其它标记免疫分析技术
化学发光免疫标记分析技术基本原理
化学发光免疫标记分析技术基本原理化学发光免疫标记分析技术主要包括两个步骤：标记物制备和检测过程。
在标记物制备阶段，通常使用特定的荧光染料或荧光标记物来与待检测物质进行反应，并形成稳定的标记物-待检测物质复合物。
而在检测过程中，通过光学系统激发和采集标记物产生的化学发光信号，从而获得待检测物质的信息。
1.标记物制备：在化学发光免疫标记分析技术中，常用的标记物包括酶标记物和荧光标记物。
酶标记物的原理是将特定酶与待检测物质结合，并通过酶反应产生化学发光信号。
例如，常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
而荧光标记物的原理则是将特定荧光染料或荧光物质与待检测物质发生物理或化学反应，从而产生荧光信号。
荧光标记物具有高灵敏度、高分辨率和多颜色检测等优点。
2.检测过程：在化学发光免疫标记分析技术中，通常采用放射性同位素或者化学合成的光感受物质作为化学发光底物。
这些光感受物质在一定条件下与酶标记物或荧光标记物发生反应，产生化学发光信号。
这种化学发光反应通常是一种酶催化反应，通过酶的催化作用将底物转化为高能态的中间产物，进而使中间产物与发光底物反应产生化学发光。
1.样品制备：将待检测的样品进行适当处理和净化，以去除干扰物并保留待测物质。
2.标记物制备：选择适当的酶标记物或荧光标记物，并将其与待检测物质结合，形成稳定的复合物。
3.反应过程：将标记物与样品中的待测物质进行反应，形成标记物-待检测物质复合物。
4.分离与清洁：根据实验需求，通过特定的分离技术分离出标记物-待检测物质复合物，并清洁除去未结合的杂质。
5.光学系统激发和采集信号：将分离出的标记物-待检测物质复合物放置于化学发光仪或荧光显微镜等设备中，通过特定的光源激发标记物产生的化学发光或荧光信号，并通过相应的光学系统采集和记录信号。
6.数据分析和结果解读：通过对采集得到的化学发光或荧光信号进行数据处理和分析，根据标定曲线或标准样品，计算出待检测物质的含量或其它相关信息，并根据实验目的对结果进行解读。
比较几种免疫检测的异同
免疫学课后作业比较几种免疫标记技术的异同。
答：根据标记物种类的不同，免疫标记技术可以分为放射免疫分析、酶标记免疫分析、荧光标记免疫分析、化学发光标记免疫分析、胶体金标记免疫分析技术，它们之间具有相同点，也有不同之处，现将其归纳如下。
一、相同点主要包括以下几个方面：1、均具有高特异性。
五种免疫标记技术的免疫技术都是采用抗原抗体反应，而抗原与抗体的结合是一一对应、特异性结合的，故它们都具有非常高的特异性。
2、均具有高灵敏性。
由于五种免疫标记技术的标记技术均采用示踪物标记，例如酶、放色性核素、荧光素、胶体金以及致密物质等，当与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，只需测定复合物中的标记物，通过化学或物理的手段使不见的反应放大，转化为可见的、可测知的光、色、电、脉冲等信号，并可借助仪器精密测定，从而间接测出微量的抗原或抗体。
3、检测对象相同。
除了放射免疫技术只能检测抗原外，其他四种免疫标记技术均可检测抗原或者抗体，即通过已知抗原(或抗体)特异性结合待测抗体（或抗原），从而定性或定量地测出抗体或抗原。
4、免疫标记的程序基本相同。
其包括纯化抗原或抗体、确定标记物质（即决定了最终的检测方式）、进行标记、对标记产物分离纯化和分析鉴定等一系列程序。
二、不同点主要包括以下几个方面：1、检测原理不一样。
首先，酶免疫技术是以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原-抗体反应的特异性和酶催化底物反应高效性和专一性结合起来的一种免疫方法，其对作为标记用的酶具有特定的要求，如活性高、纯度高等；放射免疫标记技术是以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法；免疫荧光技术是以荧光素作为标记物与已知的抗体或抗原结合，然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和坚定未知的抗原，其对用于标记的荧光素也有特定的要求，如荧光效率高，与蛋白质结合稳定，易于保存等；发光免疫分析技术是将发光分析与免疫反应相结合而建立的一种新型超微量分析技术，它是使用发光剂标记抗体（或抗原），通过发光检测抗原（或抗体）反应的免疫分析方法；免疫胶体金标记技术则是以胶体金作为示踪标记物，而胶体金在碱性环境中带负电荷，与抗体蛋白质分子的正电荷基团因静电而形成牢固结合应用于抗原抗体反应的一种新型免疫检测方法。
临床常用标记免疫技术及特点
临床常用标记免疫技术及特点1.引言1.1 概述标记免疫技术是现代生物医学领域中常用的一种实验方法，其通过在生物样本中引入特定的标记物，来检测、定量或分析目标物质的存在和性质。
这些标记物可以是荧光染料、放射性同位素、酶或其他具有特异性的物质。
在临床医学中，标记免疫技术具有广泛的应用，可以用于诊断疾病、评估治疗效果、研究疾病机制等方面。
常用的标记免疫技术包括免疫荧光染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)等。
免疫荧光染色技术是一种利用特异性抗体与标记物结合后发出荧光信号的技术。
通过荧光显微镜观察样本中的荧光信号，可以定位、鉴定并定量分析目标物质。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高分辨率的特点。
酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种利用特异性抗体与酶结合后，通过酶催化反应来产生可定量的信号的技术。
ELISA技术可以用于检测血清中的免疫球蛋白、抗原、抗体等多种生物分子，并可定量测定其浓度。
ELISA 技术具有高灵敏度、高准确性和高通量的特点。
放射免疫测定(RIA)是一种利用放射性同位素标记分子，通过测量放射性同位素放出的射线来定量目标物质的技术。
RIA技术在测定极低浓度物质或微量物质时具有非常高的敏感性和特异性。
然而由于放射性同位素标记物的安全性和环境污染问题，RIA技术在临床实验室中的应用受到了限制。
总之，标记免疫技术在临床医学中具有重要的应用价值，可以帮助医生准确、快速地诊断疾病，评估治疗效果，深入研究疾病的发生机制。
随着科学技术的不断进步，标记免疫技术也在不断发展，将为临床医学带来更多的突破和进展。
1.2文章结构文章结构部分：本篇文章主要介绍临床常用标记免疫技术及其特点。
文章结构如下：第一部分为引言，包括概述、文章结构和目的。
在概述中，将介绍免疫技术在临床应用中的重要性和广泛应用的背景。
在文章结构部分，将详细说明本篇文章的章节分布和内容安排。
在目的部分，将说明本文的目的和意义，为读者明确文章的目标。
常用的免疫标记技术
常用的免疫标记技术免疫标记技术是一种用于检测和分析生物分子的方法，其中利用特定的抗体或其他免疫物质标记目标分子，从而使这些分子能够被观察和测量。
以下是一些常用的免疫标记技术：1.免疫荧光技术（Immunofluorescence）：在这种技术中，用于检测目标分子的抗体被标记上荧光染料。
通过荧光显微镜观察样本，可以定位和定量目标分子的位置和数量。
2.免疫酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：这是一种广泛用于检测抗体或抗原的技术。
ELISA 利用酶标记的抗体或抗原与目标分子结合，然后通过酶的底物反应来产生可测量的信号。
3.免疫印迹技术（Western Blot）：Western Blot用于检测蛋白质。
蛋白质被电泳分离，然后通过免疫印迹将其转移到膜上。
接着使用特定抗体标记的酶或荧光物质来检测目标蛋白质。
4.免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）：IHC用于在组织切片中检测特定抗原的存在。
切片上的抗原与标记有酶、荧光染料或其他标记的抗体结合，通过显微镜观察抗原的分布。
5.流式细胞仪技术（Flow Cytometry）：该技术通过激光照射细胞，测量细胞表面或内部的荧光标记物，以分析细胞的类型、状态和功能。
6.蛋白质质谱法（Mass Spectrometry）：将样品中的蛋白质离子化，并通过质谱仪测量质量。
免疫质谱结合了免疫标记和质谱技术，可用于检测和鉴定蛋白质。
7.免疫电镜技术（Immunoelectron Microscopy）：在电子显微镜下观察样本，通过标记的抗体来可视化细胞或亚细胞结构中的特定蛋白质。
8.免疫磁珠技术（Immunomagnetic Bead Assay）：使用带有磁珠的抗体，通过磁场将目标分子分离出来。
常用于细胞分离和分析。
这些免疫标记技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域发挥着关键作用，可以用于检测和定量各种生物分子，如蛋白质、抗体、核酸等。
标记免疫分析技术的发展及时间分辨荧光免疫技术的临床应用
免疫分析方法
步骤：
A 将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙 烯小珠），经温育后清洗； B 加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则 与吸附的抗原结合，温育后清洗； C 加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附 的抗原抗体复合物结合，温育后清洗； D 加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用 光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。
1.2 免疫电泳
免疫电泳是一种将区带电泳和
双向免疫扩散相结合的免疫化
学分析技术。
实验原理
先将抗原样品在琼脂平板 上进行电泳，使其中的各 种成分因电泳迁移率的不 同而被分离成肉眼不可见 的区带。 停止电泳后，在与电泳方 向平行的槽内加入相应抗 血清，使抗原和抗体呈双 向扩散，已分离的各抗原 与相应抗体在琼脂中扩散 而相遇，在二者比例合适 处形成肉眼可见的沉淀弧。
（三）竞争法
酶联免疫吸附法ELISA
ELISA的基本原理和方法
ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例
基本原理
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）
基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反 应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
B 加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与 吸附的抗体结合，温育后清洗； C 加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；
D 加入酶作用底物，产生显色反应，颜色 的改变与所加的待检标本溶液中的抗原 量成正比。
（二）间接法
间接法是检测抗体 最常用的方法，其 原理为利用酶标记 的抗抗体以检测已 与固相结合的受检 抗体，故称为间接 法。
标记免疫分析的临床应用
标记免疫分析的临床应用标记免疫分析（immunoassay）是一种重要的生物化学分析技术，被广泛应用于临床医学领域。
该技术基于抗原与抗体相互作用的原理，通过标记分子（通常是放射性同位素、荧光物质或酶）来检测目标物质的定性和定量。
本文将介绍标记免疫分析在临床应用中的重要性和应用领域。
一、概述标记免疫分析广泛应用于临床实验室，患者个体化治疗以及疾病筛查等方面。
它在医学诊断中具有快速、灵敏、高特异性、易操作以及适用于大规模筛查等特点，成为了不可或缺的分析工具。
二、肿瘤标志物的检测标记免疫分析在肿瘤标志物的检测中具有重要作用。
肿瘤标志物是指与肿瘤发生有关的具有特异性的生物分子，如PSA（前列腺特异性抗原）、CEA（癌胚抗原）等。
通过标记免疫分析，可以对患者体内的肿瘤标志物进行定量检测，帮助医生进行肿瘤的早期筛查和疾病监测。
三、临床药物浓度监测标记免疫分析可用于监测患者体内药物的浓度。
对于一些药物治疗密切相关的疾病，如抗癫痫药物、抗凝血药物等，通过监测药物的浓度，可以及时调整药物剂量，以达到最佳的治疗效果。
同时，通过标记免疫分析还可以评估患者对药物的反应情况，从而指导治疗方案的制定。
四、感染疾病的诊断标记免疫分析可以用于感染疾病的诊断。
患者体内的病原微生物、细菌、病毒等可通过标记免疫分析方法进行检测。
例如，HIV感染的诊断，采用标记免疫分析方法检测患者血液中的HIV抗体，可以对感染情况进行判定。
此外，标记免疫分析还可用于肠道感染诊断、呼吸道感染等，为临床医生提供指导治疗方案的依据。
五、自身免疫性疾病的诊断在自身免疫性疾病的诊断中，标记免疫分析也扮演着重要角色。
自身免疫性疾病包括风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺疾病等。
通过检测自身抗体的水平，可以对患者的免疫状态做出评估，并进行疾病的诊断和指导治疗。
六、选择合适的标记物在标记免疫分析中，选择合适的标记物非常重要。
标记物的选择要满足灵敏度高、特异性强、稳定性好等要求。
7-2免疫学技术 标记免疫分析技术 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术
标记免疫分析技术根据标记物不同分为： 免疫荧光技术 放射免疫测定技术 免疫酶技术 免疫电镜技术 胶体金标记分析技术 发光免疫分析技术 以及由此延伸的其它各种免疫检测方法
用途：对样品进行定性、定位及定量分析。
1、荧光抗体的制备
2、抗原标本的制备
3、抗原与荧光抗 体反应
4、荧光显微镜观察
细胞
含义：
先用酶标记抗体（或抗原）与被检样中的相 应抗原（或抗体）结合后，可形成抗原-抗体-酶 复合物，在相应底物作用下，产生可溶或不溶有 色反应产物，此产物颜色深浅与标本中的抗原 （或抗体）的结合量成正比。
免疫酶技术的种类
免疫酶技术按照抗原抗体系统是定位于组织细胞上还是存在 于液体样品中分为:
免疫酶组织抗原定位法（免疫酶定位技术，免疫酶组织化学技术）
凝集抑制试验 乳等颗粒和各种凝集 +++
协同凝集试验 现象
+++
抗球蛋白试验
+++
补体参与反应 补体溶血试验 以裸眼或光电比色仪 ++ 补体结合试验 观察测定溶血现象 +++
中和反应 病毒中和试验 病毒感染性丧失 + 毒素中和试验 外毒素毒性丢失 ++
免疫标记技术 荧光免疫技术 检测荧光现象
++++
125I是最常用的标记物
- 表达式： *
*
*
结合的Ag*；
游离Ag*
待测Ag 标记Ag
+
+
Ab
B
F
游离的标记Ag
B
F
结合的标记Ag
结合率（B/F)的计算
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交叉反应率 = ED50（B）/ ED50（A）× 100%
第九章 其它标记免疫分析技术
③抗体的效价
抗体效价： ◇是抗体和抗原发生反应的抗体最高稀释度。 ◇是反映血清中有效抗体含量的相对参数。
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二、放射免疫分析
（一）放射免疫分析原理 （二）实验方法 （三）方法学评价
◇放射性核纯度 ◇放射化学纯度 ◇放射性比活度 ◇生物活性和免疫活性 ◇标记位置和定量分布情况
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（3）抗体的选用 ①抗体亲和性 ②抗体特异性 ③抗体的效价
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①抗体亲和性
是抗体与抗原之间相互 作用的一种结合能力或 强度。亲和力的大小用 亲和常数Ka值来表示。
◇ 直接标记法 ◇ 间接标记法
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（四）放射性核素标记物的纯化与鉴定
（1）标记物的纯化 常用的纯化方法： △凝胶过滤法或薄层层析法 △离子交换法 △透析法 △电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳法） △高效液相色谱法。
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（2）标记物的鉴定
标记化合物的质量指标：
第九章 其它标记免疫分析技术
（一）免疫放射分析原理
免疫放射分析的基本原理是非竞争性免疫结 合反应。
放射性核素标记于抗体上，用过量的标记抗 体*Ab与待测抗原Ag反应，待反应完成后，去除 剩余的游离标记抗体，则Ag-*Ab复合物的放射性 强度与待测抗原的量成正比关系，通过检测免疫 复合物的放射性，从而得到待测样本的浓度。
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单位点IRMA 双位点IRMA
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（二）实验方法 ◆抗原抗体反应 ◆免疫复合物与游离标记物的分离 ◆放射性强度测定和数据处理
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（三）方法学评价
IRMA的灵敏度和特异性均比RIA更好，且操 作程序简单，但是应用的抗体量较大。
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（二）抗原或抗体
用于标记的抗原纯度要高，有完整的 免疫活性，抗体的亲和常数要高，抗体滴 度高并且交叉反应率低。
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（三）放射性核素标记物的制备
在RIA中，标记抗原质量的优劣，直接影 响测定结果，必须制备比放射性强、纯度高 的标记抗原，并保持免疫活性不受丧失。 常用的标记方法：
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（一）放射免疫分析原理
➢竞争性结合反应的经 典标记抗原（Ag*）和 非标记抗原（Ag）与限 量抗体(Ab)竞争性结合 ➢Ag*和Ag具有等同的 与Ab结合能力
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Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点，二者 通过竞争方式与Ab 结合；随着Ag增加， Ag*与Ab结合形成 Ag*Ab复合物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。
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（二）实验方法 ★抗原抗体反应
Ag* Ag
反应条件
体积 温度
平衡法
时间
非平衡法
pH
Ab
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★免疫复合物（B）与游离标记物（F）的分离 双抗体法
化学沉淀法 PR 试剂法
吸附法 固相分离法
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放射强度测定 数据处理
➢晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管以 及计数器 ➢测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分钟 计数(cpm)
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IRMA和RIA的比较
标记物质
IRMA
抗体
RIA
抗原
标记物用量
过量
限量
反应方式
直接结合
竞争结合
B、F分离方法 固相抗体法等 第二抗体法等
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小结
放射免疫技术是以放射性核素为示踪剂的标记 免疫技术，分为放射免疫技术和免疫放射分析。
放射免疫分析是待测抗原和定量的标记抗原竞 争性结合限量的抗体，免疫放射分析是将放射性物 质标记在抗体上，免疫放射分析分为单位点和双位 点两种类型。
参数
cpm
计算
B/T (%) F/T (%)
B/F (%)
B/B0 (%)
注：T即是B与F的总和
拟合 标准曲线
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（三）方法学评价
RIA进行体外检测微量物质，灵敏度高特 异性强，重复性好，但需注意放射性核素 对环境造成的污染。
第九章 其它标记免疫分析技术
三、免疫放射分析
（一）免疫放射分析原理 （二）实验方法 （三）方法学评价 （四）IRMA和RIA的比较
★免疫放射分析或免疫放射度量分析
（immunoradiometric assay, IRMA）
第九章 其它标记免疫分析技术
一、放射性核素标记物
（一）常用的放射性核素
放射性核素是指原子核能自发产生成分或能级的变 化，变成另一种核素，同时伴有射线发射的元素。 放射性核素根据其衰变方式分为α、β、γ三种， 用于放射标记的有β（14C、3H）、γ（131I和125I） 两种，分别用液体闪烁技术和γ计数器测定。 目前以125I应用最为广泛。
抗体Ka值越大，放射免 疫分析的灵敏度越高， 抗体Ka值达到10-9—— 10-12mol/L，才适合放射 免疫分析。
第九章 其它标记免疫分析技术
②抗体特异性
抗体特异性：指抗体分别与相应抗原和抗原结构 类似物的结合能力的比较。抗体与相应抗原结合 能力强，而与该抗原结构类似物(同类物、前体、 降解物和代谢物等)结合能力弱，则特异性高。
放射性免疫技术灵敏度高、特异性强，常用于 微量物质的定量测定。
返回章目录
第九章 其它标记免疫分析技术
第二节 金标记免疫分析技术
人民卫生出版社
第九章 其它标记免疫分析技术
一、 胶体金的一般特性
免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物 应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。
胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白 磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合 成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一 种稳定的胶体状态，称为胶体金（colloidal gold）
第九章 其它标记免疫分析技术
第九章 其它标记免疫分析技术
第九章 其它标记免疫分析技术
目录
1 放射免疫分析技术 2 金标记免疫分析技术 3 发光免疫分析技术
返回总目录
பைடு நூலகம்
第九章 其它标记免疫分析技术
第一节 放射免疫技术
（radioimmunoassay）
放射免疫技术基本类型：
★经典的放射免疫分析
（radioimmunoassay，RIA）