势，具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用前景。
本文将从化学发光原理、免疫分析方法和应用领域等方面对化学发光免疫分析原理进行介绍。
化学发光原理。
化学发光是指在化学反应中产生的光。
化学发光反应的基本原理是两种或两种以上的物质在一定条件下发生反应，通过激发态的分子或离子产生的能量转移到基态的分子或离子上，从而产生光。
化学发光反应是一种放热反应，通常需要一种催化剂来促进反应的进行。
在化学发光免疫分析中，化学发光物质通常被标记在抗体或抗原上，当靶分子与标记的抗体或抗原结合时，激发化学发光反应，产生光信号。
免疫分析方法。
化学发光免疫分析是一种基于免疫学原理的分析方法，它利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过检测免疫复合物的形成来定量或半定量地测定样品中的靶分子。
在化学发光免疫分析中，通常使用化学发光仪器来检测化学发光信号的强度，进而确定样品中靶分子的浓度。
与传统的免疫分析方法相比，化学发光免疫分析具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速等优点，因此在临床诊断、药物检测、环境监测等领域得到了广泛的应用。
应用领域。
化学发光免疫分析技术在临床诊断、药物检测、环境监测等领域有着广泛的应用。
在临床诊断中，化学发光免疫分析可以用于检测肿瘤标志物、感染性疾病标志物、内分泌激素等，具有高灵敏度和高特异性，可以帮助医生进行早期诊断和疾病监测。
在药物检测中，化学发光免疫分析可以用于药物代谢产物的检测和药物浓度的监测，有助于指导临床用药。
在环境监测中，化学发光免疫分析可以用于检测水质、空气质量、土壤污染等，具有快速、准确的优势。
总结。
化学发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强的免疫分析技术，具有广泛的应用前景。
通过对化学发光原理、免疫分析方法和应用领域的介绍，我们可以更好地理解化学发光免疫分析的原理和特点，为其在临床诊断、药物检测、环境监测等领域的应用提供理论基础和技术支持。
化学发光免疫分析
糖尿病
Albumin C-peptide Insulin
唐氏筛查
PAPP-A free βHCG HCG＋β AFP
心肌标志
骨标志
肝纤维
CK-MB
ß-Crosslaps
LN
Digoxin
25-(OH) Vit. D
HA
Digitoxin
Intact PTH
PIIINP
Myoglobin
Intact PTH
试剂有效期长 有效期可长达1年以上，放射免疫分析由
于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一 个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化 学发光相比，有效期长可以降低使用成本， 利于推广应用。
梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！
3 化学发光免疫分析的优越性
➢ 中国免疫诊断现状
中国
国际（欧美为主）
种类
方法
检测原理
酶联免疫
酶与样本反应，依据颜色变化程度确定结果
免疫 化学发光
诊断
将抗原抗体同样本结合，由磁珠捕捉反应物，加入 发光促进剂加大反应发光速度与强度，进而诊断
根据镧系元素螯合物发光特点，用时间分辨技术测 时间分辨荧光
量荧光，检测波长和时间两个参数进行信号分辨
分子 诊断
PCR 基因芯片
DNA高温变成单链，低温互补配对链合成
激发态ν
的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出
光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样
品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测
能量
h.ν
物质的含量。
基态ν0 梦想——之以恒、真正为实现纳米科技事业的梦想而奋斗！
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析化学发光免疫分析篇一：化学发光免疫分析方法化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。
其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。
化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。
化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。
免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。
化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。
待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。
一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。
目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。
1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。
鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。
在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。
因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。
酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。
鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。
鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理)
优化技术操作流程，降低对专业人员的依赖，提高检测的便捷性和 普及性。
开发新型标记物
研究开发更多种类的化学发光标记物，拓展该技术的应用范围，满足 更多不同检测需求。
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放射免疫标记技术
利用放射性核素标记抗体或抗原，通 过放射性信号检测，常用的有放射免 疫分析法。
化学发光免疫标记技术
利用化学发光物质标记抗体或抗原， 通过化学发光信号检测，常用的有化 学发光免疫分析法。
免疫标记技术的原理
抗原-抗体反应
信号放大
免疫标记技术的基本原理是抗原 和抗体之间的特异性结合反应。 标记物（抗体或抗原）与待测样 本中的目标抗原或抗体结合，形 成标记的抗原-抗体复合物。
02
化学发光反应原理
化学发光反应的分类
偶合反应
01
通过两个化学反应的偶合，将化学能转变为光能。
氧化还原反应
02
通过电子的得失，将化学能转变为光能。
化学发光复合反应
03
通过化学反应将能量传递给另一物质，使其激发并发出光子。
化学发光反应的机制
激发态的形成
反应物吸收能量后跃迁至激发态。
能量传递与光子的发射
抗体标记
抗体选择
选择与目标抗原特异性结合的抗体，确保抗 体的纯度和特异性。
抗体标记技术
采用荧光染料、酶、同位素等标记抗体，以 便后续检测和信号放大。
标记效率与质量控制
对标记后的抗体进行质量评估和控制，确保 标记效率和稳定性。
免疫反应
1 2
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ加样
将待测样本、标记抗体和抗原加入反应体系中， 进行免疫反应。
激发态的反应物将能量传递给另一物质，使其跃迁至激发态并释放 光子。
化学发光免疫分析技术
• 化学发光免疫分析仪是通过检测患者血清内待测物质从而 对人体进行免疫分析的医学检验仪器。将定量的患者血清 和辣根过氧化物（HRP）加入到固相包被有抗体的白色不 透明微孔板中，血清中的待测分子与辣根过氧化物酶的结 合物和固相载体上的抗体特异性结合。分离洗涤未反应的 游离成分。然后，加入鲁米诺Luminol发光底液 ，利用化 学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能 量以光子的形式释放。此时，将微孔板置入分析仪内，通 过仪器内部的三维传动系统，依次由光子计数器读出各孔 的光子数。样品中的待测分子浓度根据标准品建立的数学 模型进行定量分析。最后，打印数据报告，以辅助临床诊 断。
血清FT3和FT4降低： ⑴甲减病人两者皆下降，但轻型甲减、甲减初期多 以FT4下降为主；⑵低T3综合征仅有FT3下降； ⑶某些药物，如苯妥英 钠、多巴胺、糖皮质激素也可使FT3和FT4降低。
• T3、T4均升高：高TBG血症、甲亢、甲状腺激素不敏感综合征。
化学发光免疫分析
一、化学发光免疫技术的概念 二、化学发光免疫分析基本原理 三、化学发光免疫分析的类型 四、临床应用 五、发展与展望
一、化学发光免疫技术的概念
化学发光免疫技术：化学发光分析是根据化学反应统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与 待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入 化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或 定性检测。
磁微粒模式图
特点 – 抗原和抗体结合与未结合 部分的易分离
Y
3.2、化学发光酶免疫分析
化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶 如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗 体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固 相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物 (发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光 电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至 计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。
化学发光标记免疫分析法
不同IgG浓度下CRET免疫传感器的荧光光谱。IgG浓度分别为：0 (a), 0.5 (b), 1 (c),1.5 (d), 2 (e), 2.5 (f), 3 (g), 3.5 (h), 及4 nM (i)。插入的曲线为荧 光强度比率（R=I425/I525）随浓度变化曲线
01 吖啶酯 Add your texts here
02 三联吡啶钌
03 鲁米诺及其衍生物 04 AMPPD
化学发光剂
吖啶酯:在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm 的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮 是该发光反应体系的发光体。
化学发光剂
三联吡啶钌: [RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供 体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生 氧化反应。
化学发光剂
电化学发光剂反应原理
化学发光剂
鲁米诺:化学名称为3-氨基邻苯二甲酰肼 鲁米诺发光原理
化学发光剂
AMPPD:化学名称为 3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧 酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐
AMPPD发光原理
标记技术
发光物标记 酶标记 元素标记
标记技术：将
化学发光剂的 分子与某些分 子结合，直接 或间接地测定 待测组分。通 过分析被标记 物来完成对待 测组分的测定
人体免疫球蛋白A检测
化学发光夹心法检测lgA装置：多毛细管玻璃板的微孔示意图
化学发光免疫分析检测IgA过程
化学发光强度和lgA浓度的关系
人体免疫球蛋白A检测 集束板与96孔板检测lgA的比较
冲洗后
（2） 加入碱 （pH>10）
发光
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析是一种常用的生物分析技术，其原理是利用化学发光反应检测目标分析物。
该技术主要应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
化学发光免疫分析的步骤如下：
1. 样品处理：将待测样品进行处理，通常包括样品的稀释、蛋白质提取、核酸提取等步骤，以满足后续分析的要求。
2. 特异性结合：将待测样品与特异性抗体结合，这是化学发光免疫分析的关键步骤。
特异性抗体能够与目标分析物结合，形成抗原-抗体复合物。
3. 化学发光：在抗原-抗体复合物形成后，加入一种化学发光底物，底物与复合物发生化学反应，生成激发态分子或产生紫外、可见光等发光物质。
4. 光学检测：利用光学检测系统，测量发光信号的强度或荧光信号的荧光强度。
一般情况下，强度与待测样品中目标分析物的含量成正比。
化学发光免疫分析的优点是灵敏度高、特异性强，且能够同时分析多个目标分析物。
它在临床诊断中广泛应用，例如检测某些疾病标志物、药物浓度和病原微生物等。
此外，化学发光免疫分析还可用于药物研发中的蛋白质相互作用研究、基因表达分析等。
总之，化学发光免疫分析是一种重要的生物分析技术，通过特异性抗体与荧光底物的配对应用，实现对目标分析物的定量检测，具有灵敏度高、特异性强和多重分析的优势。
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析化学发光免疫分析，也称为化学发光法或发光免疫测定法，是一种高灵敏度和高特异性的生物分析技术。
它结合了免疫学、生物学和化学的原理，利用特异性抗体与其抗原（或其他生物分子）相互作用，通过化学反应使其辐射出光信号，从而定量地检测目标物质的存在和含量。
一、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析原理基于化学发光原理和免疫学原理。
化学发光原理就是将化学反应的能量通过光子的辐射转换为光的能量。
免疫学原理是利用特异性免疫反应来识别和区分不同的抗原或抗体。
化学发光免疫分析技术的基本步骤如下：1.选择特异性的抗体与目标物质的结合；2.引入辐射源激活化学发光前体（例如，过氧化物或二氧化硫酞）；3.目标物质与抗体发生结合后，释放了辐射源激活前体，使其进一步分解并产生化学发光；4.测定样品中的荧光强度，用于定量分析目标物质的存在和含量。
化学发光免疫分析发出的荧光信号对于抗原-抗体的结合非常敏感和特异。
比较常见的荧光标记物包括酶（如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、荧光染料（如荧光素和荧光素衍生物）、金纳米粒子等。
二、化学发光免疫分析的应用化学发光免疫分析的应用涉及生物分子、环境污染、中药等领域。
下面将从这些不同应用领域来介绍化学发光免疫分析技术的具体应用。
1.生物分子分析生物分子分析是化学发光免疫分析技术的主要应用领域之一。
常见的生物分子包括蛋白质、核酸、糖等。
如免疫荧光分析技术可以快速、准确地分析细胞表面分子、内部生物分子和变态反应特异性IgE。
同时，化学发光免疫分析技术可以用于患者体液中的特定免疫球蛋白或蛋白质的定量检测。
2.环境污染分析环境污染分析是化学发光免疫分析技术的另一个主要应用领域。
通过测量土壤、水、空气等样品中的污染物含量，可以快速精准地确定其存在和含量。
化学发光免疫分析技术可用于检测重金属、有机污染物、致癌物等。
该技术不仅检测灵敏，而且简便易行。
3.中药分析中药分析中常用的技术包括高效液相色谱法、气相色谱法、电化学法等。
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3.洗涤后加入发光底物，酶促使发光底物发光，通过专用 的仪器检测光子的数量，从而反算出未知抗原或抗体的浓 度。
化学发光免疫检测原理
在化学发光免疫 分析，其基本原 理同酶联免疫技 术（ELISA）， 常采用双抗体夹 心法、竞争法、 等反应模式，
制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化 学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升 至电子激态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时， 以发射光子的形式释放能量（即发光）。
免疫测定(immunoassay)是利用抗原体反应来测定标本
中微量物质的方法。
化学发光免疫检测原理
1.使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫 活性。
．厂商试剂与仪器共同开发，试剂 基本系列化。
．兴起于20世纪60年代，现已基本退 出临床应用； ．产品生命周期已终结；
．厂商试剂和仪器共同开发，试剂 基本系列化。
酶联免疫法 （ＥＬＩＳＡ）
．兴起于20世纪80年代，现普遍使用 于各级临床机构，为我国临床免疫 诊断的基本方法； ．产品处于成熟期；
．厂商试剂与仪器共同开发，试剂 尚未系列化。
免疫分析经历了放射免疫检验、荧光免疫检验、 酶标免疫检验等不同时期，化学发光免疫检验是 免疫分析发展的一个新阶段，它环保、快速、准 确的特点已得到人们的普遍认识。
因此化学发光免疫分析是通往免疫检验完 美境界的必经之路。
放射免疫法 （ＲＩＡ）
表1.1 中国免疫诊断现状
中国
国际（欧美为主）
．兴起于20世纪70年代，现仍普遍使 用于县级以上医院； ．产品处于衰退期；
新技术，很成熟
新技术，不成熟
干扰极小
容易受内外源稀土离子的干扰
项目齐全(见试剂报价 缺少部分项目。如：贫血（叶
单)
酸，铁蛋白，维生素B12）
化学发光免疫分析的优点：
• 1．灵敏度高：这是CLIA关键的优越性，其灵敏度可达1016mol/L （ RIA 为 10-12mol/L ） 。 又 如 化 学 发 光 底 物 （ 如 AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏 5х105倍。
图1.2双抗体夹心法反应原理示意图
历史发展产品的对比：
1、化学发光与酶免的对比 2、化学发光与放免的对比 3、化学发光与时间分辩荧光检测的对比 4、化学发光的突出优点
化学发光与酶免的对比
• 酶免原理：1.使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并
保持其免疫活性。 • 2.使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原
．厂商试剂与仪器共同开发，仪器 自动化程度高，试剂系列化状态.
化学发光免疫分析技术原理
化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，
CLIA）是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合， 用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。
化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其机
化学发光与时间分辩荧光的对比：
标记物 稳定性 灵敏度 反应体系
包被技术
技术性 干扰因素 测试项目
化学发光
时间分辩荧光
酶-发光底物两级放大 稀土离子，如铕
稳定性非常好
影响被标记物的生物活接近中性
酸性，易引起蛋白质变性
不透明微量孔壁吸附, 提高分析灵敏度,降低 本底
采用透明微量孔壁吸附，孔壁 的透明度会引起,本底干扰
• 2．宽的线性动力学范围：发光强度在4～6个量级之间与测定 物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶免疫分析吸光度（OD 值）为2.0的范围相比，优势明显。虽然RIA也有较宽的线性 动力学范围，但放射性限制了其应用。
测量精度 人体伤害 有效期 干扰因素 测试项目
酶标
定性/半定量测量 底物有致癌性 较长 较多 少
化学发光
定量测量 无 长
极少 多
化学发光与放免的对比
• 放免原理是使用具有放射性的I125作标记物，
然后用测量射线计数仪放射性（125I）。对环境 的污染及对身体的危害，已经为重视环保的国家 逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室） • 125I的半衰期短而导致其试剂有效期短 • 标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内 的变异较大； • 标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。 操作繁琐，出报告时间长。
化学发光与放免的对比表：
测量精度 人体伤害 有效期 干扰因素 测试项目
放免
较高
放射性 较长 较多 较多
化学发光
高
无 长 极少 多
化学发光与时间分辨的对比：
时间分辨免疫检测原理和化学发光基本一样，只
是标记物改为稀土元素，不用发光底物但需要外在的稳 定光源照射，光的波长产生stoke位移，并有一个时间滞 后以便于检测波长改变后的光子数量。 1、化学发光成本低于时间分辨荧光免疫分析 。 2、化学发光比时间分辨荧光免疫试剂盒更稳定 3、化学发光免疫分析试剂盒对对测试环境条件要求低 。 4、化学发光不需要外光源，仪器可靠性更高
或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 • 3.洗涤后加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产
物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深
浅刊物定性或定量分析。
• 化学发光免疫检测的灵敏度与可测范围 远远高于酶免产品，兼具ELISA法简便的 操作方法与较短的反应时间。
化学发光与酶免的对比表：
化学发光免疫分析仪
学术资料
制作：侯恒红
北京迈力德科技有限公司
垂询电话: 010-81238229 13653114157
免疫学检测发展简介
• 免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特 异性反应进行检测的一种手段，由于其 可以利用同位素、酶、化学发光物质等 对检测信号进行放大和显示，因此常被 用于检测蛋白质、激素等微量物质。
． 兴 起 于 20 世 纪 70 年 代 ， 现 仍 在 临 床应用； ．产品处于衰退期；
．厂商试剂与仪器共同开发，试剂 基本系列化。
化学发光免疫 法（ＣＬＩＡ）
．导入于20世纪90年代，现个别较大 医院开展个别项目； ．产品处于导入期或成长期； ．无厂商开发生产，完全依赖进口
．兴起于20世纪80年代，现已被临床 普遍使用，成为临床免疫诊断的支 柱方法； ．产品处于成熟期；