其它标记免疫分析技术
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第九章 其它标记免疫分析技术
第九章 其它标记免疫分析技术
第九章 其它标记免疫分析技术
目录
1 放射免疫分析技术 2 金标记免疫分析技术 3 发光免疫分析技术
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第九章 其它标记免疫分析技术
第一节 放射免疫技术
（radioimmunoassay）
放射免疫技术基本类型：
★经典的放射免疫分析
（radioimmunoassay，RIA）
第九章 其它标记免疫分析技术
（一）免疫放射分析原理
免疫放射分析的基本原理是非竞争性免疫结 合反应。
放射性核素标记于抗体上，用过量的标记抗 体*Ab与待测抗原Ag反应，待反应完成后，去除 剩余的游离标记抗体，则Ag-*Ab复合物的放射性 强度与待测抗原的量成正比关系，通过检测免疫 复合物的放射性，从而得到待测样本的浓度。
抗体Ka值越大，放射免 疫分析的灵敏度越高， 抗体Ka值达到10-9—— 10-12mol/L，才适合放射 免疫分析。
第九章 其它标记免疫分析技术
②抗体特异性
抗体特异性：指抗体分别与相应抗原和抗原结构 类似物的结合能力的比较。抗体与相应抗原结合 能力强，而与该抗原结构类似物(同类物、前体、 降解物和代谢物等)结合能力弱，则特异性高。
第九章 其它标记免疫分析技术
（一）放射免疫分析原理
➢竞争性结合反应的经 典标记抗原（Ag*）和 非标记抗原（Ag）与限 量抗体(Ab)竞争性结合 ➢Ag*和Ag具有等同的 与Ab结合能力
第九章 其它标记免疫分析技术
Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点，二者 通过竞争方式与Ab 结合；随着Ag增加， Ag*与Ab结合形成 Ag*Ab复合物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。
第九章 其它标记免疫分析技术
单位点IRMA 双位点IRMA
第九章 其它标记免疫分析技术
（二）实验方法 ◆抗原抗体反应 ◆免疫复合物与游离标记物的分离 ◆放射性强度测定和数据处理
第九章 其它标记免疫分析技术
（三）方法学评价
IRMA的灵敏度和特异性均比RIA更好，且操 作程序简单，但是应用的抗体量较大。
第九章 其它标记免疫分析技术
IRMA和RIA的比较
标记物质
IRMA
抗体
RIA
抗原
标记物用量
过量
限量
反应方式
直接结合
竞争结合
B、F分离方法 固相抗体法等 第二抗体法等
第九章 其它标记免疫分析技术
小结
放射免疫技术是以放射性核素为示踪剂的标记 免疫技术，分为放射免疫技术和免疫放射分析。
放射免疫分析是待测抗原和定量的标记抗原竞 争性结合限量的抗体，免疫放射分析是将放射性物 质标记在抗体上，免疫放射分析分为单位点和双位 点两种类型。
参数
cpm
计算
B/T (%) F/T (%)
B/F (%)
B/B0 (%)
注：T即是B与F的总和
拟合 标准曲线
第九章 其它标记免疫分析技术
（三）方法学评价
RIA进行体外检测微量物质，灵敏度高特 异性强，重复性好，但需注意放射性核素 对环境造成的污染。
第九章 其它标记免疫分析技术
三、免疫放射分析
（一）免疫放射分析原理 （二）实验方法 （三）方法学评价 （四）IRMA和RIA的比较
◇放射性核纯度 ◇放射化学纯度 ◇放射性比活度 ◇生物活性和免疫活性 ◇标记位置和定量分布情况
第九章 其它标记免疫分析技术
（3）抗体的选用 ①抗体亲和性 ②抗体特异性 ③抗体的效价
第九章 其它标记免疫分析技术
①抗体亲和性
是抗体与抗原之间相互 作用的一种结合能力或 强度。亲和力的大小用 亲和常数Ka值来表示。
★免疫放射分析或免疫放射度量分析
（immunoradiometric assay, IRMA）
第九章 其它标记免疫分析技术
一、放射性核素标记物
（一）常用的放射性核素
放射性核素是指原子核能自发产生成分或能级的变 化，变成另一种核素，同时伴有射线发射的元素。 放射性核素根据其衰变方式分为α、β、γ三种， 用于放射标记的有β（14C、3H）、γ（131I和125I） 两种，分别用液体闪烁技术和γ计数器测定。 目前以125I应用最为广泛。
第九章 其它标记免疫分析技术
（二）抗原或抗体
用于标记的抗原纯度要高，有完整的 免疫活性，抗体的亲和常数要高，抗体滴 度高并且交叉反应率低。
第九章 其它标记免疫分析技术
（三）放射性核素标记物的制备
在RIA中，标记抗原质量的优劣，直接影 响测定结果，必须制备比放射性强、纯度高 的标记抗原，并保持免疫活性不受丧失。 常用的标记方法：
交叉反应是指抗体与抗原结构类似物的结合。
交叉反应率 = ED50（B）/ ED50（A）× 100%
第九章 其它标记免疫分析技术
③抗体的效价
抗体效价： ◇是抗体和抗原发生反应的抗体最高稀释度。 ◇是反映血清中有效抗体含量的相对参数。
第九章 其它标记免疫分析技术
二、放射免疫分析
（一）放射免疫分析原理 （二）实验方法 （三）方法学评价
第九章 其它标记免疫分析技术
（二）实验方法 ★抗原抗体反应
Ag* Ag
反应条件
体积 温度
平衡法
时间
非平衡法
pH
Ab
第九章 其它标记免疫分析技术
★免疫复合物（B）与游离标记物（F）的分离 双抗体法
化学沉淀法 PR 试剂法
吸附法 固相分离法
第九章 其它标记免疫分析技术
放射强度测定 数据处理
➢晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管以 及计数器 ➢测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分钟 计数(cpm)
◇ 直接标记法 ◇ 间接标记法
第九章 其它标记免疫分析技术
（四）放射性核素标记物的纯化与鉴定
（1）标记物的纯化 常用的纯化方法： △凝胶过滤法或薄层层析法 △离子交换法 △透析法 △电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳法） △高效液相色谱法。
第九章 其它标记免疫分析技术
（2）标记物的鉴定
标记化合物的Hale Waihona Puke Baidu量指标：
放射性免疫技术灵敏度高、特异性强，常用于 微量物质的定量测定。
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第二节 金标记免疫分析技术
人民卫生出版社
第九章 其它标记免疫分析技术
一、 胶体金的一般特性
免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物 应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。
胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白 磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合 成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一 种稳定的胶体状态，称为胶体金（colloidal gold）
第九章 其它标记免疫分析技术
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1 放射免疫分析技术 2 金标记免疫分析技术 3 发光免疫分析技术
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第九章 其它标记免疫分析技术
第一节 放射免疫技术
（radioimmunoassay）
放射免疫技术基本类型：
★经典的放射免疫分析
（radioimmunoassay，RIA）
第九章 其它标记免疫分析技术
（一）免疫放射分析原理
免疫放射分析的基本原理是非竞争性免疫结 合反应。
放射性核素标记于抗体上，用过量的标记抗 体*Ab与待测抗原Ag反应，待反应完成后，去除 剩余的游离标记抗体，则Ag-*Ab复合物的放射性 强度与待测抗原的量成正比关系，通过检测免疫 复合物的放射性，从而得到待测样本的浓度。
抗体Ka值越大，放射免 疫分析的灵敏度越高， 抗体Ka值达到10-9—— 10-12mol/L，才适合放射 免疫分析。
第九章 其它标记免疫分析技术
②抗体特异性
抗体特异性：指抗体分别与相应抗原和抗原结构 类似物的结合能力的比较。抗体与相应抗原结合 能力强，而与该抗原结构类似物(同类物、前体、 降解物和代谢物等)结合能力弱，则特异性高。
第九章 其它标记免疫分析技术
（一）放射免疫分析原理
➢竞争性结合反应的经 典标记抗原（Ag*）和 非标记抗原（Ag）与限 量抗体(Ab)竞争性结合 ➢Ag*和Ag具有等同的 与Ab结合能力
第九章 其它标记免疫分析技术
Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点，二者 通过竞争方式与Ab 结合；随着Ag增加， Ag*与Ab结合形成 Ag*Ab复合物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。
第九章 其它标记免疫分析技术
单位点IRMA 双位点IRMA
第九章 其它标记免疫分析技术
（二）实验方法 ◆抗原抗体反应 ◆免疫复合物与游离标记物的分离 ◆放射性强度测定和数据处理
第九章 其它标记免疫分析技术
（三）方法学评价
IRMA的灵敏度和特异性均比RIA更好，且操 作程序简单，但是应用的抗体量较大。
第九章 其它标记免疫分析技术
IRMA和RIA的比较
标记物质
IRMA
抗体
RIA
抗原
标记物用量
过量
限量
反应方式
直接结合
竞争结合
B、F分离方法 固相抗体法等 第二抗体法等
第九章 其它标记免疫分析技术
小结
放射免疫技术是以放射性核素为示踪剂的标记 免疫技术，分为放射免疫技术和免疫放射分析。
放射免疫分析是待测抗原和定量的标记抗原竞 争性结合限量的抗体，免疫放射分析是将放射性物 质标记在抗体上，免疫放射分析分为单位点和双位 点两种类型。
参数
cpm
计算
B/T (%) F/T (%)
B/F (%)
B/B0 (%)
注：T即是B与F的总和
拟合 标准曲线
第九章 其它标记免疫分析技术
（三）方法学评价
RIA进行体外检测微量物质，灵敏度高特 异性强，重复性好，但需注意放射性核素 对环境造成的污染。
第九章 其它标记免疫分析技术
三、免疫放射分析
（一）免疫放射分析原理 （二）实验方法 （三）方法学评价 （四）IRMA和RIA的比较
◇放射性核纯度 ◇放射化学纯度 ◇放射性比活度 ◇生物活性和免疫活性 ◇标记位置和定量分布情况
第九章 其它标记免疫分析技术
（3）抗体的选用 ①抗体亲和性 ②抗体特异性 ③抗体的效价
第九章 其它标记免疫分析技术
①抗体亲和性
是抗体与抗原之间相互 作用的一种结合能力或 强度。亲和力的大小用 亲和常数Ka值来表示。
★免疫放射分析或免疫放射度量分析
（immunoradiometric assay, IRMA）
第九章 其它标记免疫分析技术
一、放射性核素标记物
（一）常用的放射性核素
放射性核素是指原子核能自发产生成分或能级的变 化，变成另一种核素，同时伴有射线发射的元素。 放射性核素根据其衰变方式分为α、β、γ三种， 用于放射标记的有β（14C、3H）、γ（131I和125I） 两种，分别用液体闪烁技术和γ计数器测定。 目前以125I应用最为广泛。
第九章 其它标记免疫分析技术
（二）抗原或抗体
用于标记的抗原纯度要高，有完整的 免疫活性，抗体的亲和常数要高，抗体滴 度高并且交叉反应率低。
第九章 其它标记免疫分析技术
（三）放射性核素标记物的制备
在RIA中，标记抗原质量的优劣，直接影 响测定结果，必须制备比放射性强、纯度高 的标记抗原，并保持免疫活性不受丧失。 常用的标记方法：
交叉反应是指抗体与抗原结构类似物的结合。
交叉反应率 = ED50（B）/ ED50（A）× 100%
第九章 其它标记免疫分析技术
③抗体的效价
抗体效价： ◇是抗体和抗原发生反应的抗体最高稀释度。 ◇是反映血清中有效抗体含量的相对参数。
第九章 其它标记免疫分析技术
二、放射免疫分析
（一）放射免疫分析原理 （二）实验方法 （三）方法学评价
第九章 其它标记免疫分析技术
（二）实验方法 ★抗原抗体反应
Ag* Ag
反应条件
体积 温度
平衡法
时间
非平衡法
pH
Ab
第九章 其它标记免疫分析技术
★免疫复合物（B）与游离标记物（F）的分离 双抗体法
化学沉淀法 PR 试剂法
吸附法 固相分离法
第九章 其它标记免疫分析技术
放射强度测定 数据处理
➢晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管以 及计数器 ➢测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分钟 计数(cpm)
◇ 直接标记法 ◇ 间接标记法
第九章 其它标记免疫分析技术
（四）放射性核素标记物的纯化与鉴定
（1）标记物的纯化 常用的纯化方法： △凝胶过滤法或薄层层析法 △离子交换法 △透析法 △电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳法） △高效液相色谱法。
第九章 其它标记免疫分析技术
（2）标记物的鉴定
标记化合物的Hale Waihona Puke Baidu量指标：
放射性免疫技术灵敏度高、特异性强，常用于 微量物质的定量测定。
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第九章 其它标记免疫分析技术
第二节 金标记免疫分析技术
人民卫生出版社
第九章 其它标记免疫分析技术
一、 胶体金的一般特性
免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物 应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。
胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白 磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合 成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一 种稳定的胶体状态，称为胶体金（colloidal gold）