植物根系分泌物的研究方法_李汛

基因组学与应用生物学，2013年，第32卷，第4期，第540－547页Genomics and Applied Biology,2013,Vol.32,No.4,540－547评述与展望Review and Progress植物根系分泌物的研究方法李汛段增强*中国科学院南京土壤研究所,土壤与农业可持续发展国家重点实验室,南京,210008*通讯作者,zqduan@摘要根系分泌物是植物根系释放到根际环境中的有机物质的总称，对土壤结构形成、土壤养分转化、植物养分吸收、土壤微生物分布、环境胁迫缓解等方面都具有重要作用。

但是，由于土壤中微生物对根系分泌物的降解以及根系分泌物本身含量低、成分复杂，根系分泌物的研究方法一直是植物营养学与土壤科学的研究热点和难点。

近年来，一些新的实验技术和研究方法被应用到对植物根系分泌物的研究中。

本文对目前在根系分泌物研究中应用较多的以及新发展起来的各种收集、分离和鉴定方法进行了综述，希望有助于相关研究者在针对不同的研究对象和目的时选择出可行、合适、高效的根系分泌物研究方法和技术。

关键词根系分泌物,收集,分离纯化,鉴定Progress on the Research Methods for Root ExudatesLi Xun Duan Zengqiang *State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture,Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Nanjing,210008*Corresponding author,zqduan@ DOI:10.3969/gab.032.000540Abstract Root exudate is a general term for a group of organic compounds released from the plant roots to rhizo-sphere,and plays an important role in formation of soil structure,transformation of soil nutrients,absorption of nu-trients by plants,distribution of soil microbe,alleviation the environmental stress,and so on.Furthermore,owing tothe degradation by the soil microbe as well as the low concentration and complex composition nature of itself,root exudate and its research methods are always the hot spots and challenges.Recently,several novel experimental tech-niques and research methods have been developed and applied in the research on root exudates.In this paper,the collection,separation,purification and identification of root exudates are reviewed,which will be helpful to re-searchers to choose a feasible,suitable and efficient method to their certain object and purpose.Keywords Root exudates,Collection,Separation and purification,Identification 基金项目：本研究由国家自然科学基金(41101272)和土壤与农业可持续发展国家重点实验室优秀青年人才项目共同资助对根系分泌物的研究起源于18世纪末，1795年Plenk 等发现列当类植物只有在寄主根存在时才能萌发，因此推测植物可以通过根系向外分泌一些物质；1888年Halsted 观察到细菌围绕苜蓿的根尖部分繁衍，于是提出了这是受到了根尖细胞分泌底物的刺激(Curl and Truelove,1986)。

20世纪中期以来的研究表明，在植物生长过程中，根系在从生长介质中摄取养分和水分的同时也向生长介质中溢泌或分泌大量的有机物质，即为根系分泌物(张福锁,1992)。

根系分泌物对土壤结构形成、土壤养分转化、植物养分吸收、土壤微生物分布、环境污染修复等方面具有重要的作用，因此对其研究也始终是土壤形成、植物营养、土传病害、土壤微生物、土壤环境等多个领域的热门话题。

但是，根系分泌物作为土壤微生物可直接利用的底物，在土壤中会迅速被微生物降解，再加上根系分泌物本身含量较低、组分复杂，使得其组成和含量随土壤类型和根际环境的变化差异很大，因此直接研究根系分泌物困难很大，这也迫切需要根系分泌物研究方法的革新。

目前已报道的研究工作中，缺乏统一、有效、权威的根系分泌物收集、分离纯化和鉴定方法，制约着该领域的进一步发展。

本文对目前在根系分泌物研究中应用较多的以及新发展起来的各种收集、分离基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology和鉴定方法进行了综述，希望有助于相关研究者在针对不同的研究对象和目的时选择出可行、合适、高效的根系分泌物研究方法和技术。

1根系分泌物的收集方法目前已报道的收集根系分泌物的方法按不同的分类方法有多种划分(Neumann et al.,2009)。

以培养植物的方式不同，可分为水培收集、基质培收集和土培收集；以体系是否灭菌，可分为敞开体系收集和密闭无菌体系收集；以收集是否在原位条件下，又可分为扰动根系收集和原位根系收集。

在这些方法中，在密闭无菌条件下收集到的根系分泌物能较为准确的反映其中有机物质的总量；在土培条件原位收集法获得的根系分泌物则能较为真实的反映根系分泌物的实际情况。

所以，根据不同的实验目的，研究者可采取相应适宜的收集方法(刘芷宇等,1997)。

1.1水培收集法水培收集法是最常用的根系分泌物收集法。

该方法是将植物进行营养液培养，在特定时期将植物取出，用蒸馏水清洗去表面粘附物和养分离子，放入清水或含有微生物抑制剂的营养液中培养一段时间后，将培养液过滤，通过树脂富集除去养分离子后，即为根系分泌物(Diez and Dusenbery,1989;Shen et al.,2002)。

水培收集法不需要特殊的收集装置，操作简便，在一定程度上能反映植物中某些特定根系分泌物的变化。

但是水培收集法无法做到严格无菌的环境，虽然微生物抑制剂可较好的抑制微生物的活性，但该类物质可能会对植物生理产生不良影响，所以一般只能采用尽量接近无菌的条件并尽可能缩短收集时间。

另外，水培植物一般根毛发育较少，没有机械阻力，与真实的土培条件下生长的通气情况、养分分布、根系分支结构有较大的区别，所以该方法只能代表植物在水培条件下的分泌情况。

1.2基质培收集法基质培收集法常用的基质有石英砂、玻璃珠和琼脂等。

石英砂或玻璃珠培养方法是将植物培养在营养液中，用石英砂或玻璃珠固定其根系，培养一段时间后将基质取出，用蒸馏水洗涤除去养分离子，再用有机溶剂浸泡提取基质表面的有机物，最后将提取液过滤浓缩即得根系分泌物(Yoshitomi and Shann,2001;B-oeuf-Tremblay et al.,1995)。

由于石英砂或玻璃珠的主要成分是二氧化硅，惰性较强，不影响植物的正常生长，并且植物根系的通气状况较好，还有一定的机械阻力，这些都使得植物根系的生长较水培法更接近土壤培养的实际情况。

但是，在培养过程中，石英砂或玻璃珠培养也难以做到无菌条件，使得砂或玻璃表面容易生长青苔，干扰对植物根系分泌物的鉴定。

琼脂培养是研究植物根际环境的常用方法。

一般是将植株幼苗生长在琼脂介质中，待植物生长到一定时期，将其根系周围的琼脂加热溶解，使之与植物根系分离，过滤后的滤液即为根系分泌物(Hoffland et al., 1989;Wu et al.,2001)。

琼脂培养法收集根系分泌物也较为简单，但一般只适用于培养小型植物的苗期实验，并且也要防止琼脂被微生物污染。

1.3土培收集法土培收集法是在土培的植物生长一段时间后，将其根系取出，用蒸馏水洗下根际土壤，振荡后离心或过滤，即得到根系分泌物。

或者是将生长到一定阶段的植物从土壤中取出，将其根系表面土层冲洗干净，再用蒸馏水淋洗根系，淋洗液作为根系分泌物。

土壤培养是最常见的植物培养方式，植物根系生长最接近于自然条件下的状况，由于土壤颗粒的机械阻力，根系分泌物的量要比水培收集的量更多，且得到的根系分泌物与植物自然生长条件下的实际分泌情况更加接近。

但是土壤中微生物种类、数量繁多，会迅速将植物根系分泌物分解利用。

另外，在植物根系与土壤剥离时，根系极易受到损伤，收集的溶液中就会包含很多根系本身的内含物和伤流液。

对此，有研究者将植物种植于根箱中，用尼龙网将根箱分成三室，中间种植物，两边装土。

将离子膜、纤维素薄膜或者层析滤纸剪成根生长的形状，覆盖在根系的表面，关闭根箱。

植物生长一段时间后，打开根箱，小心除去根表土壤，将附着在根系表面的树脂膜或滤纸片取出，用浸提液多次浸洗，所得溶液即为所收集到的根系分泌物(申建波,1998)。

这种收集方法操作方便，可以反映植物根系各个部位的分泌状况。

但打开根箱除去根际土还是扰动了根系的生长，并且这种方法一般只适用于小型植物或苗期植物。

1.4其它方法上述的几种方法是最常用的根系分泌物收集方法，根据研究目的和研究对象的不同，一些研究者自行设计了特殊的装置来收集根系分泌物。

连续根系分泌物收集系统是将植物培养在连接有根系分泌物收集器的容器中，培养液在向下渗透过541植物根系分泌物的研究方法Progress on the Research Methods for Root Exudates程中将根系分泌物淋洗下来，在经过根系分泌物收集器时有机物被富集，而含有无机离子的培养液则循环回到培养容器中(Tang and Young,1982)。

根系分泌物收集器中一般使用大孔吸附树脂富集根系分泌物，该树脂可通过范德华力从水溶液中吸附有机物，实现有机物的富集和分离。

收集完成后，用合适的洗脱剂可将根系分泌物从树脂上洗脱下来。